Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimindeki aktif bölge halkasının ve kofaktör bağlanma bölgesinin diğer apikompleksan laktat dehidrogenaz enzimleri ile karşılaştırmalı analizi

Sıtma, dünya populasyonunun neredeyse yarısını tehdit eden parazitik bir hastalıktır. Hastalığa, aynı zamanda Toxoplasma, Eimeria, Theileria, Cryptosporidium ve Babesia gibi diğer bazı patojenleri içeren Apikompleksa şubesine ait Plasmodium cinsinin üyeleri sebep olmaktadır.Birçok endemik bölgede sıtmaya karşı gittikçe artan ilaç direncinin ortaya çıkması yeni antimalarial ilaçların geliştirilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır. Plasmodium'un metabolik yollarının araştırılması parazitin glikolitik yolunda kullanılan laktat dehidrogenaz enzimini işaret etmektedir. Önceki çalışmalarımızda Plasmodium'un iki farklı türünün laktat dehidrogenaz geni klonlanmış, protein ifade edilmiş ve enzim yapısı çözülmüştür. Enziminin yapısal ve kinetik olarak değerlendirilmesi, insandaki eşdeğerine göre belirgin bir şekilde farklı özelliklere sahip olduğunu göstermiştir ve enzim aktivitesinin engellenmesiyle eritrositlerde parazitin öldüğü rapor edilmiştir. Bu çalışmada, Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enziminin yapıya dayalı ilaç tasarım çalışmaları için potansiyel bir hedef olarak belirlenen aktif bölge halkası ve kofaktör bağlanma bölgesi Toxoplasma gondii, Eimeria tenella ve Theileria parva'daki enzimlerin aynı bölgelerine benzetilerek analiz edilmiştir.Bütün aminoasit değişimleri yönlendirilmiş mutagenez ile yapılmıştır. Mutant genlerin ekspresyon vektörü pKK233-3'e klonlanması standart metotlarla sağlanmıştır. Bütün mutant proteinlerin E. coli'de ekspresyonu yapılmış ve protein ekspresyonu Western blot ile doğrulanmıştır. Ekspresyonu yapılan mutant proteinler daha sonra Ni-NTA agaroz kullanılarak saflaştırılmış ve herbir mutant proteinin yapılan Steady-State kinetik analizleri yabanıl tip Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enziminin analiz sonuçlarıyla karşılaştırılmıştır.Plasmodium vivax'ın aktif bölge halkası, Toxoplasma gondii ve Eimeria tenella laktat dehidrogenaz enzimlerindeki aynı bölgelere benzetildiği zaman, aminoasit değişimi ile enzimatik aktivitenin kaybolmadığı, fakat enzimin substratına ilgisinin azaldığı ve katalitik hızının düştüğü gözlenmiştir. Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimini Theileria parva laktat dehidrogenaz enzimine benzetmek için yapılan aminoasit değişimi enzimin substratına ilgisinde hiçbir değişikliğe neden olmamıştır; ancak katalitik aktivite hızı artmıştır. Bu sonuçlar, yeni antiparazitik ilaç geliştirilmesinde Apikompleksan laktatdehidrogenazlar boyunca aktif bölge halkasının can alıcı ve ideal bir bölge olduğunu göstermiştir. Çalışmanın ikinci kısmında, 163. pozisyondaki lösin aminoasidi methionin aminoasidi ile değiştirilerek Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enziminin kofaktör bağlanma bölgesi diğer Apikompleksan laktat dehidrogenaz enzimlerindeki eşdeğerleri ile karşılaştırılmıştır. Lösin163Methionin değişimi yaptıktan sonra enzim aktivitesi korunmuş olmakla birlikte enzimin subtrat affinitesi ve katalitik hızı belirgin bir şekilde azalmıştır. Lösin aminoasidi aynı pozisyonda bir serin ile değiştirildiği zaman enzim aktivitesini kaybetmiştir.Bütün bu sonuçlar aktif bölge halkasının yanısıra Apikompleksanların laktat dehidrogenazlarındaki kofaktör bağlanma bölgesinin de yapıya dayalı ilaç tasarım çalışmaları için ideal bir hedef olabileceğini göstermiştir.