Ponatinib ve VS-5584 terapötik ajanlarının kronik miyeloid lösemi lökomogenezine etkileri

Kronik miyeloid lösemi (KML), sürekli tirozin kinaz aktivitesi sergileyen BCR-ABL1 füzyon proteinine sahip hücrelerle karakterize miyeloproliferatif bir hastalıktır. Bu nedenle hastalığın tedavisinde tirozin kinaz inhibitörleri kullanılmaktadır. Ponatinib, T315I dahil olmak üzere birçok BCR-ABL1 otofosforilasyonunu inhibe edebilen ATP-yarışmalı tirozin kinaz inhibitörüdür. Lösemi kök hücreleri, normal hematopoietik kök hücrelerle benzer özelliklere sahip malignant hücrelerdir. Tirozin kinaz inhibitörleri, primitif lösemi kök hücreleri üzerinde etkili olmadıkları için tedavinin etkinliği düşük olabilmektedir. Ayrıca, ciddi yan etkilerin önlenmesi için kullanılan düşük tirozin kinaz inhibitörü dozları, KML hücrelerinde aktif halde bulunan alternatif sağkalım yolaklarının baskılanmasını sağlayamamaktadır. Tirozin kinaz inhibitörü tedavisinin başarısının düşük olduğu KML olgularında ponatinibin tek ilaç olarak kullanımından ziyade çoklu hedefli tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine ihtiyaç olduğu açıktır. KML'de aktif olduğu bilinen PI3K/Akt/mTOR yolağının inhibitörlerinden VS-5584, tercihen kanser kök hücrelerini öldüren, potent, seçici bir dual inhibitördür. Bu tez çalışmasında KML tedavisindeki eksikliklerin üstesinden gelebilecek in vitro kombinasyon terapisinin belirlenebilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla VS-5584 ile ponatinibin kombinasyonlarıyla BCR-ABL1 ve PI3K/Akt/mTOR yolaklarının eş zamanlı inhibe edilmesinin KML ve lösemi kök hücrelerinin eliminasyonundaki etkisi ve rolü moleküler düzeyde araştırılmıştır. KML hücre modeli K562, lösemi kök hücre modeli LSC ve normal hematopoietik kök hücre modeli HSC hücre hatlarında, VS-5584'ün, ponatinibin ve kombinasyonlarının sitotoksik etkileri WST-8 testi ile belirlendi. Kombinasyon indeksleri CalcuSyn izobologram analiziyle değerlendirildi. Belirlenen IC50, IC75, ED50 ve ED75 dozlarının apoptotik etkileri Anneksin V ve aktif kaspaz-3 analizleri ile hücre döngüsüne etkileri PI analizi ile akım sitometride ve siklin D1, p27 antikorlarıyla western blotma ile değerlendirildi. PI3K/Akt/mTOR yolağındaki proteinlerin aktivitelerindeki değişimler, antikor array ile fosforile protein seviyelerinin kantitasyonu yapılarak, ölçüldü. Transkripsiyon faktörlerinin aktivelerindeki değişimler uygun vektörlerin transfeksiyonu sonrasında dual lusiferaz aktivitesi ile kantite edildi. Aktivitesi değişen transkripsiyon faktörlerinin hedef genlerinin mRNA seviyelerindeki değişimleri saptamak için qRT-PCR gerçekleştirildi. Ponatinib ve VS-5584'ün K562 ve LSC hücrelerinde doza ve zamana bağlı artan sitotoksik etkiye sahip olduğu saptandı. Ponatinibden farklı olarak, VS-5584'ün sağlıklı HSC hücre hattında belirgin şekilde daha az sitotoksik olduğu gösterildi. Kombinasyon dozlarından ED50 additif, ED75 ve ED90 sinerjistik etkili olarak belirlendi. Ponatinibin indüklediği apoptoza ek olarak, VS-5584'ün hücre döngüsünde belirgin G0/G1 duraklamasına neden olduğu gösterildi. Özellikle LSC hücre hattında, ponatinib Akt yolağını baskılamada yetersiz kalırken, ponatinibin VS-5584 ile kombinasyonunun başta S6, S6K, BAD olmak üzere birçok proteinin fosforilasyonu inhibe ederek PI3K/Akt/mTOR yolağını baskıladığı belirlendi. Elk-1/SRF, AP-1 ve NFkB transkripsiyon faktörlerinin lösemi hücre ve lösemi kök hücre modellerinde belirgin şekilde yüksek aktivite sergiledikleri saptandı. Kombinasyon uygulaması sonrasında K562 ve LSC hücrelerinde, seçici bir müdahale noktası olabilecek bu transkripsiyon faktörlerine ek olarak Myc/Max, CREB, STAT3 ve E2F/DP1 transkripsiyon faktörlerinin aktivitelerinde de baskılanma gözlendi. K562 hücrelerinde C/EBP ve FOXO1 transkripsiyon faktörlerinin, LSC hücrelerinde ise C/EBP ve p53 transkripsiyon faktörlerinin aktivitelerinde kombinasyon uygulamasını takiben artış olduğu gösterildi. Ekspresyonları bu transkripsiyon faktörleri tarafından kontrol edilen birçok genin mRNA seviyelerinde değişiklik meydana geldiği belirlendi. Sonuçlar, ponatinib ve VS-5584 ile sağkalım yolaklarında görevli transkripsiyon faktörlerinin regülasyonlarının anti-proliferatif ve apoptotik süreçlere katkı sağladığını gösterdi. Ponatinib ile VS-5584'ün kombinasyonunun, KML blastlarının ve kök hücrelerinin kontrolsüz proliferasyonunu selektif olarak önleyebilecek ve ponatinibin bilinen ciddi yan etkilerini azaltabilecek umut verici bir tedavi stratejisi olabileceğini düşünmekteyiz. Anahtar Kelimeler: Kronik Miyeloid Lösemi; PI3K/Akt/mTOR yolağı; Ponatinib