Probiyotikler ile ilişkili bazı kısa zincirli yağ asitlerinin solunum yolu epiteli bariyer işlevi üzerine etkisinin araştırılması

Mukoza ve deri epiteli bariyer işlev bozukluğu birçok hastalığın patogenezinde rol almaktadır. Sıkı bağlantı yapısı epitel bariyer işlevinin oluşturulmasında ana unsurdur. Probiyotik bakteriler suşa ve doza bağımlı olarak, farklı doku epitellerinin bariyer işlevini güçlendirici etki göstermektedir ve ürettikleri kısa zincirli yağ asitlerinin (KZYA) bağırsak epitel bariyer işlevini güçlendirdiği bilinmektedir. Buna karşın KZYA'ların solunum yolu epiteli bariyer işlevi üzerine etkisi üzerinde kısıtlı çalışmalar bulunmaktadır. Bu çalışmanın amacı bazı KZYA'ların solunum yolu epiteli bariyer işlevi üzerine etkisinin araştırılmasıdır. Bu çalışmada ilk olarak Bifidobacterium longum subsp. longum 35624 ve Akkermancia muciniphila kültürü yapılmış ve ürettikleri KZYA'lar yüksek basınçlı sıvı kromotografi (YBSK) ile belirlenmiştir. Ticari olarak temin edilen kizinostatın (quisinostat, JNJ-26481585) ve birer KZYA olan bütirat ve valeratın, bağırsak epiteli bariyer işlevi üzerine etkisi farklılaşmış ve farklılaşmamış Caco-2 hücreleri kullanılarak sıvı-sıvı arayüzlü kültür yöntemi ile araştırılmıştır. Kizinostatın 5, 10, 50 ve 100nM, bütiratın 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4 ve 8 mM ve valeratın 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2 ve 4 mM'lik konsantrasyonları farklılaşmış ve farklılaşmamış Caco-2 hücre kültürlerine eklenmiştir. Caco-2 epitel bariyer işlevi transepitelyal rezistans (TER) ölçümü ile değerlendirilmiştir. Hücre kültürü kontrolü için sadece hücre kültürü sıvısı eklenmiştir. Sitotoksisite kontrolü için 1/105 oranında dimetilsülfoksit kullanılmıştır Valeratın solunum yolu epitel bariyer işlevine etkisi farklılaşmış ve farklılaşmamış sağlıklı insan primer bronşiyal epitel hücresi (SİBEH) ve farklılaşmamış astımlı insan primer bronşiyal epitel hücre (AİBEH) kültürlerinde araştırılmıştır. Farklılaşmış SİBEH epitel bariyer işlevine valeratın etkisi apikal bölmeden, 0.03, 0.125, 0.5 ve 2 mM konsantrasyonlarda tek başına veya 50ng/ml IL-13 ile birlikte eklenerek araştırıldı. Bu hücrelerde pozitif kontrol olarak epitel bariyer işlevi güçlendirici olan kizinostat (100nM, apikal), negatif kontrol olarak epitel bariyer işlev bozucu olan IL-13 (50ng/ml, bazal) kullanıldı. Ayrıca bu iki kontrol hücre kültürüne birlikte eklenerek etkileri araştırıldı. Farklılaşmamış SİBEH epitel bariyer işlevine valeratın etkisi, bazal bölmeden 1nM, 10nM, 100nM, 1uM, 10uM ve 100uM'lık konsantrasyonlarda tek başına veya 10ng/ml IL-13 ile birlikte eklenerek araştırıldı. Bu hücrelerle yapılan deneylerde pozitif kontrol olarak bazal bölmeden 10nM kizinostat, negatif kontrol olarak bazal bölmeden 10ng/ml IL-13 kullanıldı. Farklılaşmamış AİBEH epitel bariyer işlevine valeratın etkisi, bazal bölmeden 10nM, 100nM ve 1uM'lik konsantrasyonlarının tek başına uygulanması ile araştırıldı. Farklılaşmamış AİBEH kültürüyle yapılan deneylerde pozitif kontrol olarak bazal bölmeden 10nM kizinostat kullanıldı. Primer insan solunum yolu hücre kültürü ile yapılan deneylerde herhangi bir etken maddenin kullanılmadığı hücre kültürü kontrolü için sadece hücre kültürü sıvısı eklenmiştir. Yapılan deneylerde hücrelerin epitel bariyer işlevi TER ölçümü ve parasellüler geçiş analizi ile değerlendirilmiştir. Çalışmamızda B. longum subsp. longum 35624'un laktat, formiat ve asetat ürettiği buna karşın propionat, bütirat veya valerat üretmediği gösterilmiştir. Valeratın farklılaşmış SİBEH hücreleri tarafından metabolizasyonu YBSK yöntemi ile belirlenmiştir. Farklılaşmış Caco-2 epitel hücrelerinde; valeratın tüm konsantrasyonlarının TER değerine etkisi olmamıştır, buna karşın kizinostatın 100nM ve bütiratın 4 ve 8 mM'lık konsantrasyonları TER değerlerinde düşmeye neden olmuştur. Farklılaşmamış Caco-2 epitel hücrelerinde ise; valeratın 0.1, 0.5, 1 ve 4mM'lık ve kizinostatın 50 ve 100nM'lık konsantrasyonları TER değerlerini arttırmıştır, bütiratın ise 4mM'lık konsantrasyonu TER değerinde düşmeye yol açmıştır. Farklılaşmış SİBEH kültüründe, valerat TER değerlerinde ve paraselüler geçiş miktarında değişikliğe neden olmamıştır ve bu hücrelerde IL-13'ün bariyer bozucu etkisini geri döndüremediği belirlenmiştir. Farklılaşmamış SİBEH kültüründe; valeratın bazal bölgeden uyarımı ile donör örneğine bağlı olarak TER değerlerini kontrole göre arttırdığı belirlenmiştir, ancak IL-13'ün epitel bariyer bozucu etkisini geri döndüremediği ve AİBEH bariyer işlevini güçlendiremediği gösterilmiştir. Çalışmamızda kizinostatın ve valeratın Caco-2 epitel bariyer işlevini güçlendirdiği bulunmuştur. Valeratın solunum yolu epiteli bariyerine etkisinin donöre, hücrelerin farklılaşma durumuna, uyarımın süresine ve kültüre ekleniş yoluna (bazal veya apikal) bağlı olarak değiştiği saptanmıştır. Bunun yanında valeratın farklılaşmış SİBEH'ler tarafından metabolize edildiği belirlenmiştir. Kısa zincirli yağ asitlerinin solunum sistemi epitel bariyer işlevini güçlendirici etkisinin araştırıldığı daha geniş çalışmalara ihtiyaç olduğu düşünülmektedir.