Enterobacter sp. 3TP2A bakterisinden izole edilen β-galaktosidaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu

Bu çalışmada, Türkiye'nin Güneydoğu Bölgesi'nde yer alan Batman ilindeki bir akaryakıt istasyonundan izole edilen mezofilik Enterobacter sp. 3TP2A bakterisinin yüksek miktarda mezofilik β-galaktosidaz enzimi ürettiği görülmüştür. Ayrıca, laktozun β- galaktosidaz üretimini önemli ölçüde arttırdığı görülmüş olup bu bulgu, bu enzimin endüke edilebilir bir enzim olduğunu göstermektedir. Enterobacter sp. 3TP2A bakterisinden izole edilen intraselüler β-galaktosidaz saflaştırılıp karakterize edildi. Saflaştırma işlemi %70 amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz, ultrafiltrasyon ve son olarak da Sephadex G-75 kromatografisi yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Enzim, jel geçirgenlik kromatografisi kullanılarak yaklaşık %11 verimle 17.3 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin pH 8.0 ve 35 oC'de stabil olduğu ve moleküler ağırlığının ise SDS-PAGE ve native-PAGE metodlarına göre yaklaşık 60 kDa olduğu tespit edilmiştir. Çeşitli metal iyonların farklı CaCl2, MgCl2, ZnCl2, CuCl2 ve EDTA (1, 2, 5, 10 ve 20 mM) konsantrasyonlardaki etkileri incelenmiştir. EDTA ve Cu2+'nın Enterobacter sp. 3TP2A'dan saflaştırılan β-galaktosidaz üzerinde inhibe edici bir etkiye sahip oldukları belirlenmiştir. EDTA'nın enzim aktivitesini %76'ya kadar inhibe ettiği ve Cu2+'nın β- galaktosidaz üzerindeki inhibe edici etkisinin düşük konsantrasyonlarda bile güçlü olduğu görülmüştür (96.9%). Bununla birlikte, Mg2+'nın saflaştırılan enzimin aktivasyonuna sebep olduğu görülmüştür. Ca2+ ise enzim aktivitesini önemli ölçüde etkilememiş olup 20 mM (yalnızca 16%)'de enzimin deaktivasyonuna sebep olmuştur. Ancak, Zn2+ 1, 2 ve 5 mM'de enzimin aktivasyonuna sebep olmuştur (sırasıyla, %32, %27, %8). Mg2+ konsantrasyonundaki artışın 47%'ye kadar enzim aktivasyonuna sebep olması ve EDTA tarafından inhibe edilmesi, bu enzimin metal-bağımlı veya metaloenzim olduğunu göstermektedir. Buna ilaveten, farklı konsantrasyonlardaki inhibitörlerin saflaştırılan enzim üzerindeki etkileri şu konsantrasyonlarda incelenmiştir: PCMB (0,2, 0,4, 1, 2 mM) , Iodo, DTT, β-mer, N-etil, (1, 2, 4, 8 mM). Enzim, N-etil tarafından tamamen inhibe edilmesine karşın (%100), DTT tarafından etkilenmemiştir. Enzim, β-galaktosidaz aktivitesini 8 mM'de %14 oranında arttıran β-mer tarafından hafifçe etkilenmiştir. Iodo da β-galaktosidaz aktivitesini hafifçe etkilemiştir (%13'e kadar). PCMB ise enzimatik aktiviteyi %87'lere varan inhibisyonla büyük oranlarda etkilemiştir. Lineweaver-Burk grafiği lineer olarak belirlenmiş olup bu sonuç basit bir Michealis-Menten kinetiğine işaret etmektedir. Vmax 0.701 (μmol/ dak mg) ve Km 0.104 mM olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, laktoz hidrolizi süresinin, saflaştırılan β-galaktosidaz tarafından katalize edilen reaksiyondan dolayı, 10 saate kadar çıktığı gözlemlenmiştir. Bu çalışmanın amacı Enterobacter sp. 3TP2A'dan mezofilik β-galaktozidaz'ı saflaştırmak, karakterize etmek ve laktoz hidrolizi gibi biyoteknoloji alanında kullanımını test etmekti. Elde edilen bulgular bu enzimin iyi bir aday olabileceğini göstermiştir.