Sakız ağacı (Pistacia lentiscus L.) 'nın in vitro klonal mikroçoğaltılması

Sakız ağacının (P. lentiscus L.) klonlanmış dört genç genotipinin sürgün uçları kullanılarak bir mikroçoğaltma protokolü geliştirildi. Olgun tohumlardan aksenik explantların üretimi için etkili bir yüzey sterilizasyonu metodu geliştirildi. Olgun tohumların yüzey sterilizasyonu üzerine çalkalama süresi ve sodyum hipokloritin farklı konsantrasyonlarının etkisi ve aksenik sürgün uçlarından klonal sürgün çoğaltılması, köklenmesi ve köklenmiş fideciklerin in vivo koşullara alıştırılması gibi faktörler araştırıldı. Aşağıdaki yüzey sterilizasyonu, sürgün çoğaltılması, köklenme ve alıştırma parametreleri rapor edildi: enfekte olan ve enfekte olmayan tohum oranı, ortalama sürgün sayısı, ortalama sürgün uzunluğu, köklenme yüzdesi, adventif kök sayısı, kök uzunluğu ve 5 ve 8 hafta alıştırmadan sonra yaşayan renerant oranları. Anaç kontrol grubu ile birlikte 6., 9. ve 12. altkültürdeki bitkilerden alınan yapraklardan DNA?lar izole edildi ve Retrotranpozon Arası Çoğaltılmış Bölge Polimorfizmi (IRAP) primeri kullanılarak bir PCR aracılığıyla analiz edildi. Sakız tohumlarının çimlenmesi için %20?lik NaOCl ile 20 dakikalık çalkalama optimum kombinasyon olarak bulunmuş olup bu kombinasyonda tohumlar aşırı steril olmadan ve bozulmadan çimlenme oranı %88.30 gerçekleşti. Sakız ağacı sürgünlerinin çoğaltılması safhasında dört farklı besi ortamının etkilerine göre, MS besi ortamı eksplant başına en yüksek oranda (3.44) sürgün ile birlikte maksimum sürgün proliferasyonu (%100) ile en iyi sonuçları verdi. Kültüre alındıktan 28 gün sonra, en çok sürgün sayısı (3.60?0.13) ve sağlıklı sürgün uzunluğu (16.80?0.20) 1 mgl-1 BA içeren ½ ve ¼ kuvvetindeki MS besi ortamında kültürlenen Klon-II?de elde edilirken, en düşük oranda sürgün sayısı ise, Klon-I?de QL?li ve Klon-II?de WPM besi ortamında elde edildi. Çalışılan sitokininler arasında sürgün sayısı ve uzunluğu bakımından sürgünlerin morfojenezi BA destekli ortamda optimum olarak belirlenirken, 1 mgl-1 BA ve 2iP?li besi ortamında en uzun sürgünler elde edilmiştir. Klone-II?de sitokinin tipine bağlı olmaksızın rizogenes gözlendi. Klon-II regenerantları ile test edilen farklı BA konsantrasyonları arasında 2 mgl-1 BA?lı ortamda en fazla sürgün (2.92±0.36) gelişti. Özellikle Klon-II regenerantları %3?lük fruktozlu ortamda sakkaroz, laktoz ve glikozdan daha fazla ve daha uzun sürgün oluşturdu. Klon-II?de eksplant başına maksimum sürgün sayısı (3.62) 1 mgl-1 BA ve 30 g/l fruktoz içeren MS besi ortamında rapor edildi. Fakat sürgünlerin genel büyüme ve görünüşleri sakkarozlu besi ortamında fruktoz, glikoz ve laktozlu ortama göre daha iyi olduğu gözlendi. IBA?nın çalışılan en yüksek konsantrasyonunda güçlü köklenme teşvik edildi ve bu orandaki IBA?lı ortamda Klon-II?ye ait mikrosürgünler %94 oranında köklendi. Klon-II?de test edilen bütün kontrol grubu çalışmalarında olduğu gibi %25?i köklendi. Bu bağlamda Klon-II?nin diğer klon hatlarına göre daha iyi olduğu görüldü. Köklenen sürgünlerin aklimitizasyonu için tanımlanan bu protokol başarılıdır. Çünkü büyüme odasında yaşayan bitki oranı aklimitizasyondan iki ay sonra %95 olarak rapor edildi. Elde edilen verilere göre oluşturulan dendrogram incelendiğinde çekici varyasyonun Klon-II?de olduğu gözlendi. I., II. ve IV. klonlara ait ana bitki ve 6., 9. ve 12. altkültürlerde ise varyasyonun Klon-II?ye kıyasla daha düşük düzeyde olup, klonların genetik olarak nispeten biraraya toplandıkları belirlendi. Ana bitkiye genetik olarak en yakın klonların Klon I ve III?ün 6. alt kültürüne (I-6, III-6) ait olduğu tespit edildi. Ayrıca, Klon-I?de ana bitki ile en uzak altkültürün 12. altkültür (I-12) olduğu belirlendi Tez kapsamında sakız ağacında ilk defa IRAP belirteci kullanılarak yapılan moleküler analizde %80 oranında benzerlik bulunmuştur. Ortalama 0.331 olan PIC değeri klon spesifik ve altkültür sayısı ilgili olsa da, klonlar arasında düşük seviyede de olsa polimorfizm gerçekleştiğini göstermektedir. Ayrıca, bu çalışma IRAP?ın sakız ağacının farklı klonları arasında ve içinde bu tip polimorfizmin belirlenmesinde başarılı bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Geliştirilen protokol olgun ve seçkin sakız ağaçlarının in vitro klonlanması için iyi bir model olduğu düşünülmektedir. Ancak, klonlama için organogezisin geliştirilmesi in vitro şartlarda seçkin ağaçlarda rejuvenasyon veya rejenerasyon protokollerinin geliştirilmesi gereklidir. Organogezis üzerine yapılacak olan daha ileri çalışmalar tamamlanmadan bu potansiyeli açığa çıkarmak mümkün olmayacaktır. Anahtar kelimler: P.lentiscus L., Sakız ağacı, Mikroçoğaltım, Klon, IRAP