Sıcak su kaynaklarından bakteri izolasyonu, tanımlanması ve Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. Rittmanii'nin b-galaktozidaz enziminin saflaştırılması

Taşlıdere-Batman ve Kös-Bingöl sıcak su kaplıcalarından izole edilen bakterilerin morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal özellikleri, lipit ve yağ asidi içerikleri, kinon tipleri ve 16S rRNA dizi analizleri yapılarak identifikasyonları yapılmıştır. Ayrıca Antartika'dan izole edilmiş diğer bir termofilik basil olan Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii'nin biyoteknolojik öneme sahip olan ? -galaktozidaz enzimi saflaştırılmış ve saf enzimin bazı özellikleri çalışılmıştır.Kös-Bingöl kaplıcasından izole edilen ve KG5 olarak adlandırılan izolat, çubuk şekilli, Gram-pozitif, fakültatif anaerob, hareketli ve endosporları oval şekilli sentral konumlu olduğu bulunmuştur. KG5 için üreme sıcaklık aralığı 15-45 ? C (optimum 40 ? C) olarak bulunduğundan mezofilik karakterde bir bakteri olarak tanımlanmıştır. KG5 birçok özellik bakımından Bacillus cereus türüne benzerlik göstermektedir. KG5'in sadece katalaz ve glukoz kullanımının negatif olmasından dolayı Bacillus cereus'un diğer varyetelerinden farklı olduğu tespit edilmiştir.KG5 ile Bacillus cereus türü arasında yağ asidi profili bakımından da benzerlik bulunmuştur. Her iki bakteride de nC16:0 majör yağ asidi, iC15:0 ise ikinci büyük yağ asididir. KG5'te nC18:0 yağ asidinin B.cereus'tan çok daha fazla oranlarda bulunmuştur. Ayrıca, KG5'in 16S rRNA dizisi % 100 oranına yakın B. cereus'a, % 99.9 oranında Bacillus thrungiensis'e ve % 99.8 oranında Bacillus anthracis'e benzediği bulunmuştur.Taşlıdere-Batman kaplıcasından izole edilen ve KG9 olarak adlandırılan izolat çubuk şekilli, Gram-pozitif, fakültatif anaerob ve hareketli, endosporları oval şekilli subterminal konumlu olduğu bulunmuş ve üreme sıcaklık aralığı 30-55 ? C (optimum 50 ? C) olarak bulunduğundan ılımlı termofil karakterde bir bakteri olarak tanımlanmıştır. KG9 birçok özellik bakımından Bacillus licheniformis türüne benzerlik gösterdiği bulunmuştur. % 15 Oranındaki NaCl' de üreyen KG9' un halotolerant olduğu tespit edilmiştir.Yağ asidi profiline göre KG9 ve B.licheniformis'te majör yağ asidi iC15:0'tir. Diğer türlerde tespit edilmeyen yağ asidi nC18:0, KG9'da bulunmuştur. KG9'un 16S rRNA dizisinin % 99 oranında Bacillus licheniformis'e benzediği tespit edilmiştir.Taşlıdere-Batman kaplıcasından izole edilen ve KG8 olarak adlandırılan diğer izolatın çubuk şekilli, Gram-pozitif, fakültatif anaerob, hareketli, endosporları oval şekilli subterminal konumlu olduğu bulunmuş ve üreme sıcaklık aralığı 35-65 ? C (optimum 55 ? C) olarak bulunduğundan ılımlı termofil karakterde bir bakteri olarak tanımlanmıştır.Yağ asidi profilinden KG8 izolatının Anoxybacillus cinsinin üyesi olduğunu ve KG8'in 16S rRNA dizisinin Anoxybacillus kamchatkensis' e % 99, A.flavithermus, A. ayderensis ve A. gonensis' e % 98 ve A. pushchiensis' e ise % 97 oranında benzerliğe sahip olduğu bulunmuştur.KG8 izolatının 16S rRNA dizi analizine göre %99 oranda benzerlik gösterdiği A. kamchatkensis, katalaz negatif, nişasta hidrolizi negatif, optimum üreme sıcaklığı 60 ? C iken, KG8, katalaz (+), nişasta hidrolizi (+), ve optimum üreme sıcaklığı 55 ? C olarak tespit edilmiştir. İki bakteri arasındaki yüksek oranda 16S rRNA dizi benzerliğine rağmen bu gibi farklılıkların görülmesi KG8'in ayrı bir tür olabileceğini göstermektedir. A. kamchatkensis türü ile DNA-DNA hibridizasyonu sonucunda elde edilecek homoloji ile bu izolatın yeni bir tür veya alt tür olup olmadığı ortaya çıkacaktır.Çalışılan bakterilerin lipit analizi yapıldığında ise 3 bakterinin gliko ve fosfolipit ve aminolipitler bakımından basillere benzediği, KG5' in farklı olarak fosfo-gliko lipit içerdiği tespit edilmiştir. Ayrıca tür teşhisinde kullanılan kinon tipleri çalışılmış, tüm çalışılan izolatların menakinon içerdiği ve KG8 için yapılan ileri çalışmada da bu menakinon tipinin MK-7 olduğu bulunmuştur.Ekstrem şartlara dayanıklı türlerin enzim kaynağı olarak kullanılma potansiyelleri nedeniyle, Antartika'dan izole edilen ve tür teşhisi daha önce yapılan Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmanii'nin endüstriyel açıdan öneme sahip intraselüler bir ? -galaktozidaz enzimi saflaştırılmış ve enzimin bazı özellikleri çalışılmıştır.Saf enzim 113 U/mg spesifik aktivite, 163 kat saflaştırma ve % 8'lik bir verimle elde edildi. Km değeri 8.9 mM olarak hesaplandı. Saf enzim için elde edilen optimum pH ve sıcaklık sırasıyla 6.0 ve 65 ?C'dir.FPLC sistemini kullanarak ? -galaktozidazın nativ (non-denatüre) molekül ağırlığı 165 kD, denatüre şartlar altında ise 76 kD olduğu bulunmuştur. Saflaştırılan ? -galaktozidaz ın molekül ağırlığına, izole edildiği organizmaya ve afinite kromatografisine bağlanamama veya zayıf bağlanma yeteneğine bakıldığında GH-42 ailesinin bir üyesi olabileceği düşünülmektedir. Jel filtrasyon ve SDS-PAGE yöntemi ile enzimin benzer veya aynı alt ünitelerden (76 kD) oluşan oligomerik (dimer veya trimer; non-denatüre moleküler ağırlık 165 kD) bir yapıya sahip olduğu bulunmuştur.Bu çalışmada saflaştırılan A. acidocaldarius subsp. rittmannii ? -galaktozidazının optimum pH ve sıcaklığının uygunluğu, hem kendiliğinden sentezlenen hem de sentezi artırılabilen (indüklenebilen) özelliklerinden dolayı süt ve peynir altı suyu laktozunun hidrolizinde uygun bir kullanım alanına sahip olabileceğini göstermektedir. Bu enzimin endüstride kullanılabilirliği ileri seviyede test edilmesi gerekmektedir.KG9'un nişasta ve kazein hidrolizi pozitif, katalaz pozitif, KG5'in kazein ve jelatin pozitif, KG8' in ise nişasta hidrolizi pozitif olması bu bakterilerin endüstriyel açıdan önemli olan enzimlerin (amilaz, proteaz vs.) kaynağı olabileceklerini göstermektedir. Termofilik olmalarından dolayı KG8 ve KG9'un önemi daha da artmaktadır .