Stenotrophomonas maltophilia'dan kitinaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulamaları

Bu tez çalışması kapsamında; kültür koleksiyonumuzda bulunan bakteri izolatlarının kitinaz aktiviteleri araştırıldı ve en iyi kitinaz aktivitesi gösteren izolat belirlenerek klasik (morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal) ve moleküler yöntemlerle (16S rRNA dizi analizi) tanılandı. Stenotrophomanas maltophilia (Gen Bank No: MW600524) olarak tanılanan izolattan kitinaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi ve iyon değişim kromatografisi yöntemiyle saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin optimum sıcaklık ve pH'sı, Vmax ve Km değerleri ile sıcaklık ve pH stabiliteleri belirlendi. Enzim aktivitesi üzerine çeşitli metal iyonları (Ca2+, Cd2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+), reaktifler (%1-5 EDTA, H2O2, SDS, Tween 20 ve Tween 80) ve çözücülerin (%5-15 DMSO, aseton, gliserol, etanol, izopropanol) etkisi araştırıldı. Saflaştırılan kitinaz enziminin antifungal ve biyoinsektisit olarak kullanılabilirliğinin belirlenmesi amacıyla önemli tarımsal hastalık ve zararlılara karşı etkisi incelendi. Yapılan çalışmalar sonucunda kitinaz enzimi %30 amonyum sülfat konsantrasyonunda %40,7 verimle, 1,4 kat saflaştırıldı. Kısmi saflaştırmanın akabinde iyon değişim kromatografi tekniğiyle HiPrep Q XL 16/10 kolonu ve HiPrep™ 26/10 Desalting kolonu kullanılarak sırasıyla %25,34 ve %18,12 verimle saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı SDS-PAGE yöntemiyle 52 kDa olarak hesaplandı. Enzimin optimum sıcaklığı 50 °C ve optimum pH değeri 7,0 olarak belirlendi. 1 mM konsantrasyondaki Fe2+, Cd2+ve Mn2+ iyonları ile 5 mM konsantrasyondaki Mg2+ ve Fe2+ iyonları enzim aktivesini artırırken, test edilen tüm çözücü ve reaktiflerin enzim aktivitesini düşürdüğü tespit edildi. Kolloidal kitin için enzimin Vmax ve Km değerleri sırasıyla 1,07 µmol.ml-1.dk-1 ve 0,6 mg/ml olarak hesaplandı. Saflaştırılan enzimin Fusarium oxysporium'un çimlenmesi ve hifsel gelişimini olumsuz etkilediği, Leptinotarsa decemlineata böceğinin ise kitin yapısında bozulmalara sebep olduğu belirlendi. Anahtar Kelimeler: Stenotrophomanas maltophilia, kitinaz, enzim saflaştırma, antifungal aktivite, biyoinsektisit