Termofilik Bacillus licheniformis KG9'da ekstrasellüler ß-galaktozidaz enzimi üzerine çalışmalar

Bu çalışmada Batman Taşlıdere sıcak su kaplıcasından izole edilen termofilik Bacillus licheniformis KG9'un biyoteknolojik öneme sahip ekstrasellüler ß-galaktozidaz enziminin bazı özelliklerinin araştırılması amaçlanmıştır.Bacillus licheniformis KG9 NB besi yerinde laktozlu(%1) ve laktozsuz ortamlarda 6-96 saatler arasında kültüre alınarak zamana bağlı enzim üretimi araştırıldı. Laktozlu ortamda enzim aktivitesi 48.saatten(1.39 U/mg) başlayarak 96. saate ( 3.25 U/mg) kadar artarak devam ettiği görüldü. Laktozsuz ortamda ise enzim aktivitesinin 36.saatten(1.38 U/mg) başlayarak 96.saate(2.45 U/mg) kadar artarak devam ettiği ancak bu artışın laktozlu ortamdakine nazaran düşük olduğu görüldü.pH ve sıcaklığın ß-galaktozidaz enzimi üzerine etkisi pH 4-10 ve 30°C ile 90 °C aralığında ham enzimde hem de kısmi olarak saflaştırılan enzim solüsyonunda yapıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 8.0 ve 55 oC olarak bulundu.Enzim aktivitesi üzerine faklı substrat konsantrasyonlarının etkisi 0,25 -6 mM aralığında araştırıldı. En uygun substrat konsantrasyonu 3 mM olarak tespit edildi.Enzim üretimi üzerine değişik besi yerlerinin etkisi içerikleri farklı olan NB, BM1, BM2, BM3 besi yerlerinde araştırıldı. En iyi enzim aktivitesi NB besiyerinde elde edildi.Enzim üretimi üzerine %1 oranındaki farklı azot ve karbon kaynaklarının etkisi araştırıldı. Karbon kaynaklarının enzim üretimi arttırmadığı tespit edildi. Laktoz araştırılan diğer karbon kaynaklarına göre daha yüksek bir aktivite tespit edildi. Galaktoz, glukoz ve çözünebilir nişastanın ekstrasellüler enzim üretimini büyük oranda inhibe ettiği tespit edildi. Azot kaynaklarından glisin ve amonyum sülfat enzim üretimini az miktarda arttırdığı tespit edildi. Yeast ekstrakt, beef ekstrakt , pepton ve tripton'un enzim üretimini arttırmadığı tespit edildi.Enzim amonyumsülfat çöktürmesi ve diyaliz aşamasından geçirilerek kısmi olarak saflaştırıldı. Ham ekstraktta enzimin spesifik aktivite değeri 1631 U/mg, verim %100, saflaştırma katsayısı 1 iken diyaliz sonrasında sırasıyla spesifik aktivite değerinin 19030.45 U/mg , verimin %15,7 ve saflaştırma katsayısının 11,66 olarak değiştiği tespit edildi.Kısmi olarak saflaştırılan enzimin aktivitesi üzerine bazı kimyasalların, metallerin, metal şelatörlerin etkisi araştırıldı. MgCl2 8 mM'da %16 oranında ß-galaktozidaz aktivitesini arttırdığı, ZnCl2 ve CuCl2'ün 1mM'da sırasıyla%99.5 ve %93.5 oranında enzim aktivitesini inhibe ettiği, CaCI2'ün 20 mM'da enzim aktivitesini %62 oranında inhibe ettiği, metal şelatörleri olan EDTA ve 1,10-phenanthroline monohydrat'ın enzimde inhibisyona neden olmadığı tespit edildi. DTT ve ß-mercaptoethanol'un 10 mM'da sırasıyla %37 ve %24 oranında enzim aktivitesini arttırdığı, PCMB'nin 4 mM'da enzim aktivitesini %52 oranında inhibe ettiği, Iodoacetamide'in 20 mM'da enzim aktivitesini %53 oranında inhibe ettiği, PMSF ve N-ethylenemaleimide enzimde inhibisyona neden olmadığı tespit edildi.Kısmi olarak saflaştırılan enzimde gliserol ve sorbitolün dondurma-çözdürme işleminde koruyucu etkisi %1-5 konsantrasyonlarında araştırıldı. Sorbitol için en iyi koruyucu etki %5 konsantrasyonunda olduğu tespit edildi. Gliserol de ise %1'de %83, %2- %5 konsantrasyonlarında yaklaşık %90 oranında dondurma ve çözme işleminde koruduğu tespit edildi.Enzimin termal stabilitesi 50 -65 ºC sıcaklık aralıklarında araştırıldı. Enzimin aktivitesini 50 ºC 120dk. sonunda %90 oranında koruduğu, 55 ºC'de 120 dk. sonunda aktivitesini tamamı ile koruduğu, 60 ºC'de 120dk. sonunda %90 oranında koruduğu tespit edildi. 65 ºC'de ise 20 dk.'da enzimin aktivitesini tamamen kaybettiği tespit edildi.Glukoz ve galaktozun, enzim üzerinde yaptığı inhibisyon etkisi belirlendi. Glukoz ve galaktozun 2 -128 mM konsantrasyonları test edildi. Glukozun enzim üzerine ihibisyon etkisi gözlenmedi. Galaktoz'un ise 128 mM'da %97 oranında inhibisyona neden olduğu tespit edildi. Galaktoz'un inhibisyon çeşidini belirlemek amacı ile 4 mM , 16 mM , 32 mM konsantrasyonlarında ve belirli enzim konsantrasyonlarında, 1-6 mM aralığındaki ONPG konsantrasyonları kullanıldı. Galaktoz'un enzim üzerinde yarışmalı bir inhibisyona neden olduğu tespit edildi. ONPG için Km ve Vmax değerleri Lineweaver?Burk plot'a göre sırası ile 3.52 mM ve 1.602µmol/dk. olarak hesaplandı.12- 96. saatler arasında kültüre alınan bakterilerde zamana bağlı enzim üretim oranları non-denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile teyit edilmiştir.