Yeni anti-theilerial ilaçların geliştirilmesi için theileria annulata peptidil prolil izomeraz geninin klonlanması ve inhibitör adaylarının in silico incelenmesi

Geleneksel yöntemlerle yeni ilaçların geliştirilmesi pahalıdır ve uzun yıllar sürmektedir. Son yıllarda, bilgisayar destekli ilaç tasarımı, maliyet ve zaman gereksinimlerini önemli ölçüde azalttığı için yeni ilaç keşfi ve geliştirilmesi alanında büyük önem kazanmıştır. T. annulata, dünya çapında milyonlarca sığırı tehdit eden tropikal theileriosise neden olmaktadır. Theileriosisin tedavisinde anti-theilerial ilaç olan buparvaquone kullanılmaktadır. Ancak, son zamanlarda Theileria annulata'nın ilaç direncinin bildirilmesi, theileriosisin tedavi edilmesi için yeni ilaç adaylarının keşfedilmesi ihtiyacını ortaya çıkarmaktadır. Tez çalışmasında, ileri in vitro karakterizasyon ve inhibitör test çalışmalarında kullanılmak üzere Theileria annulata peptidil prolil cis/trans izomeraz geni (TaPIN1) klonlanmış olup, inhibitor kütüphanesi in silico taranarak ilaç direnci rapor edilmiş TaPIN1'in inhibisyonuna yönelik aday moleküllerin belirlenmesi ve önerilen yaklaşımın aşırı ifade edilmiş Ras/Neu proteinlerce indüklenen insan PIN1 enzim kaynaklı kanserlerin tedavi edilmesine yönelik kurgunun yapılması gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasının klonlama aşamasında ilk olarak, Theileria annulata peptidil prolil cis/trans izomeraz enzimini kodlayan dizi polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye edilmiştir. Ardından, pLATE31 vektör sistemine aktarılarak, E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. İntron bölgesi, Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit ile uzaklaştırılıp intronsuz rekombinant DNA E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transforme edilmiştir. İntronun uzaklaştırıldığı ve doğru gen dizisinin insersiyonu, DNA dizilime ile teyit edilmiş ve ileri çalışmlar için hazır hale getirilmiştir. Tez çalışmasının bilgisayar destekli ilaç keşfi aşamasının ilk adımında, mutant ve yabanıl tip TaPIN1'in homoloji modelleri, MODELLER v9.15 yazılımı ile belirlenmiş olup, modellerin doğruluğu, çeşitli web sunucuları kullanılarak teyit edilmiştir. PubChem veri bankası kullanılarak oluşturulan 2979 naftokinon türevlerini içeren sanal kütüphane mutant TaPIN1'e karşı Schrödinger Glide HTVS, SP ve XP kenetlenme metodolojilerine göre taranmıştır. Kenetli bileşikler Glide Extra Precision (XP) skorlama fonksiyonu ile sıralanmış ve serbest bağlanma enerjileri Prime MM-GBSA yöntemi ile hesaplanmıştır. XP skor sıralamasına göre ilk iki sırada yer alan kenetli bileşikler (5304752 ve 9993782 Pubchem numaralı bileşikler) moleküler dinamik simülasyon çalışmalarında kullanılmıştır. AMBER programı kullanılarak, ligand bağlı olmadan yabanıl tip ve mutant TaPIN1'in simülasyonu 50 ns, ligand bağlı yapıların simülasyonu 100 ns'de gerçekleştirilmiştir. 5304752 PubChem numaralı ligandın hem yabanıl tip hem mutant TaPIN1'in aktif bölgesinde bulunduğu gözlenmiştir ve potansiyel inhibitör olarak değerlendirilebileceği öngörülmüştür. 9993782 PubChem numaralı ligandın yabanıl tip TaPIN1'in aktif bölgesinin dışında konumlandığı gözlenmiştir, fakat mutant TaPIN1'in aktif bölgesine yakın bir yerde bulunduğu gözlenmiştir ve mutant enzime karşı potansiyel inhibitör olarak değerlendirilebileceği öngörülmüştür. Ayrıca, bu sonuçlar doğrultusunda, öngörülen inhibitörler, TaPIN1 ile aynı mekanizmayı kullanarak, insanlarda kanser oluşumuna neden olan insan peptidil prolil enzimi (hPIN1) için de potansiyel inhibitörler olabileceği öngörülmüştür.