457
Arşivlenen Tez
0
DOI Atanmış
0%
DOI Oranı
Anabilim Dalı
Ekstrakorporeal dolaşım (ECD) ile kan hücrelerindeki morfolojik değişikliklerin periferik yayma ile ışık mikroskobunda değerlendirilmesi
Çalışmamıza Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Dursun Odabaş Tıp Merkezi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu'nun 13/02/2019 tarihli ve Karar No: 07 onayı (bkz. Ek 1) alındıktan sonra başlanmıştır. Çalışmamıza katılan her hasta için Bilgilendirilmiş Gönüllü Onam Formu imzalatıldıktan sonra başlanmıştır. Bu çalışmada ekstrakorporeal dolaşım ile kan hücrelerindeki morfolojik değişikliklerin periferik yayma ile ışık mikroskobunda incelenmesi amaçlandı. Bunun için Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Dursun Odabaş Tıp Merkezi Kalp Damar Cerrahisi Polikliniğinde tanı alan ve takibi Kalp Damar Cerrahisi Servisinde yapılan olgularda yaş sınırı olmayan kardiyopulmoner baypas hastaları üzerinde yapıldı. Koroner damar hastalığı, koroner damar tıkanıklığı ve hasarı, kalp kapağı replesmanı, aort diseksiyonu tanısı almış, cerrahi müdahele gereken hastalar çalışmaya dahil edildi. Kronik böbrek yetmezliği, gebelik, hematolojik kan hastalığı olan ve hematolojik reaksiyon gösterebilen hasta grubu araştırmaya dahil edilmedi. Kardiyopulmoner baypas cerrahisi kararı alınan hastaların her birinden servise yatışı olduktan hemen sonra, Extrakorporeal Dolaşıma girip yoğun bakıma alındığı ilk saatte ve taburcu edileceği günde olmak üzere üç kez periferik yayma yapıldı ve kan hücrelerinin bütünündeki iyileşme süreci değerlendirildi. Ameliyat süresinin, kros klemp süresinin, eritrosit süspansiyonu miktarının, taze donmuş plazma miktarının, vaka çeşidinin, hemofiltrasyonun, ejeksiyon fraksiyon değerinin kanın şekilli elemanlarındaki etkileri incelendi. Periferik yayma değerleri ışık mikroskobunda, hemogramda ise Hb, Hct, Wbc değerleri karşılaştırıldı. Dünya Sağlık Örgütü kriterlerine uygun olarak analizleri yapıldı. İstatistiksel olarak belirgin farklılıklar gözlendi ve sonuçlar literatür ışığında tartışıldı.
Resveratrolün sıçan hipokampus sinaptik plastisitesi üzerindeki etkilerinin immunohistokimyasal ve stereolojik yöntemlerle değerlendirilmesi
Çalışmamıza Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu'nun onayı alındıktan sonra başlandı. Bu amaç için nöroprotektif madde olan resveratrol'un sinaps ve nöron sayısal yoğunluğuna ait etkileri stereolojik ve immunohistokimyasal olarak incelendi. Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Deneysel Tıp Uygulama ve Araştırma Merkezinde yapılan çalışmada Wistar-Albino türü, her grupta altı adet olmak üzere iki grupta on iki erkek sıçan kullanıldı. Birinci gruba günde bir kez serum fizyolojik içinde çözünen resveratrol (20mg/kg/gün) oral yolla gavaj ile verildi, ikinci grup ise kontrol grubu olarak tek başına SF gavaj ile verildi. Bir haftanın sonunda sıçanlar anestezi altında kafatasları açılarak çıkarılan beyin dokular %30'lik sükroz solusyonu içerisinde bir gün boyunca ve %20'luk sükroz içerisinde dokular dibe çökene kadar beklendi. Ardından dokular kriyomatriks içerisine gömülerek çalısma ısısı -20 0C ayarlanmış frozende ortalama 4µm kalınlıkta ardışık kesitleri lamlara alındı. Sıçanlardan her 400 µm aralıkta sistematik rastgele örnekleme ile iki seri ve her biri ortalama beş çift kesit içeren preparatlar hazırlandı. Hematoksilen eozin ile boyama işlemi yapıldı. Disektör sayım işlemine uygun tarafsız sayım çerçevesi kullanıldı. Fiziksel disektor yöntemi ile nöron sayımında sayısal yoğunluk hesaplandı. İmmunohistokimyasal olarak sinaptofizin ile sinaps işaretleyici kullanıldı. Preparatlar fotoğraflandı ve şık mikroskopik olarak değerlendirildi. Gruplar arası karşılaştırılmalarında istatistik programı olarak Mann-Whitney U testi kullanıldı. Sinaptofizin immunohistokimyasal reaksiyon kontrol grubuna göre göreceli olarak koyu boyandığı gözlendi. Granüler nöron sayısı bakımından gruplararası istatistiksel bir fark gözlenmedi (P>0.05). Elde edilen sonuçlar literatür ışığında tartışıldı.
Deneysel psöriazis modelinde bergenin ve mezenkimal kök hücrelerin kombine terapötik etkinliklerinin araştırılması
Psöriazis, keratinosit ve immün hücre etkileşimleri sonucu epidermal hiperplazi ve inflamasyona neden olan kronik inflamatuvar bir otoimmün hastalıktır. Mevcut tedaviler semptomları hafifletse de uzun süreli kullanımda ciddi yan etkilere yol açabilmektedir. NLRP3 inflamazom aktivasyonu ve Nrf2/KEAP1/SIRT1 sinyal bozukluklarının psöriazis şiddetini artırması, yeni anti-inflamatuvar ve immunsüpresör tedavilere olan ihtiyacı doğurmuştur. Sunulan çalışmada, anti-inflamatuvar etkili bergenin (BER) ve immünosüpresif özellikteki mezenkimal kök hücrelerin (MZKH) kombinasyonuyla translasyonel bir tedavi stratejisi hedeflenmiştir. Çalışmada imiquimod (IMQ) ile indüklenen psöriazis fare modelinde, BER ve MZKH'lerin kombine uygulamasının, NLRP3 inflamazomu ile Nrf2/Keap1/SIRT1 ekseni üzerindeki terapötik potansiyelinin aydınlatılması amaçlandı. 48 adet BALB/c fare: Kontrol, Serum Fizyolojik+Vazelin (SF+VAZ), BER, MZKH, IMQ, IMQ+BER, IMQ+MZKH ve Kombine olmak üzere sekiz gruba ayrıldı. Farelerin sırt ve kulak derilerine yedi gün boyunca IMQ uygulamasıyla psöriazis modeli oluşturulduktan sonra psöriazis şiddeti ve yaygınlığı PAŞİ skoruyla, deri ve dalak dokularındaki değişiklikler histopatolojik analizlerle, epidermis/dermisteki hacim yoğunlukları ise stereolojik yöntemlerle belirlendi. İmmünohistokimya ile Ki-67, NLRP3 inflamazom bileşenleri, Nrf2, Keap1 ve SIRT1'in immünoreaktif yoğunlukları ImageJ ile değerlendirildi. Serum örneklerinde TNF-a, IL-1β, IL-17A, IL-6, IL-22 ve IL-23 seviyeleri ELISA ile ölçüldü. Veriler, IMQ grubuna kıyasla BER, MZKH ve kombine tedavilerin; i) PAŞİ skoru ve epidermal kalınlığı azalttığını, ii) hiper/parakeratozis ve Munro mikroapse oluşumlarını hafiflettiğini, iii) dermal immün hücre infiltrasyonunu ve vaskülarizasyonu azalttığını, iv) epidermal/dermal hacim yoğunluğunu düşürdüğünü ve v) dalaktaki splenomegali, ektstrameduller hematopezi ve beyaz pulpa artışını önemli ölçüde azalttığını göstermiştir. BER, MZKH ve kombine uygulamaların Ki-67, NLRP3, ASC, Kaspaz-1, IL-1β ve Nrf2, Keap1'in immünreaktivite yoğunluğu ile psöriazis ile ilişkili sitokin seviyeleri anlamlı derecede azalttığı ve SIRT1 ifade seviyelerini IMQ grubuna kıyasla önemli ölçüde arttırdığı tespit edildi. Sonuçlarımız, BER, MZKH ve kombine tedavilerin; NLRP3 inflamazom aktivasyonunu baskıladığını, KEAP1/NRF2 sinyal yolunu modüle ettiğini ve SIRT1 aktivasyonunu artırarak psöriazis patogenezini hafiflettiğini göstermektedir. Bulgular, BER'in anti-psöriatik etkilerinin, MZKH'lerin immünmodülatör özellikleriyle birleşerek psöriazis tedavisinde potansiyel bir terapötik ajan olabileceğini ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Bergenin, Mezenkimal Kök Hücre, NLRP3 inflamazomu, Nrf2/Keap1/SIRT1 aksı,Psöriazis
Allojenik mezenkimal kök hücre eksozomlarının üç boyutlu mikroakışkan proksimal tübül platformundaki iskemik akut böbrek hasarında terapötik etkilerinin değerlendirilmesi
Sefa Burak Çam, Allojenik Mezenkimal Kök Hücre Eksozomlarının Üç Boyutlu Mikroakışkan Proksimal Tübül Platformundaki İskemik Akut Böbrek Hasarında Terapötik Etkilerinin Değerlendirilmesi, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Tıpta Uzmanlık Tezi, Ankara, 2022. Yüksek kronikleşme riski ve mortaliteli iskemik akut böbrek hasarında (ABH) hücresel tedavilerin kliniğe aktarılabilmesi için gerçek zamanlı kişiselleştirilmiş modeller gerekmektedir. İnsan kemik iliği mezenkimal kök hücre (Kİ-MKH) eksozomlarının hipoksik proksimal tübül epiteli (PTE) hasarındaki terapötik etkinliği üç boyutlu (3B) dinamik mikroakışkan platformunda ortaya konabilir. Akut hipoksik mikroakışkan düzeneğindeki insan PTE hücrelerinde, ZO-1 ve asetillenmiş α-tübülin immünreaktivitesi, dekstran geçirgenliği, proliferasyon hızı, BNIP3, HO-1, HIF1α, GLUT1 ve GLUT2 gen ifadesi ölçülmüş; proliferatif tedavi penceresi belirlenen insan Kİ-MKH eksozomlarının ED50'de hipoksik hasardaki etkinliği 3B mikroakışkan platformuna uygulanarak değerlendirilmiştir. Mikroakışkan yongası akut hipoksiye bağlı PTE hasarı için optimize edilmiş; karakterize allojenik Kİ-MKH eksozomlarının gerçek zamanlı tedavi penceresi 172.582 µg/ml ve 0-26 saat olarak belirlenmiş; eksozomlar ED50'de mikroakışkan yongasında 24. saatte akut hipokside bozulan bariyer bütünlüğünü düzeltmiş, ZO-1 işaretlenmesini arttırmış, PTE hücrelerini çoğaltmış, BNIP3 ifadesini azaltmış; HO-1, HIF1α, GLUT1 ve GLUT2 ifadelerini artırmıştır. Tez kapsamında optimize edilen hipoksik 3B mikroakışkan PTE platformunda allojenik Kİ-MKH eksozomlarının tedavi penceresindeki etkinliği yapı ve işlev açısından ortaya konmuştur. Yeni ex vivo sistem, nefroloji kliniğinde uygulanacak kişiselleştirilmiş teragnostik adayları doğruladığı için önemlidir.
Primer siliyer diskinezi (PCD) hastalarında dış dynein kolu (ODA) defektleri ile silyum ön yapım proteinlerinin ilişkisinin histolojik olarak araştırılması
Primer siliyer diskinezi (PCD) hastalarında dış dynein kolu (ODA) defektleri ile silyum ön yapım proteinlerinin ilişkisinin histolojik olarak araştırılması, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Uzmanlık Tezi, Ankara, 2022. Primer siliyer diskinezi (PCD), nadir ve otozomal resesif geçişli, sinopulmoner enfeksiyonlar ile karakterize ve motil silyum/flagellumun defektine bağlı oluşan bir hastalıktır. Aksonem yapısında mikrotübül düzenlenmesine sahip olan silyumun içerdiği yapısal proteinlerin PCD'li bireylerin genetik heterojenitesine bağlı olarak defektleri gözlenmektedir. Zinc finger MYND domain-containing protein 10 (ZMYND10); dış dynein kolu (ODA) ve siliyer yapı elementlerinin ön yapımında görevli olan proteindir. GRP78 moleküler bir şaperon olarak çalışmaktır. Bu araştırmaya, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Göğüs Hastalıkları Bölümü'nde klinik ve genetik olarak PCD ön tanısı (ODA defekti) almış yaşları 14-23 olan 8 adet hasta birey dahil edilmiştir. Hastaların nazal sürüntü örnekleri DNAH5-asetile beta tübülin, RSPH9-ZMYND10 ve RSPH9-GRP78 antikorları ile çift işaretleme yapılmıştır ve floresan mikroskopta değerlendirmeler yapılmıştır. İmmünofloresan işaretlemelerinde DNAH5 mutasyonlu hastaların %75'inde; DNAH5 ve ZMYND10 floresan işaretlenmesi gözlenmemiştir. Kontrol ve hastaların DNAH5 ve ZMYND10 düzeltilmiş toplam hücre floresan (CTCF) ölçümlerinin ortalama değerleri arasında anlamlı fark bulunmuştur. Hastaların %63'ünde GRP78 floresan işaretlenmesi gözlenmemiştir ve kontrole göre anlamlı fark bulunmuştur. Bu bulgular sonucunda aynı DNAH5 geninde farklı mutasyona sahip ODA defekti olan hastaların; silyum ön yapımında görevli ZMYND10 ve şaperon proteini olan GRP78 proteinleri ile ilişkisinin olduğu kalitatif olarak gösterilmiştir.
İnsan infrapatellar yağ yastıkçığındaki telosit hücrelerininvarlığının histolojik yöntemler kullanılarak araştırılması
Telositler, mezenkimal kök hücreler gibi davranabilen ve şimdiye kadar tanımlanan projenitör hücreler ile yakın komşulukta olan ve hatta benzer hücre yüzey belirteçleri ekspresse eden yeni bir hücre türü olarak tanımlanmıştır. Telositler önceleri interstisyel Cajal benzeri hücreler (ICLʼler) olarak bilinseler de artık moniliform görünümleri, uzun ve ince telopodları sayesinde onlardan ayırt edilebilmektedirler. Telositler yaygın olarak kemiklerde, iskelet kaslarında, fasyada ve eklem sinoviyumlarında bulunmakla birlikte birçok farklı canlı türüne ait doku ve organlarda da tanımlanmıştır. Bu yeni hücreler, infrapatellar yağ yastıkçığında (İPYY) da bulunmaktadır, ancak literatürde bugüne kadar telositlerin İPYYʼdaki varlığını, lokalizasyonunu, rollerini veya morfolojik karakterizasyonunu açıklayan bir veriye rastlanmamıştır. Telositlerin hücreler arası sinyalleşme, morfogenez ve hemoztazın düzenlenmesinde, ayrıca çeşitli patolojilerde önemli roller oynadıkları gösterilmiştir. Genel olarak CD34, vimentin, PDGRF-α ve -β, c-kit ve α-SMA güvenilir telosit belirteçleri olarak kabul edilmişlerdir. Bu çalışmada, insan diz bölgesinde yer alan İPYYʼdan elde edilecek olan doku örnekleri, travma veya osteoartrit tanısı gibi çeşitli sebeplerle diz protezi ameliyatı olan 10 hastadan operasyon sırasında alındı. İPYY dokuları immünhistokimyasal analizler ile CD34/c-kit, CD34/PDGFR-α ve CD34/PDGFR-ß ikili boyama yöntemleri ile işaretlendi. Bu şekilde telositler, fibroblast ve perisitlerden ayrılarak tamamen farklı hücreler olarak tanımlandı. Eş zamanlı olarak bu hücrelerin ultra yapıları geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile inceledi. Bu tez çalışmasında, insan İPYYʼnda telosit hücre varlığının ilk defa gösterilmesi, İPYYʼın iyi bir telosit hücre kaynağı olabileceğini de ortaya koymaktadır. Bu nedenle çalışmamızın, telosit hücre izolasyonu, karekterizasyonu ve terapötik etkinliklerini araştıran ileri çalışmalara önemli bir rehber olabileceğini ve çeşitli eklem hastalıklarına hücresel tedavi temelli yeni yaklaşımlara ışık tutabileceğini düşünmekteyiz..
Hedeflendirilmiş ilaç yüklü nanopartiküllerin glioblastoma üzerine olan etkilerinin incelenmesi
Oldukça agresif bir primer beyin kanseri olan glioblastomanın güncel tedavisi radyoterapi ve temozolomid (TMZ) ile yapılmaktadır. Ancak TMZ'ye direnç gelişmesi, kanserin tekrarlaması ve mortalite oranının yüksek olmasından dolayı yeni tedavilere ihtiyaç vardır. Bu kapsamda nanopartiküller (NP'ler) yeni tedavi seçenekleri sunabilir. Bu çalışmada TMZ yüklü insan serum albumin (HSA) NP'leri (TMZ&NP) sentezlendi. Glioblastomaya hedeflendirilmek için NP'ler, folik asit (FA), transferin (Tf) ya da aterosklerotik plak (AP) ligandları ile konjuge edildi. NP'lerin etkinliği in vitro ve in vivo olarak glioblastomada araştırıldı. TMZ&NP'ler liganda bağlı olarak C6 glioma hücrelerinde yüksek sitotoksisiteye sebep oldu. TMZ, TMZ&NP ve TMZ&NP-FA C6 sfereoid çaplarının büyümesini engelledi. TMZ, TMZ&NP ve TMZ&NP-AP sfereoidlerde aktif kaspaz-3+ hücrelerini arttırdı. Ortotopik sıçan glioblastoma modelinde TMZ&NP formülasyonlarının Glioma gruplarında vücut artış hızına olumlu etkisi görüldü. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) analizlerine göre TMZ, TMZ&NP, TMZ&NP-FA, TMZ&NP-Tf ve kombine tedavileri tümör boyutunu azalttı. Relatif serebral kan akımı (rCBF); TMZ&NP, TMZ&NP-Tf ve TMZ&NP-AP uygulamaları ile azaldı. Tümördeki hücresel hasar TMZ&NP-FA, TMZ&NP-AP ve kombine NP tedavileri ile arttı. Peritümöral alandaki damar sayısı TMZ&NP-FA ve TMZ&NP-Tf uygulamaları ile azaldı. TMZ&NP, TMZ&NP-FA ve TMZ&NP-Tf tümörün merkezindeki VEGF+ hücreleri azalttı. Ultrastrüktürel analizler NP'lerin neokorteks, hipokampüs, korpus kallozum ve tümör dokularında nöronlar, glia hücreleri, aksonlar, tümör hücreleri ve kan beyin bariyeri (KBB) ile ilişkili yapılara internalize olduklarını kanıtladı. Sonuç olarak bu çalışma aktif hedefleme sistemlerinin önemini vurgulamakta ve NP formülasyonlarının glioblastoma tedavisinde işlevsel bir araç olabileceğini göstermektedir. Bu sistemler insan glioblastoma modellerinde araştırılarak güvenirlikleri ve etkinlikleri ileri düzeyde araştırılmalıdır.
Preeklampsi modeli oluşturulmuş trofoblastlarda GRP75 inhibisyonunun hücre stresi üzerine etkisi
Preeklampsi (PE), ekstravilloz trofoblastlarin (EVT'nin) uterus spiral arterlerine doğru yetersiz invazyonu ile sonuçlanan uteroplasental vasküler disfonksiyon ile karakterize bir hastalıktır. Bu durumda meydana gelen aralıklı arteriyel kan akışı, tekrarlanan iskemi/reperfüzyon ataklarına yol açar. Bunun sonucunda meydana gelen hipoksiye bağlı oksidatif stres gelişir. Hipoksiye bağlı oksidatif stres, plasenta dokusunda ve trofoblast hücre hatlarında mitokondriyal reaktif oksijen türevlerini (mtROS'u) arttırdığı ve mitokondriyal disfonksiyona sebep olduğu bilinmektedir. Ca2+, mitokondri ile ilişkili endoplazmik retikulum (ER) membranları (MAM) aracılığıyla ER'den mitokondriye aktarılır. Ca2+, normalde mitokondriyal oksidatif fosforilasyon için gerekli olsa da aşırı yüklenmesi bu süreci bozar ve daha fazla ROS üretimini tetikleyerek hem mitokondri de hem de ER'de disfonksiyona sebep olur: hücre ölümü tetiklenir. Bu tez çalışmasında, PE modelini taklit etmek için oluşturulacak hipoksiye bağlı oksidatif stres ortamında, trofoblastlardaki Ca2+ transferinin engellenmesi ile hücre canlılığını ve trofoblast invazyonunu arttırarak PE'ye olası bir terapötik yaklaşım geliştirilmesi amaçlandı. Bu doğrultuda, MAM'da bir 'moleküler köprü' olarak görev yapan Glikoz Düzenlenmiş Protein 75 (GRP75) protein ekspresyonun azaltılması yoluyla aşırı Ca2+ transferinin engellenmesi hedeflendi. Projemizde JAR trofoblast hücre hattı kullanıldı. Hücrelere, PE benzeri in vitro hipoksiye bağlı oksidatif stres ortamı oluşturmak için hidrojen peroksit (H2O2), GRP75 ekspresyonun azaltılması için de kimyasal ajan (MKT077) uygulandı. Böylece çalışmamızda 4 grubumuz yer almaktadır: (1) sham, (2) H2O2, (3) H2O2 + MKT077 ve (4) MKT077 grupları. Gruplarda uygulanacak en uygun H2O2 ve MKT077 dozlarının belirlenmesi için EC50 analizi yapılmışdı. MKT077'nin JAR trofoblast hücrelerine olan azaltıcı etkisini değerlendirmek için GRP75 protein ekspresyon seviyeleri, ER stresi belirteci olarak Glikoz düzenleyici protein 78 (GRP78) ve PE biyobelirteçi olarak da çözünür Fms-benzeri tirozin kinaz-1 (sFLT1) ekspresyon seviyeleri tmmünosttoktmyasal olarak analtz edtldt. Ayrıca bu kimyasalın JAR trofoblast hücrelerine olan etkisinin hücre canlılılıkları, hücre göçü ve hücre ölümü açısından analizleri yapıldı. Projemiz, GRP75'in trofoblast üzerindeki etkisini araştıran ilk çalışmadır. Bu çalışmadan elde edilen verilerin, PE'nin altında yatan mekanizmanın aydınlatılmasında ve olası terapötik yaklaşımların geliştirilmesinde etkili olacağı düşünülmektedir.
Parkinson hastalığı hücresel modelinde inflamasyonun ve inflamasyon sonrası uygulanan N-asetilsisteinin H4 hücrelerindeki LAG3 ve TLR2 reseptörleri üzerine etkisi
Parkinson hastalığı, bir çok sistemin etkilendiği nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın prevalansı genel popülasyonda binde 2-3, 55 yaş üzerinde ise %1 oranındadır. Parkinson hastalığındaki patolojik değişiklikler substantia nigra pars compacta'daki dopaminerjik nöronların kaybı ve hücrelerin içinde Lewy cisimciği olarak adlandırılan, ağırlıklı olarak alfa-sinüklein (α-syn) ve ubikutinlenmiş proteinler içeren küresel inklüzyon cisimciklerinin saptanması şeklindedir. α-syn proteinin nöronlarda hatalı katlanmalar sonucu hücre içinde çeşitli yerlerde birikebildiği gibi hücre dışı alana da geçebildiği bilinmektedir. Hücre dışı alana geçen α-syn proteini özellikle nöronlar ve glia hücreleri tarafından hücre içine endositoz yolu ile alınır. Endositozda TLR2 ve LAG3 reseptörlerinin rolünün açıklanabilmesi için çeşitli çalışmalar yapılmaktadır. α-syn proteininin endositozu, TNF-α, IL-1β, IL-2 ve IL-6 başta olmak üzere çeşitli inflamatuar sitokinlerin üretimine ve salınmasına sebep olmanın yanı sıra; hücre içinde mitokondriyal yolak üzerinden apoptoz ve mitofajiyi tetikleyerek hücre ölümünü yol açmaktadır. N-Asetilsistein (NAC), anti-oksidan, anti-inflamatuar ve anti-kanserojen etkilere sahip bir ilaçtır. Bu tez çalışmasında, inflamasyonun tetiklenmesi sonrası, LAG3 ve TLR2 reseptörlerinin ekspresyonunda artış görülebileceği ve inflamasyon NAC ile kontrol altına alındığında, inflamasyonun sebep olduğu hasarın azalması ve hücre canlılığında artış görülebileceği hipotezlerinde bulunuldu. Bu varsayımları test etmek amacı ile; in vitro koşullarda deney ve kontrol grupları içeren bir çalışma planlandı. α-syn proteinini aşırı eksprese eden insan nöroglioma (H4) hücre hattı kullanılarak inflamatuar bir Parkinson hastalığı modeli oluşturuldu. İnflamasyon, TNF-α ile tetiklendi ve NAC uygulanarak inflamasyon kontrol altına alındı. Çalışmada α-syn protein ekspresyonu ve transkripsiyonu, Western Blot ve q-PCR metotları ile ölçüldü. Hücre canlılığı Toxilight testi ile, apoptoz Western Blot tekniği ile apoptoz belirteçlerinin ölçülmesi ve TUNEL immunofloresan işaretleme metodu ile değerlendirildi. TLR2 ve LAG3 reseptörlerinin transkripsiyonları q-PCR metodu ile ölçüldü. Reseptörlerin protein düzeyleri immunofloresan işaretleme ve Western Blot tekniği ile saptandı. Elde edilen veriler ışığında, NAC tedavisinin, TLR2 ve LAG3 reseptörlerinin transkripsiyonunu ve ekspresyonunu değiştirerek inflamasyon aracılı toksisiteyi ve hücre ölümünü azalttığı belirlendi. Bu çalışma ile, NAC'nin Parkinson Hastalığında ortaya çıkan nöroinflamasyon süreci için umut vaat eden bir aday olduğu düşünüldü. Anahtar kelimeler: Parkinson Hastalığı, İnflamasyon, Alfa-sinüklein (α-syn), N-Asetilsistein (NAC), Apoptoz
FF-MAS oksisterolünün folikülogenezdeki rolünün ve hedgehog sinyal yolağıyla ilişkisinin incelenmesi
Folikül sıvısında bulunan ve oosit maturasyonunda etkili bir steroid türevi olan FF-MAS oksisterolünün etki mekanizmasıyla ilgili bilgiler sınırlıdır. Hedgehog yolağı (Hh); folikülogenezde kritik öneme sahip granüloza hücre proliferasyonunda etkili bir sinyal yolağıdır ve oosit matürasyonuna katkı sağlar. Hh yolağının hücrede etkisi, transkripsiyon faktörü Gli1'in aktifleşmesini ve hedef genlerin aktivasyonuyla gerçekleşir. Granüloza hücre proliferasyonundaki yetersizlik sebebiyle foliküler gelişimin ilerleyemediği, sonuçta kistik foliküllerin gözlendiği polikistik over sendromu (PKOS) en yaygın endokrin hastalıktır. Çalışmamızda folikülogenezde etkili FF-MAS Hedgehog yolağı aracılığıyla granüloza hücre proliferasyonunu uyarabileceği varsayılmıştır. Bu araştırmanın amacı insan folikülogenezinde, FF-MAS'in granüloza hücre proliferasyonuna etkisini Hedgehog yolağı molekülleri SMO ve Gli1 üzerinden araştırmaktır. Bunun için; sağlıklı ve PKOS hastalarına ait granüloza hücre kültürlerinde, FF-MAS ve yolak inhibitörü siklopaminin SMO ve Gli1 ifadelerine etkisi değerlendirilmiştir. SMO ve Gli1 immünohistokimya ifadeleri ve kantitatif sitoELİZA değerlendirmeleri ile FF-MAS'in bu ifadeleri artırdığı, yolak inhibitörü olan siklopamin uygulanan koşullarda da ifadelerin istatistiksel olarak anlamlı azaldığı saptanmıştır. Sağlıklı kadınlara ait granüloza hücrelerinin SMO ifade değişimi, yolağın son ürünü olan Gli1 ekspresyon değişiminden daha düşük oranda bulunmuştur. Bu sonuçlar, FF-MAS oksisterolünün Hedgehog yolağını kontrole oranla daha fazla aktive ettiğini göstermektedir. Ayrıca PKOS hastalarının hücreleri FF-MAS'e daha iyi cevap vererek Gli1 ve SMO ifadelerini artırmıştır. Bu veriler daha sonraki çalışmalarda FF-MAS - Hedgehog ilişkisinin in vivo olarak ele alınıp, diğer hücre yolaklarıyla da ilişkisinin değerlendirilmesi gerekmektedir.
Polikistik over sendromunda ekzositoz ilişkili SNARE moleküllerinin granüloza hücrelerinde in-vitro değerlendirilmesi
Polikistik over sendromu üreme çağındaki kadınlarda kronik anovulasyonun en sık nedeni olması ve üremeye yardımcı tedavi ihtiyacı doğurması nedeniyle önemli bir sağlık sorunudur. Membrana granülozayı oluşturan granüloza hücrelerinin sentez yeteneğindeki bozulma veya ekzositoz yeteneğindeki bozulma folikül içi sinyal molekülü miktarındaki disregülasyondan sorumlu olabilir. Bu amaçla ÜYTE kliniğine başvuran çiftlerin erkek faktörü (n=10) ve PKOS (n=10) kadınlarından oosit toplama işlemi sonrası atılan granüloza hücrelerinde "vezikül füzyon proteinleri"nden olan Stx6, SNAP25 ve StxBP1 proteinleri immunofloresan işaretleme yöntemi ile araştırılmış ve elektron mikroskobik inceleme yapılmıştır. Polikistik over sendromunda Stx6, SNAP25 ile StxBP1 düzeyinin azaldığı ve in-vitro ortamda FSH-hCG uyarısı ile bozulmanın düzelmediği görülmüştür. Granüloza hücrelerinin salgıladığı KITL faktörünün de hücre içinde azalmıştır. Elektron mikroskobik incelemede PKOS'ta granüloza hücrelerinin veziküllerinde elektron yoğunluğunun sağlıklı bireylerine göre azalmıştır. Bu çalışmanın sonucunda PKOS'ta, sağlıklı granüloza hücrelerine göre; vezikül miktarının azaldığı, FSH-hCG uyarısına verilen veziküler yanıt bozulmuş ve Stx6, SNAP25, StxBP1 düzeyleri azalmıştır. Sonuç olarak PKOS'ta bozulmuş olan granüloza hücresi kökenli faktörlerin sentezindeki aksaklığın yanında salgılanmasında da bozulma olduğu ortaya konmuştur.
Kanser kök hücre lizatı ile yüklenmiş dendritik hücrelerin antitümör immün yanıtlarının incelenmesi
Kanserin kökü olarak ifade edilen "kanser kök hücre"lerini ortadan kaldırmaya yönelik vücudun kendi savunma hücrelerinin kullanılması, kanser immünterapisinin en önemli devrimlerin birisidir. Kanser kök hücreleri (KKH), kendini yenileme ve tümörü başlatma kapasitelerine sahip eşsiz bir küçük alt popülasyonu temsil etmektedir. Kanser immünoterapisinin temel amacı, KKH'lere karşı güçlü bir bağışıklık tepkisinin uyarılmasıdır. Güçlü ve aynı zamanda karmaşık olan bağışıklık sistemi hücre, doku ve organların birlikteliğini yansıtan bir ordudan oluşmaktadır. Ordunun en önemli üyelerinden biri olan dendritik hücreler (DH), doğal ve adaptif bağışıklık arasında önemli bir köprü gören profesyonel hücrelerdir. Matürasyon sürecini takiben, DH'ler anti-tümör yanıtlarının indüksiyonu ve sürdürülmesinde merkezi rol oynamaktadır. Bununla birlikte, kanser hastalarında DH-bazlı tedavinin terapötik etkinliği yeterince tatmin edici değildir ve yeni stratejilerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. DH'lerin yüzeyinde bulunan sialik asitler antijenlerin alınması, işlenmesi, T-hücrelerine sunulması ve immünolojik sinapsların oluşturulmasında oldukça kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada, i)sialik asitleri uzaklaştırıldıktan sonra KKH antijenleri ile muamele edilerek matüre edilen DH'lerdeki değişikliklerin çeşitli yönlerle incelenmesi, ii) KKH'lerine karşı immün yanıtın değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Meme kanser kök hücreleri (CD44+/ CD24-/low) floresanla aktive hücre ayırma (FACS) cihazı ile izole edildikten sonra KKH antijenleri içeren lizat elde edilmiştir. Kemik-iliğinden izole edilen DH'ler CD11c kullanılarak karakterize edilmiştir. DH'lerin yüzeyindeki sialik asitler nöraminidaz yardımıyla uzaklaştırıldıktan sonra KKH lizatı ile muamele edilmiştir. KKH lizatının dendritik hücreler üzerine olan etkileri canlılık, apoptoz ve hücre döngüsü analizleri yapılarak değerlendirilmiştir. İmmatür (imDH) ve matür (mDH) hücrelerdeki CD40, CD80 ve CD86 gibi kostimülatör moleküllerdeki değişimler akım sitometrisi kullanılarak analiz edilmiştir. Çeşitli sinyal yolakları ile ilişkili genler PCR ile incelenmiştir. Dendritik hücrelerde meydana gelen biyokimyasal değişimler (glikojen, lipid, protein, nükleik asit) ATR-FTIR yardımıyla analiz edilmiştir. Hücrelerde meydana gelen morfolojik değişimler SPM ve histokimyasal boyamalar ile incelenmiştir. Hücrelerdeki IL-12 üretimindeki değişimler ELISA yöntemi ile analiz edilmiştir. In vivo çalışmalarında, meme kanser modeli oluşturularak imDH ve mDH'lerin immün yanıt etkileri çeşitli parametreler ile değerlendirilmiştir. Çalışmadan elde edilen veriler, imDH'lere ile kıyaslandığında mDH'lerin daha etkili immün yanıt oluşturduğunu göstermiştir. KKH antijenleri ile muamele edilen DH'lerin podozom yapılar oluşturduğu ve aktin, gelsolin, talin, Arp/2, WASp gibi hücre iskelet elemanlarının antijen alınımında etkin rollerinin olduğu gösterilmiştir. Matürasyon aşamasından sonra, CD86, CD80 ve CD40 kostimülatör moleküllerde artış tespit edilmiştir. DH'lerin farklılaşma ve fonksiyonu ile ilişkili Notch, MAPK ve interlökin sinyalizasyonunda önemli değişimler meydana gelmiştir. Nükleik asit, lipid, karbonhidrat ve protein yapılarında önemli farklılıkların olduğu ve matürasyonda lipit dropletlerinde azalış glikojen miktarında artışın olduğu tespit edilmiştir. Morfolojik analizler hücre büyüklüğü, yüzey alanı, pürüzlülük özelliklerin değiştiğini göstermiştir. Matürasyondan sonra, IL-12 üretiminde artış meydana gelmiştir. Anti-tümör immün yanıtlarının incelenmesi için yapılan kanser modelinde, mDH ile aşılanan farelerde tümör hacmi ve ağırlığında önemli bir azalmanın olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, proliferasyon ile ilişkili belirteçlerde azalma, apoptotik indekste ise artış belirlenmiştir. imDH ile kıyaslandığında, mDH'lerde CD4 ve CD8 oranlarında önemli artışların olduğu belirlenmiştir. mDH ile aşılamanın metastazı engellediği gösterilmiştir. Epitelial mezenkimal geçişle ilişkili Snail, Slug ve Twist gibi belirteçlerin ifadelerinde azalma tespit edilmiştir. Çalışmadan elde edilen veriler, sialik asit uzaklaştırma ve KKH antijenleri ile etkileşimin DH'lerde önemli moleküler, biyokimyasal, morfolojik ve fonksiyonel değişimler yarattığını göstermiştir. Bu değişimler, DH'lerin anti-kanser immün yanıtlarının artırılmasına katkı sağlamıştır. Anahtar Kelimeler; kanser kök hücre; dendritik hücre aşısı; immünterapi; sialik asit; matürasyon; immün yanıt
Siklofosfamid ile oluşturulan deneysel sıçan testis hasarı modelinde resveratrolün etkilerinin çinko ile karşılaştırmalı olarak incelenmesi
Amaç; CP ile oluşturulan deneysel testis hasarı modelinde Resveratrol (RES)'ün olası koruyucu etkisinin Çinko (Zn) ile karşılaştırmalı olarak incelenmesidir. Çalışma kapsamında RES, Zn ve RES-Zn birlikte uygulamaları ile CP'nin hasar oranının azaltılması hedeflendi. CP ile oluşturulan toksik testis hasarı modelinde, Zn etkileri gösterilmiş bir kontrol model olarak yer alırken, RES'in Zn ile birlikte kullanılması sonucunda ortaya çıkan etkilerin taramalarında bakılmamış olduğunu saptadık. Çalışmamızda sıçanlar (n=64) rastgele 9 gruba ayrıldı. Deney gruplarına 3 haftalık uygulamaların sonunda tüm gruplar; biyokimyasal, histokimyasal ve immünohistokimyasal yöntemlerle incelendi. Sperm parametreleri olarak Johnsen testiküler skorlaması ve sperm yayma preparatlarındaki morfolojileri değerlendirildi. CP ile oluşturulan deneysel sıçan testis hasarı modelinde histokimyasal olarak H-E, PAS ve MT, immünohistokimyasal olarak iNOS, eNOS ve CD34 boyamaları yapıldı. Biyokimyasal analiz olarak da MDA ve Katalaz değerlerine bakıldı. RES ve Zn'nin karşılaştırmalı etkileri literatürde ilk kez tarafımızdan ortaya konulmaya çalışıldı. Sonuç olarak; Zn ve RES'in birlikte kullanımının testis hasarı üzerine koruyucu etkileri mevcut olsa da kontrol ve salin grupları kadar iyileşme gözlemlenmedi. Yeni bir hücre türü olan telositlerin ise interstisyel alandaki varlıkları ve seminifer tübül çevresini bir kılıf gibi sardığı saptanmıştır. Projemizde optimum dozlarda vücutta yararlı etkilerini ortaya çıkartabilen RES ve Zn'nin birlikte ve/veya ayrı kullanımlarının oluşturduğu etkileşimler değerlidir. Kurgulanan in vivo modelin kliniğe uyarlamaları, tanımlanacak hücresel sinyal yolakları üzerinden tedavi amaçlı pek çok uygulamada infertilitenin sağaltımı konusunda yeni klinik fikirler ortaya çıkarabilir. Anahtar Kelimeler: Siklofosfamid, Resveratrol, Çinko, Testis
Glioblastoma multiforme ve glioblastoma multiforme kanser kök hücreleri ile astrosit ko-kültürlerinde, siklopamin inhibisyonu ile sonıc hedgehog sinyal yolağı ve ilişkili mekanizmalarda karşılıklı bağlantıların moleküler yöntemlerle araştırılması
Kanser, bir grup hücrenin kontrolsüz bölünme, invazyon ve metastaz gibi özellikler sergileyerek oluşturduğu bir hastalıktır. Embriyogenez sırasında da kontrollü hücre bölünmesi, hücre farklılaşması, hücre göçü ve programlanmış hücre ölümü görülür. Embriyo gelişimi ve tümör oluşumu, hücre göçü, invazyon, hücre farklılaşması ve immün cevaptan kaçabilme gibi benzer hücre davranışları sergileyebildikleri gibi bu iki tip hücrenin gen ekspresyonu, protein profilleri, sinyal yolakları da benzerdir. Hedgehog gen ailesi üyelerinden Sonic Hedgehog (Shh) sinyal yolağı, hem embriyogenez hem de karsinogenezde aktif olabilen önemli sinyal yolaklarından biridir. Bu yolaktaki aktivasyon artışları ile medulloblastoma, rabdomyosarkoma, kolorektal karsinoma gibi birçok kanser tipi ortaya çıkabilir. Glioblastoma multiforme (GBM), erişkin insanlarda en sık görülen primer kötü huylu beyin tümörü olup uzak organ yayılımı olmasa da oldukça hızlı büyüyen infiltratif bir tümördür. Tümörler heterojen hücrelerden oluşmakta olup; tümör kitlesi içinde kök hücreler gibi kendini yenileme ve farklılaşma özellikleri bulunan, radyoterapi, kemoterapiye dirençli olan, uzak organ yayılımları yapabilen ve kanser rekürrensinde etkisi olduğu düşünülen kanser kök hücreleri (KaKH) de bulunmaktadır. GBM'li olguların tümör kitleleri içinde de kanser kök hücreleri tanımlanmıştır ve bu hücreler prognozun kötüleşmesine neden olabilirler. Son yıllarda GBM tedavisi için Hedgehog sinyal yolağı önemli bir hedef haline gelmeye başlamıştır. Siklopamin, Smoothened (Smo) reseptörüne bağlanarak Shh sinyal yolağının inhibe edilmesinde kullanılan ve hayvan deneyi çalışmalarında gliomalar, pankreatik ve kolon karsinomlarında tümör büyümesini de inhibe ettiği gösterilen önemli bir ajandır. GBM ile ilgili çeşitli ko-kültür ve mikro-çevre araştırmaları ise henüz yeterli değildir. Literatür bilgilerine dayanarak, Sonic Hedgehog sinyal yolağının embriyonik dönemde önemli bir rol oynadığı bilinmekte, kanser ve kanser kök hücrelerinde de aktif olduğu ve tedavi direncinde de etkili olabileceği düşünülmektedir. Literatür bilgileri ışığında, çalışmamız ile GBM ve GBM kanser kök hücrelerinin astrositler ile ko-kültüre edilmesi ve bu ortamda Shh sinyal yolağının etkisi ve bu yolağın inhibe edilerek sonuçların değerlendirilmesi planlanmıştır. Ko-kültür ortamında hücre-hücre etkileşimleri değerlendirilip GBM ve GBM kanser kök hücrelerinde aktive olan Shh sinyal yolağını astrosit varlığında siklopaminin inhibisyon etkisinde bir değişim olup olmadığı aynı zamanda hücrelerin parakrin olarah Shh protein salgılayabilme özellikleri araştırılarak hücre-hücre etkileşimlerinin de Shh sinyal yolağının siklopamin ile inhibisyonu üzerine olumlu ya da olumsuz etkisi olup olmadığı sorusuna cevap aranmıştır. Sonuç olarak GBM ve GBM kanser kök hücrelerinde Shh sinyal yolağı inhibe edildiğinde beraberinde etkilenebilecek apoptoz ve hücre siklusu gibi hücre içi mekanizmalarındaki değişimler PCR, immünofloresan, ELISA, TUNEL, hücre siklusu analizi gibi yöntemlerle araştırılmıştır. Siklopamin, Shh yolağını baskılamada etkili bir ajandır; tek başına yeterli derecede hücre ölümüne neden olamasa da; GBM ve GBM KaKH'lerinde Shh yolağı aktivasyonunun görülmesi, kombine kanser terapilerinde Shh yolağının baskılanması gerekliliği ortaya koymuştur. GBM ve GBM KaKH kontrol gruplarının sonuçları ve siklopaminden etkilenmeleri RNA ve protein düzeyinde birbirlerinden farklıdır. Bu hücreler ile ko-kültür uygulandığında çoğu zaman farklı sonuçlar elde edilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda özellikle tekli hücre kültürü ve ko-kültür sonuçlarının farklılığı ele alındığında, hastalıklarda ve tedavilerinde mikro-çevre etkisinin önemi ortaya koyulmuştur.
Sıçan over dokusu vitrifikasyonunda plateletten zengin plazma (PRP) eklenmiş dondurma solüsyonunun etkilerinin histolojik olarak incelenmesi
Kanser veya kanser dışı nedenlerle gonadotoksik tedavi alacak özellikle prepubertal çağdaki hastalar ve fertilite arzusunu ertelemek isteyenlerde doğurganlığın korunabilmesi günümüz şartlarında mümkündür. Gelişen tedavi protokolleri ile bazı kanserlerde kür sağlanmakta ancak alınan kemoterapötik ilaçlar ve/veya radyoterapi sonrası ovaryan disfonksiyon kaçınılmaz olmaktadır. Fertilitenin korunması için oosit ve embriyo kriyoprezervasyonu gibi yöntemler seçenekler arasında bulunmaktadır ancak bu işlemlerde önceden stimülasyon protokollerine ihtiyaç duyulmaktadır. Hızlıca kemoradyoterapi başlanması gereken hastalarda ovaryan stimülasyon işlemlerine vakit kalmamaktadır. Söz konusu durumlarda ovaryan kriyoprezervasyon alternatif bir tedavi seçeneği sunmaktadır. Günümüzde over doku kriyoprezervasyonu sonucu sağlıklı gebelikler bildirilmiştir. Over doku kriyoprezervasyonu işleminin başarılı örnekleri literatürde mevcut olmakla birlikte hala deneysel çalışma olarak nitelendirilmekte ve prosedürlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Kriyoprezervasyon ve kriyoprotektan ajanlardan kaynaklanan hücresel hasarın azaltılmasında çeşitli maddeler denenmiş ve olumlu sonuçlar elde edilmiştir. Kriyohasarı azaltmak amacıyla plateletten zengin plazmanın kullanılabilirliği çalışmamıza konu olmuştur. Plateletten zengin plazma (PRP), plateletlerin yoğunlaştırılmasıyla elde edilen bir kan ürünüdür. İçeriğindeki zengin büyüme faktörleri sayesinde rejeneratif tıpta oldukça fazla kullanım alanı bulmuştur. Besiyerlerine eklenen hücresel fonksiyonlarda destekleyici görev gören fetal sığır serumunun (FBS) alternatifi olarak PRP kullanılması ile hayvansal maddelerin veya enfeksiyöz patojenlerin geçişi elimine edilmektedir. Ayrıca PRP'nin otolog kullanılması nedeniyle immün reaksiyon ihtimali azalmaktadır. Kriyoprezervasyon tekniklerinin geliştirilmesi adına literatürde ilk defa sıçan bütün over doku kriyoprezervasyon işleminde vitrifikasyon solüsyonuna PRP eklenerek dokular dondurulmuştur. Dokular kontrol (Grup 1), vitrifikasyon solüsyonuna PRP eklenerek dondurulan PRP eklenmiş (Grup 2) ve vitrifikasyon solüsyonuna FBS eklenerek dondurulan PRP eklenmemiş (Grup3) olarak gruplandırıldı. Çözme sonrası dokular histokimyasal, immünhistokimyasal ve immünfloresan boyama yöntemleri ile boyanarak incelendi. Histokimyasal boyama yöntemi ile HE, PAS ve Mallory Trikrom boyamaları yapıldı. İmmünfloresan boyama yötemiyle kaspaz 3 ekspresyonuna ve TUNEL analizine bakıldı. İmmünhistokimyasal boyama yöntemiyle konneksin 43, Bax, Bcl-2 ve kaspaz 3 ekspresyonu incelendi ve TUNEL analizi yapıldı. Sonuçta kontrol grubu ile karşılaştırıldığında gerek Grup 2'de gerekse Grup 3'te vitrifikasyona bağlı dejenerasyonların olduğu görülmüştür. Ancak Grup 2'de PRP'yi aktive etmek için kullanılan CaCl2'ün vitrifikasyonun zararlı etkilerini agreve ederek over dokusunda görülen dejenerasyonu arttırdığı ve PRP'nin muhtemel olumlu etkilerini önlediği tespit edilmiştir. Her iki deney grubunda da primordiyal foliküllerin korunmuş olduğu ancak foliküler gelişimin ileri aşamasındaki foliküllerde dejenerasyonun artmış olduğu dikkati çekti. Elde edilen bulgular ışığında sıçan over dokusu kriyoprezervasyonunun bütün over dokusu yerine kortikal parçalar halinde yapılması, PRP aktivasyonu için CaCl2 yerine başka metodların uygulanması, vitrifikasyon solusyonlarına CaCl2 eklenmemesi, PRP'nin kriyoprezervasyondaki muhtemel yararlı etkilerinin gösterilmesi ve standardizasyonunun sağlanması için CaCl2 ile aktive edilmemiş PRP'nin hem vitrifikasyon hem de yavaş dondurma yönteminde uygulanarak sonuçlarının analiz edilmesi gerektiği kanaatine vardık.
Yardımlı üreme teknikleri ile elde edilen bos taurus embriyoları üzerine, yavaş dondurma ve melatoninin etkilerinin histolojik yöntemler ile incelenmesi
Büyükbaş hayvancılıkta yardımlı üreme teknikleri (YÜT) in vitro'da embriyo üretimiyle, yüksek verim kabiliyetine sahip hayvan ırklarının devamlılığı sağlanabilmektedir. Mezbaha kaynaklı oositlerin YÜT kullanılarak, değişik hayvan türlerinde farklı kriyoprezervasyon yöntemleri ile yapılan çalışmalarda, embriyoların uzun süreler saklanabilmesi ve yüksek bir fertilite oranı hedeflenmektedir. Ancak kriyoprotektanlara maruz kalma süreleri ve onların toksisite düzeylerindeki farklılıkları sebebiyle, embriyo yapılarında, donma-çözme sırasında oluşabilen buz kristallerine bağlı olarak embriyoların zona pellucida'sında kırılma, hücre membranları ve iskeletinde hasar meydana gelebilmektedir. Hasarları az miktarlara çekebilmek adına bu çalışmada YÜT ile elde edilen Bos taurus embriyoları üzerine, yavaş dondurma sonrası melatoninin etkileri histolojik yöntemlerle incelenmiştir. Mezbahadan elde edilen Holstein (Bos taurus) cinsi 4-8 yaş aralığındaki sağlıklı sığırlardan alınmış overlerden folikül aspirasyon yöntemi ile elde edilmiş olan oositler in vitro maturasyon işlemine alınmıştır. Ticari olarak satın alınmış olan dondurulmuş boğa spermleri ile IVF (İn vitro Fertilizasyon) işlemi uygulanan oositler, melatonin katkısı ve slow freezing işleminin ardından, -196 °C'deki sıvı azot içinde 1 gün süreyle saklanmıştır. Kriyoprezervasyonun olası etkilerini histolojik yöntemler ile incelenmek amacıyla 1 gün sonra çözdürülen embriyolar, histolojik takip prosedürlerinden sonra lipit tespiti amacıyla Azur II-Metilen Blue-Basic Fuksin Boyama, nükleus ve organel dağılımlarının gözlenmesi amacıyla da Toluidine Blue boyanarak ışık mikroskop altında incelenmiştir. Embriyo canlılığı ve total hücre sayımı tespitleri de ek olarak hoescht boyaması yapılarak floresan mikroskop ile incelenmiştir. Kontrol grubu embriyolarının sınırları belirgin, Benzer büyüklüklerde blastomer yapıları içerdiği, blastomerler arasında geniş subzonal alanların varlığı, blastomerleri çevreleyen zona pellucida sınırlarının belirgin olduğu ve fragmantasyon içermedikleri saptanmıştır. Slow freezing grubu embriyolarda; blastomer sınırlarında düzensizleşme, fragmantasyon benzeri oluşumlar ve/veya dejenerasyonlar gözlenmiştir. Slow freezing grubuna ait embriyolarda sitoplazma içinde yer yer vakuoalizasyonlar, interblastomer ve subzonal aralıklarda hücresel atıklar belirlenmiş ve blastomer yapıları içerisinde dağınık şekilde yer alan farklı büyüklük ve sayıda lipit damlacıkları görülmüştür. Melatonin uygulaması yapılmış ve yapılmamış gruplar kıyaslanarak; embriyolarda yarıklanma ve slow freezing sonrası blastosiste gitme oranları incelenmiş ve sayısal verilerle gösterilmiştir. Floresan mikroskop ile canlılık oranları saptanmıştır. IVF ve slow freezing işlemi sırasında ortaya çıkan ROS (Reaktif Oksijen Türleri)'un lipit ve proteinlerde meydana getirdikleri hasara bağlı olarak zar geçirgenliği geri dönüşümsüz olarak bozulmasının azaltılması için kültür ortamına uygun doz ve miktarda antioksidan melatonin eklenmesinin embriyo gelişimi açısından yararlı olabileceği düşünülmüştür. Daha fazla veri üretmek ve daha da güvenilir sonuçlar elde etmek için daha fazla araştırmalar gerekmektedir.
Gebelik ve laktasyon döneminde aflatoksin b1 uygulanan sıçanların yeni doğanlarında karaciğer üzerine genotoksik etkilerin histolojik olarak araştırılması
Aflatoksinler, gıda ürünlerinin hatalı ve/veya yanlış ortamlarda kurutulmaları sonucunda Aspergillus sp. tarafından sentezlenen ve ortama salınan bir çeşit mantar toksini olup gıda güvenliğinde önemli rol oynamaktadır. Aflatoksin B1 (AFB1)'in son yıllarda transplasentasyonel ve laktasyonel geçişi ile genotoksik etkileri çeşitli araştırmalarda bildirilmekle beraber; karaciğer gelişimsel etkileri ile ilgili karşılaştırmalı çalışma yeterli değildir. Çalışmamızda, deneysel olarak maternal sıçanlara AFB1 (50 μg/kg i.p.) uygulamasının plasental geçiş ile yenidoğanlara ve laktasyon sürecinde maternal AFB1 uygulaması ile 21 günlük postnatal sıçanların karaciğerleri üzerine genotoksik potansiyel olası etkilerin dört ayrı grup halinde planlanarak. (Kontrol grupları: Yenidoğan, Laktasyon grubu; Deney grupları: AFB1 Yenidoğan ve Laktasyon grubu) histolojik olarak araştırılması amaçlanmıştır. Karaciğer histolojik değişikliklerin incelenmesi için hematoksilen-eozin, Mallory-azan, periyodik asit-Schiff (PAS) boyamaları, immunohistokimyasal olarak proliferasyonu belirlemek PCNA, apopitoz için immunofloresan TUNEL boyamaları ile proliferasyon ve apopitotik indeksleri oluşturulmuştur. Ayrıca progenitor hücreler için CK19 ve erken dönem hepatokarsinom (HCC) için AFP immuno boyanma yoğunluğu değerlendirmeleri Hscore'ları elde edilmiş ve biyokimyasal olarak karaciğerlerde malondialdehit ve katalaz analizleri yapılmıştır. Bulgularda, vücut ağırlıkları ve karaciğer ağırlıkları karşılaştırıldığında sadece yenidoğan deney gruplarında anlamlı azalma (p<0,001), saptanmıştır. Işık mikroskobik değerlendirmelerde AFB1 yenidoğan deney grubunda sinüzoidal yapılarda yer yer genişleme şeklinde dilatasyon, endotel bütünlüğünün kaybolduğu, kordon yapılarında bozulma ile birlikte hematopoetik hücre toplulukları saptandı. Vena santralis endotel yapısının bazı alanlarda yer yer bütünlüğünün bozulduğu, hepatositlerde vakuolizasyon yapısının arttığı, sitoplazmada daha yoğun lipit yapılarının bulunduğu, piknotik nukleuslu hepatositler ile çok nukleuslu soluk hücre toplulukları saptanmıştır. Portal alanlarda bağ dokusunda yer yer lenfosit infiltrasyonu ile birlikte Vena santralis periferindeki bağ dokususunda hafif artış, daha az yoğun PAS pozitif alanlar saptandı. Laktasyon AFB1 deney gruplarında sinüzoidal yapıda genişleme, Vena santralis bütünlüğünün bozulduğu santral alanlar, hepatositler soluk renkli yoğun vakuoler yapı ayırt edildi. Ayrıca, perivasküler bağ dokusu alanlarında kollajen lifleri daha belirgindi. Yenidoğan AFB1 deney grubunda vena santralis çevresinde özellikle II endotele komşu alanlarda daha yoğun olmak üzere TUNEL pozitif boyanma görülürken apoptotik indekslerde yenidoğan deney grubunda istatistiksel olarak önemli düzeyde anlamlı bir artış (p<0,001) saptanmıştır. PCNA, Proliferatif indeks sonuçlarında ise tüm deney gruplarında anlamlı azalma ile birlikte, yenidoğan ve laktasyon grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur. CK19 immunoreaktivitesinin her iki deney grubunda da kontrole göre anlamlı azaldığı, AFP immunoreaktivitesinde ise yenidoğan ve laktasyonda AFB1 grubunda istatistiksel olarak anlamlı arttığı (p<0,001) bulunmuştur. Deney grupları birbiriyle karşılaştırıldığında yenidoğan deney grubu anlamlı olarak artış saptanmıştır. Yenidoğan AFB1 grubunda kontrole göre MDA düzeyinde istatiksel olarak anlamlı düşme ile birlikte CAT düzeyinde anlamlı yükselme; laktasyon deney gruplarında MDA ve CAT'da anlamlı yükselme saptandı. Sonuç olarak; maternal uygulanan AFB1'in anne sütünden daha fazla etkili olarak transplasental geçişle yenidoğanlarda intrauterinal gelişim geriliği ile birlikte histopatolojik değişikliklere yol açtığı ayrıca genotoksik etkilerle apoptotik hücre ölümünü, erken dönem karaciğer hepatoselüler karsinoma yol açabileceği ve hepatik kök hücrelere etkisi ile proliferasyonu azalttığı düşünülmektedir.
Deneysel polikistik over sendromu (pkos) modelinde tamoksifen ve klomifenin ovaryum dokusu üzerine etkilerinin otofajik açıdan değerlendirilmesi
Polikistik over sendromu (PKOS), menstrüel disfonksiyon, hiperandrojenizm, hirsutizm, infertilite ve polikistik overlerle karakterize endokrin bir bozukluktur. Üreme çağındaki kadınların %5 ila %10'unu etkileyen bu hastalık anovulasyon nedeniyle ortaya çıkan infertilitenin en önemli sebeplerinden biridir. PKOS'un neden olduğu infertilinin tedavisinde en sık kullanılan ilaç olan klomifen, hipotalamusta bulunan östrojen reseptörlerine bağlanarak östrojenin negatif feed-back mekanizmasını engeller. Bu durum FSH hormonunun artmasına neden olarak ovulasyonun gerçekleşmesini sağlar. Tamoksifen, Klomifen gibi nonsteroid selektif östrojen modülatörüdür ve yapısal olarak klomifene benzerdir. Esas olarak meme kanseri tedavisinde kullanılsa da ovulasyon indüksiyonu için yapılan çalışmalarda Klomifenle benzer ovulasyon ve gebelik oranlarına ulaşılmıştır. Çalışmamızda, 21 gün boyunca gavaj yöntemiyle 1mg/ kg Letrozol verilerek oluşturulan PKOS modelinde, grup ismine bağlı kalınarak dişi sıçanlara 5 gün boyunca Tamoksifen ve Klomifenin uygulaması yapılmıştır. Uygulama süresinin sonunda sakrifiye edilen hayvanlardan alınan ovaryum dokuları, histokimyasal, immünohistokimyasal boyamalar ve Real time-PCR (RT-PCR) tekniği ile analiz edilmiştir ve bu ilaçların ovaryum dokusu üzerine etkinliklerinin, otofaji yolağıyla ilişkisi araştırılmıştır. Yaptığımız çalışmada immünohistokimyasal boyamalar ve RT-PCR analizlerinde, tamoksifen ve klomifen gruplarında LC3 ekspresyonunun arttığı, mTOR ekspresyonunun azaldığı gözlemlenmiştir. Bu bulgulara dayanarak, tamoksifen ve klomifenin PKOS'lu ovaryumlarda, otofajiyi indükleyabileceği sonucuna vardık.
Fotoduyarlılaştırıcı olarak schiff baz ligand kompleksleri kullanılan fotodinamik terapinin insan meme kanseri hücre hattı MCF-7 üzerinde anti-kanser etkisinin incelenmesi
Günümüzde meme kanseri kadınlarda görülen en sık ölüm nedenlerinden birisidir. Meme kanseri tedavisinde kullanılan sisplatinin ciddi yan etkileri olması nedeniyle son zamanlarda fotoaktif ajanlar ile Fotodinamik Terapi (FDT) önemli hale gelmiştir. FDT; ışık, fotoduyarlılaştırıcı ve oksijen ile etkisini gösterebilen alternatif tedavidir. Çalışmamızın amacı, MCF-7 hücrelerine 3 farklı ajan uygulandıktan sonra LED ışık kaynağı ile 15 J/cm2'de ışınlanarak 72 saat inkübasyon sonunda olası antitümör aktivitesini ve etki mekanizmasını sisplatin ile kıyaslayarak ortaya koyabilmektir. Çalışmada sisplatinin ile yeni sentezlenen 2 farklı yapıda Paladyum konjuge schiff baz ligandı kullanıldı. Çalışmamızda MCF-7 hücrelerine uygulanan ajanların hücre içindeki birikimi zamana göre test edildi. MTT analizi ile ajanların uygulanacak dozları belirlendi. Daha sonra ışık gören (kontrol, 25 μM sisplatin, 12,5 μM sisplatin, 25 μM kompleks-1, 12,5 μM kompleks-1, 50 μM kompleks-2 ve 25 μM kompleks-2 grubu) ve ışık görmeyen (kontrol, 25 μM sisplatin, 12,5 μM sisplatin, 25 μM kompleks-1, 12,5 μM kompleks-1, 50 μM kompleks-2 ve 25 μM kompleks-2 grubu) gruplar oluşturuldu. MCF-7 hücrelerine uygulanan ajanların en yüksek seviyedeki hücresel alımın 12. saatte olduğu izlendi ve inkübasyon süresi 12 saat olarak belirlendi. Tüm gruplarda hücre ölümü için Anneksin V ile boyama, apoptoz için kaspaz-8 ve kaspaz-9 ile immünfloresan işaretleme yapıldı. Ayrıca DCFDA kiti ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyesi değerlendirildi. MTT bulgularımız ile sisplatin, kompleks-1 ve kompleks-2 aracılı FDT'nin sitotoksiteyi önemli ölçüde arttırdığı saptandı. Işık görmeyen ve ışık gören gruplar arasında ROS seviyesi önemli derecede farklılık gösterdi. Sisplatin ve kompleks-1 aracılı FDT uygulaması sonrası kaspaz-8 ve kaspaz-9 immünfloresan işaretlenme ile apoptotik ve nekrotik hücre ölümü saptandı. Kompleks-2 aracılı FDT uygulaması sonrası ise kaspaz-8 ile immünfloresan işaretlenme ve hücre ölümü görülmedi. Ayrıca kompleks-2 aracılı FDT'de düşük düzeyde kaspaz-9 floresan işaretlenme saptandı. Sonuç olarak, MCF-7 hücrelerinde kompleks-1 aracılı FDT'nin, potansiyel bir antikanser etkiye sahip olduğu görüldü. Ancak kompleks-2 aracılı FDT'nin tek başına küratif bir etkiye sahip olmadığı görüldü.
Pentoksifilin ve platelet aktive edici faktör uygulama sonrası spermatozoada meydana gelen ultrastrüktürel değişikliklerin kıyaslanması
Günümüzde evli çiftlerde yaklaşık olarak % 10-15 oranında infertilite görülmekte olup etiyolojik nedenler göz önüne alındığında % 40-50 kadarında erkek faktörüne rastlanmaktadır. Erkeğe bağlı infertilite problemi, düşük sayıda spermatozoon üretimi, spermatozoon motilitesinde azalma veya spermatozoon morfolojisinin yetersiz oluşu gibi özelliklerin tek başına veya bir kaçının birlikte görüldüğü durumlarda ortaya çıkar. İlk in vitro fertilizasyon (IVF) bebeğinin 1978'de doğumundan beri yardımla üreme teknikleri (YÜT)'nin uygulanma endikasyonları ve başarı oranları giderek artmıştır. Tüp bebek uygulamalarında bilim adamlarının üzerinde durduğu yegane durumlardan biri döllenme oranını arttırabilmektir. Bu yüzden in vitro fertilizasyon (IVF) uygulamalarında canlı spermatozoon seçimi önemlidir. Bunun için birçok yöntem ve farklı ajanlar kullanılmaktadır. Bu ajanlar içinde yaygın kullanım alanı bulanlar pentoksifilin (PF) ve platelet aktive edici faktör (PAF)'dür. Yapmış olduğumuz bu çalışma ile in vitro fertilizasyon (IVF) uygulamalarında kullanılan bu alternatif ajanların spermatozoon motilitesi ve ince yapısı üzerindeki etkilerini incelemeyi amaçladık. Bu nedenle çalışmamızda normozoospermik semen örneklerinden elde edilen spermatozoonlara pentoksifilin (PF) ve platelet aktive edici faktör (PAF) ile muamele edildi. Spermatozoonların membran yapısındaki glikokaliks, rutenyum red boyası ile belirginleştirilip örnekler geçirimli elektron mikroskobunda (TEM) kıyaslanarak incelendi. Ayrıca herhangi bir ajanla muamele olmamış kontrol grubu oluşturularak, pentoksifilin (PF) ve platelet aktive edici faktör (PAF) uygulanmış gruplarla karşılaştırıldı. Sonuç olarak çalışmamızda spermatozoonların pentoksifilin (PF) ve platelet aktive edici faktör (PAF)'e maruz kalmasının spermatozoon baş ve kuyruk yapısındaki olumsuz etkileri gösterilmiştir.
Piezoelektrik ve stronsiyum metodlarının oosit aktivasyonu üzerine etkilerinin ultrastrüktürel incelenmesi
Üreme; dünyadaki tüm canlı türlerinin genetik özelliklerini bir sonraki nesillerle aktarmaları ve kendi devamlılıklarını sağlamaları için gerekli vazgeçilmez bir olgudur. İnfertilite giderek yaygınlaşan önemli bir problem olarak pek çok çiftin karşısına çıkmaktadır. İnfertilitenin %50 oranında kadına bağlı problemlerden kaynaklandığı bilinmektedir. Başarılı tedavi olasılığını ve üreme üzerindeki temel çalışma olanaklarını arttıran in vitro fertilizasyon ve yardımcı üreme tekniklerinin gelişmesi ile infertilite alanında önemli yenilikler meydana gelmiştir. Oosit aktivasyonu problemi olan olgularda oosit aktivasyonunu sağlamaya yönelik çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Oosit aktivasyonunda en önemli olay hücre içi Ca^(+2) konsantrasyonundaki geçici artıştır. Ca^(+2) artışı olmaması aktivasyonu önlediği için infertiliteye sebep olabilmektedir. Bu yöntemler ile yapılan çalışmalar da oosit aktivasyonunun uyarılması ile elde edilen gebelikler rapor edilmiştir. Piezoelektrik ve stronsiyum muamelesi bu yöntemler arasında yer almakta olup çalışmamızda da bu iki yöntemin hücre üzerindeki etkilerini ortaya koymak adına ele aldık. Stronsiyum, fertilizasyon sonucu sperm ile uyarımı taklit ederek uzun süreli kalsiyum dalgalanmaları meydana getirmektedir. Çalışmalarda; sperm kaynaklı fosfolipaz C aktive edildiğinde, fosfotidilinositol 4,5-bifosfatı, ikinci mesajcı olan inositol 1, 4,5-trifosfata (InsP3) hidrolize ettiği görülmüştür. InsP3, endoplazmik retikulum üzerindeki, kalsiyum kanalı ihtiva eden InsP3 reseptörleri (InsP3R) ile etkileşime girerek oositin hücre içi depolarından kalsiyum salınımını uyarır ve oosit aktivasyonunu sağlar. Piezoelektrik metodunda, mikroenjeksiyondan sonra "Elektro Hücre Manipulatör" cihazı ile hücrelere belirli düzeyde elektrik verilir. Bu işlem ile oosit aktivasyonu sağlanır. Çalışmamızda oosit aktivasyonunda kullanılan stronsiyum ve piezoelektrik yöntemleri uygulanmış oositler ile herhangi bir uygulanma olmamış kontrol grubu oositlerin geçirimli elektron mikroskobu (TEM) düzeyinde morfolojik yapılarını karşılaştırmayı amaçladık.
Pentoksifilin uygulama sonrası maruziyet süresi dikkate alınarak spermatozoada meydana gelen ultrastrüktürel değişiklikler
Spermatozoon motilite sorunu olan erkeklerde spermatozoon motilitesini arttırmaya yönelik çeşitli farmakolojik ajanlar tanımlanmıştır. Yardımcı üreme tekniklerinde bu ajanlar içerisinde en çok kullanılanı ise pentoksifilindir. Pentoksifilinin erkek infertilisinde en yaygın kullanım alanı in vitro spermatozoon motilitesinin stimülasyonudur. Üremeye yardımcı tekniklerde, in vitro döllenme (IVF) ve intra-sitoplazmik sperm enjeksiyonunda (ICSI) canlı spermatozoon seçimi önemlidir. Bu seçim de spermatozoon motilitesi ile doğru orantılıdır. Yardımcı üreme tekniklerinde, motilitenin in vitro fertilizasyon kapasitesinde önemin anlaşılması ile pentoksifilinin rutinde kullanımının artması, bu konu üzerine birçok çalışma yapılmasına neden olmuştur. Çalışmamızda farklı maruziyet sürelerinde pentoksifilin uygulanmış normospermi örneklerinin ince yapılarını (ultrastrüktürel) geçirimli elektron mikroskobu (TEM) düzeyinde incelemeyi amaçladık. Belirlemiş olduğumuz normospermi örnekleri farklı sürelerde pentoksifilinle inkübe edildi. Belirlenmiş olan örnekler rutenyum kırmızı boyası uygulanarak spermatozoona ait membran yapısında glikokaliksi belirginleştirdikten sonra geçirimli elektron mikroskobunda spermatozoon ince yapısı karşılaştırılarak incelendi ve bu örnekler kontrol grubu ile de karşılaştırılarak değerlendirildi. Sonuç olarak çalışmamızda, 5 dakika (dk) pentoksifiline maruz kalan spermatozoon örneklerinin morfolojik yapısında fazla bozulma olmamasına karşın, 60 dakika pentoksifiline maruz kalan spermatozoon örneklerinde ise belirgin morfolojik bozukluklar görüldü. Buna bağlı olarak pentoksifilin süresinin spermatozoon morfolojisi üzerine etkisi gösterilmiştir.
Pentoksifilin ve platelet aktive eden faktör uygulama sonrası sperm kromatin dağılımı metodu ile DNA hasarının incelenmesi
Evli çiftlerin yaklaşık %15'inde infertilite problemi ortaya çıkmaktadır. İnfertilite (kısırlık) vakaları % 30-50 oranında erkeğe bağlı nedenlerden etkilenmektedirler. Erkek infertilitesinin başlıca nedenlerinden biri sperm motilitesindeki bozukluklardır. Sperm motilitesorunu olan erkeklerde sperm hareketliliğini arttırmaya yönelik çeşitli ajanlar tanımlanmıştır. Motilitenin başlatılmasında ve devam ettirilmesinde bu faktörler temel gereksinimdir. cAMP sperm fonksiyonlarının düzenlenmesinde anahtar role sahiptir. Sperm motilitesinin invitro şartlarda uyarılmasının esası da hücre içi cAMP seviyesini arttırarak sperm fonksiyonlarının uyarılmasına dayanmaktadır. Pentoksifilin gibi fosfodiesteraz inhibitörleri laboratuvarda semene eklendiklerinde, hücre içi cAMP düzeyini, glikozisi ve ATP yapımını arttırdığı görülmüştür. Bu maddeler motil sperm oranını yükseltmekte ve aynı zamanda canlı ama motil spermatozoalarda motiliteyi de tetiklemektedir. Dondurulup-çözünmüş örneklerde sperm motilitesini uyardığı da gösterilmiştir. Platelet Aktive Edici Faktör spermde mevcuttur ve endojen içeriğinin motilite ve gebelik oranı ile önemli ve olumlu ilişkisi vardır. PAF'ın eylem mekanizması tam olarak belli olmasa da, normal üreme fonksiyonuna dair önemi barizdir. Endojen PAF normal sperm fonksiyonu için bir biyobelirteç olarak da rol oynayabilir. PAF kullanmanın özel bir avantajı, sperm tarafından üretilen doğal bir madde olmasından ve pentoksifilin gibi diğer bazı hareketliliği uyarıcılardan farklı olarak toksik etkisinin olmamasındandır. Sperm motilitesinin geliştirilmesi yardımla üreme tekniği sonuçlarını etkili biçimde artırabilir. Özellikle total immotil olgularda canlı sperm seçiminde ve testis biyopsi örneklerinde kullanımı fertilizasyon oranlarını iyileştirici yönde etki göstermektedir. Bu projede Pentoksifilin ve Platelet Aktive Edici Faktör (PAF) uygulaması sonrasında Sperm Kromatin Dağılımı (SCD) metodu ile DNA hasarının incelenmesini ve sonuçların kıyaslanmasını amaçladık.
İnsan endometriyal kanser hücrelerinde östrojenin konsantrasyona bağlı etkilerinin incelenmesi
Östrojenin insan uterusunda endometriyal hücrelerin büyüme ve gelişmesini uyardığı bilinmektedir. Östrojenin endometriyal hücreler üzerindeki etkilerini karakterize etmek için iyi diferansiye insan endometriyal kanserinden üretilmiş Ishikawa hücre soyunu kullandık. Önce 17-ß-östradiol (östradiol)'ün hücre yaşamsallığı üzerine olan etkisini tripan mavisi alma deneyi ile test ettik. İlginç olarak, fizyolojik serum düzeyinin üstündeki östrojen konsantrasyonlarında, östradiol (1-25 ?M) düşük serum ortamında Ishikawa hücrelerinde konsantrasyona bağlı hücre ölümüne yol açtı. İmmünositokimyasal boyama ile gösterilen prolifere hücre nükleer antijeni (PCNA) ekspresyonu ve 5- bromo2'-deoksi-üridine (BrdU) inkorporasyon testleri benzer konsantrasyonlardaki östradiolün hücre büyümesini inhibe ettiğini ortaya koydu. Ayrıca, terminal deoksinukleotidil-transferaz-aracılı deoksiüridin trifosfat nick-end işaretleme (TUNEL) analizi ile östradiol tarafından uyarılan hücre ölümünün apopitozun karakteristik belirtileri olan sitoplazma çekilmesi, kromatin yoğunlaşması, ve DNA fragmantasyonu gösterdiğini ortaya koyduk.Bulgularımıza göre, östradiolün yüksek konsantrasyonlarda, menopozdaki düşük östrojen içeren ortamı taklit eden düşük serum ortamında Ishikawa hücrelerinde apopitoza yol açması, yüksek konsantrasyonlarda östrojenin postmenopazal kadınlarda oluşan hormona bağlı endometriyum kanserinin gerilemesine neden olabileceğini ortaya koydu.
Meme kanseri hücre soylarında ß katenin ve proliferasyon ilişkisi
ÖZETBu çalışmada meme kanseri hücre soyları MDA-MB 231, MCF-7 ve T47D hücrelerinde ß katenin ve fosfo ß katenin ekspresyonu immünositokimyasal olarak incelendi. MDA-MB 231 hücrelerinde nükleer lokalizasyonlu ß katenin ekspresyonu saptandı. Fosfo ß katenin ekspresyonu bazı hücrelerin nukleus ve nukleusa yakın bölgelerinde izlendi. MCF-7 hücrelerinde ß katenin ekspresyonu hücre membranında lokalize idi, fosfo ß katenin ekspresyonu ise gözlenmedi. T47D hücrelerinde ß katenin ekspresyonu hücre membranında lokalizasyon gösterirken, fosfo ß katenin ekspresyonu az sayıda hücre membranında zayıf olarak izlendi. Hücrelerin proliferasyon düzeyi BrdU işaretleyicisi kullanılarak immünositokimyasal olarak incelendiğinde MDA-MB 231 hücrelerinin proliferasyon oranının en yüksek oranda olduğu gözlendi. En düşük proliferasyon oranı ise T47D hücre soyunda tespit edildi.Sonuç olarak, MDA-MB 231 hücre soyunda ß katenin ekspresyonunun nukleusta lokalize olması ve proliferasyon hızının daha yüksek olması bu hücrelerin MCF-7 ve T47D hücrelerine göre daha malign karakterde olmasıyla uyum göstermektedir.
Bazal folikül stimülan hormon düzeyinin intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu sonuçlarıyla ilişkilendirilmesi
İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) erkek kaynaklı infertilite tedavisi için yaygın olarak kullanılan yardımcı üreme tekniğidir. Yardımcı üreme tekniklerinde amaç, uygun tedavi protokolu ve yöntemleri kullanarak kaliteli gamet hücreleri ile embriyo ve gebelik elde edilmesidir. Yaşla birlikte overlerdeki germ hücre havuzu azalmaktadır. Bununla birlikte kadınlarda ilerleyen yaş ile paralel olarak azalan over rezervi, gonodotropin stimülasyonuna yanıtın azalmasına neden olmakta ve tedavide başarı şansını olumsuz olarak etkilemektedir. Yıllar içerisinde over progresif olarak folikül havuzunu kaybeder ve inhibin seviyesi düşer, buna karşılık adenohipofizden folikül stimülan hormon (FSH) salınımı artar. Bu nedenle günümüzde erken fazda ölçülen bazal FSH değerleri over rezervinin önemli bir belirteci olarak kabul edilmektedir. FSH değeri, oosit rezervinin yanı sıra kaliteli oosit ovulasyonu açısından önem taşır. Bazal FSH ölçümlerinin in vitro fertilizasyon (IVF) uygulamalarında gebelik sonuçları üzerine etki eden önemli bir belirteç olarak kullanılabileceğini bildiren pekçok çalışma mevcuttur.Bu çalışmada, kadın hasta bazal FSH düzeyinin ICSI sonuçları üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. ICSI tedavisine alınan 99 çift çalışma grubumuza dahil edildi. Hastalar bazal FSH <10 IU/ml ve FSH >10 IU/ml olan kadın ve normospermili erkek hastalar ile bazal FSH <10 IU/ml, FSH >10 IU/ml olan kadın ve oligospermili erkek hastaların oluşturduğu dört grup altında toplandı. Bazal FSH değeri <10 IU/ml olan normospermili ve oligospermili gruplarda, toplanan oosit sayısı ve metafaz II (MII) oosit sayısı, FSH değeri >10 IU/ml olan her iki gruba göre artmış olarak bulundu ve gruplar arası istatistiksel anlamlılık izlendi. Metafaz I (MI) ve germinal vesikül (GV) içeren oosit gelişimi, fertilizasyon oranları ve takiben elde edilen embriyoların 2. ve 3. gün iyi ve kötü kalite embriyo oranları arasında istatistiksel bir anlamlılık saptanmadı. Gebelik oranları bazal FSH < 10 IU/ml olan normospermili grupta 33.3, oligospermili grupta 40.0, FSH >10 IU/ml olan gruplarda ise sırasıyla 18.8 ve 26.7 olarak bulundu. Bazal FSH değerleri >10 IU/ml olan grupta gebelik oranları düşme göstermesine karşın istatististiksel olarak anlamlılık tespit edilmedi.
Endometriyum hücrelerinde hormonlara bağlı ß-katenin ve nükleer faktör ?B (NF-?B) düzeylerindeki değişiklikler
Bu çalışmada in-vitro endometriyum hücre modelinde, progesteron ve östrojen hormonlarına bağlı olarak gelişen endometriyal siklus evreleri ve sinsistyotrofoblastlarca sentezlenen insan koryonik gonatotropin hormonuna bağlı olarak ß-katenin ve nükleer faktör ?B (NF-?B) sinyal yolakları ile hücre proliferasyonunda meydana gelen değişiklikler immünositokimyasal olarak incelendi.Hücre proliferasyonunun değerlendirilmesinde S fazına özgü bir işaretleyici olan bromodeoksiüridin (BrdU) immünositokimyası uygulandı. Östrojen inkübasyonu sonrasında BrdU inkorporasyonunda artış izlenirken, progesteron ve insan koryonik gonatotropini uygulaması sonrasında hücre proliferasyon oranlarında bir değişiklik izlenmedi. Endometriyal hücrelerde, plazma membranının intraselüler sınırları boyunca belirgin ß-katenin ekspresyonu izlendi. Östrojen ve progesteron hormonlarıyla inkübasyon sonrasında mevcut ß-katenin ekspresyonunda bir değişiklik izlenmedi. İnsan koryonik gonatotropini (HCG) ile inkübasyon sonrasında ise membran yerleşimli ß-katenin ekspresyonunun azaldığı izlendi. NF-?B aktivitesi, östrojen ve HCG uygulanan deney grubu hücrelerde kontrol grubuna benzer bulundu. Ancak progesteron uygulanan grupta sitoplazmik NF-?B ekspresyonunda artış izlendi.Çalışmamız sonucunda; östrojen hormonu inkübasyonuyla artan S faza özgü BrdU pozitif hücre oranı bu hormon kontrolündeki siklus evresiyle uyumlu bulundu. Plazma membranında lokalize olan adezyon molekülü ß-katenin ekspresyonunun, insan koryonik gonadotropini etkisiyle azaldığı belirlendi. İnflamasyon kontrolünde rol oynayan ve steroidlerle etkileşen NF-?B ekspresyonunun, progesteron hormonuyla ilişki gösterdiği ancak sinsityotrofoblastlar tarafından salınan insan koryonik gonadotropininden bağımsız bir etki gösterdiği sonucuna varıldı.
Hormonların endometriyum hücrelerinde hücre proliferasyonunu düzenleyen mekanizmalar üzerine etkileri
Endometriyum streoid hormonların kontrolünde, reprodaktif yaşam süresince aylık siklus dönemlerinde dejenerasyon, proliferasyon ve diferansiyasyona uğrayan bir dokudur. Endometriyum hücrelerinin uğradığı bu biyolojik değişiklikler başlıca östrojen ve progesteron steroid hormonları tarafından düzenlenir. Gerçekleşen implantasyonu takiben ise insan koryonik gonadotropin hormonu (HCG) progesteronun devamlılığını sağlayarak gebelik sürecinde önemli bir rol üstlenir. Östrojen, endometriyumun epitel ve stromal hücrelerinin proliferasyonunda önemli rol oynar. Progesteron ise proliferasyonun inhibisyonu ve desidualizasyon olaylarının düzenlenmesinde görev alır.Çalışmamızda Ishikawa endometriyum epitel hücrelerinde 17-ß-östradiol, progesteron ve HCG'nin hücre proliferasyonu ve hücre siklusunun düzenlenmesinde rol oynayan p53 ile p21 proteinlerinin ekspresyon düzeyleri üzerine olan etkileri incelendi. Prolifere hücre nükleer antijeni (PCNA) nin immünositokimyasal (İSK) boyaması ile hücre siklusunun G1, S, G2 ve M fazlarında olan hücreler işaretlendi. Ayrıca 5- bromo2'-deoksi-üridin (BrdU) işaretleme yöntemi ile S faz hücre oranları değerlendirildi. 17-ß-östradiol uygulanan grupta PCNA işaretli hücreler ile kontrol grubu arasında bir fark izlenmedi ancak S faz proliferasyon oranında anlamlı bir artış tespit edildi. Proliferasyon oranında izlenen artış ile p53 ve p21 protein ekspresyon düzeyleri karşılaştırıldığında bir ilişki gözlenmedi. Progesteron ve HCG uygulanan hücre gruplarının proliferasyon oranları ve p53, p21 protein ekspresyon düzeyleri ise kontrol grubuna çok yakın değerlerde tespit edildi.Elde edilen bulgular doğrultusunda, 17-ß-östradiol, progesteron ve HCG hormonlarının deneyde uygulanan konsantrasyon ve sürelerde Ishikawa hücrelerinin proliferasyonunun düzenlenmesinde p53 ve p21 protein ekspresyon düzeylerini etkilemedikleri sonucuna varılmıştır.
Kümülüs hücreleri proliferasyon ve apopitoz indekslerinin intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu sonuçlarıyla ilişkilendirilmesi
Günümüzde yardımla üreme tekniklerini kullanan (IVF: İn vitro fertilizasyon, ICSI: İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu) hastaların gebelik oranı pek çok faktörün etkisi altındadır. Bu faktörlerden bazıları semen kalitesi, ovaryan stimülasyon tipi, östradiol (E2) seviyeleri ve hasta yaşıdır. Bunlar oosit sayısını, kalitesini, matürasyon oranını ve embriyo gelişimini etkilemektedir. Oosit matürasyonun ilerlemesini ya da gecikmesini sağlayan kümülüs hücreleri, lokal ürünler aracılığıyla oositi etkileyerek proliferasyon ve apopitozda güçlü birer düzenleyici olarak rol oynamaktadırlar.Bu çalışmada, kümülüs hücrelerinin proliferasyon ve apopitoz oranları belirlenip ? 37 yaş ve altı ile ? 38 yaş ve üstü olmak üzere iki gruba ayrılan hastalarda, mikroenjeksiyon sonuçlarıyla ilişkisi değerlendirildi.Bu amaçla, mikroenjeksiyon uygulamasına tabi tutulan hastalardan toplanan kümülüs-oosit komplekslerinden alınan kümülüs hücrelerine, prolifere hücre nükleer antijeni (PCNA) monoklonal antikoru uygulanarak proliferasyon indeksi tespit edildi. 4, 6 diaminido 2 phenilindol (DAPI) floresan boyası uyguladıktan sonra mikroskop altında morfolojik kriterlere göre apopitoz oranı belirlendi.Elde edilen bulgulara göre, kümülüs hücrelerinin proliferasyon oranlarının ? 37 yaş ve altındaki grupta anlamlı derecede yüksek olduğu görüldü. Kümülüs hücre apopitoz oranları değerlendirildiğinde ise her iki grup arasındaki fark anlamlı değildi. Proliferasyon ve apopitoz oranları tespit edilen gruplarda ayrıca oosit matürasyonu, fertilizasyon ve gebelik düzeyleri değerlendirildi. Toplanan oosit sayısı ve matürasyon oranlarının yanı sıra gebelik düzeylerinin kümülüs hücrelerinde yüksek proliferasyon indeksine sahip hastalarda anlamlı derecede artmış olduğu saptandı.Çalışmamızda, mikroenjeksiyon uygulanan hastalarda kümülüs hücre proliferasyon oranlarının sağlıklı gebelik eldesi konusunda önemli bir parametre olan kaliteli oosit seçiminde kullanılabilecek potansiyel bir belirteç olduğu sonucuna varılmıştır.
Endometriyum hücrelerinde Lityumun etkilerinin incelenmesi
Bu çalışmada in-vitro endometriyum epiteli hücre modelinde, lityum klorürün (LiCl), endometriyal siklusun östrojen hormonu kontrolünde gelişen proliferasyon evresindeki etkileri immünositokimyasal olarak incelendi.Çalışma, hiçbir uygulama yapılmayan, sadece LiCl ve sadece 17-ß-östradiol uygulanan, ayrıca LiCl ile 17-ß-östradiol'ün birlikte uygulandığı gruplardan oluşmaktaydı. Öncelikle LiCl'ün hücre proliferasyonu üzerine olan konsantrasyona bağlı etkileri incelendi. Ishikawa hücrelerinde proliferasyonun değerlendirilmesinde S fazına özgü bir işaretleyici olan bromodeoksiüridin (BrdU) immünositokimyası uygulandı. Uygulanan dozda 17-ß-östradiolün hücre proliferasyonunu arttırdığı tespit edildi. Konsantrasyona bağlı olarak LiCl uygulamasının hücre proliferasyonunu inhibe ettiği gözlendi. Sadece LiCl ve LiCl ile 17-ß-östradiolün birlikte uygulandığı deney gruplarında 50, 75 ve 100 mM konsantrasyonlarda istatistiksel olarak anlamlı proliferasyon inhibisyonu izlendi.Proliferasyon inhibisyonu ile ilişkili sinyal yollarının açıklanabilmesi amacıyla çalışmaya maksimum inhibisyonun izlendiği 100 mM konsantrasyonda devam edildi. Mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) ailesinin bir üyesi olan c-jun N-terminal kinaz (JNK) sinyal iletisindeki değişiklikler immünositokimyasal olarak incelendi. JNK ve fosfo c-jun protein ekspresyon düzeylerinde kontrol ve deney grupları arasında anlamlı bir değişiklik izlenmedi.Yaptığımız çalışmalarda LiCl'ün, endometriyum hücre proliferasyonununda inhibisyona neden olduğu ve bu etkisini JNK ve fosfo c-jun ekspresyonlarından bağımsız olarak gerçekleştirdiği gösterildi. Bu bulgular doğrultusunda LiCl'ün, endometriyal kanserler ve uzun yıllar infertiliteye sebep olabilen endometriozis gibi hastalıkların tedavisinde kullanılabilme potansiyeline sahip terapötik bir ajan olarak değerlendirilebileceği sonucuna varılmıştır.
Sperm tirozin kinaz aktivitesinin immünositokimyasal incelenmesi
Akrozom reaksiyonu sonucu fertilizasyonun gerçekleşmesi spermlerin dişi genital sisteminde ilerlerken kazandıkları kapasitasyon yeteneğine bağlıdır. Kapasitasyon yeteneği kazanan ve hiperaktivasyon gösteren spermler akrozom reaksiyonu ve fertilizasyonu gerçekleştirebilirler. Fosfo tirozin kinaz aktivasyonunun kapasitasyon, akrozom reaksiyonu ve dolayısıyla fertilizasyon sürecinde etkili olduğu ve bu süreçte reaktif oksijen türevlerinin tirozin kinaz aktivasyonunu etkilediği bildirilmiştir.Çalışma, semende reaktif oksijen türevi kaynağı lökositlerin artmış olduğu lökospermi vakaları ile normospermili vakalardan seçilen iki grupta gerçekleştirildi. Ayrıca her iki grup, sperm hazırlama yönteminde kullanılan santrifüj işlemi sonucu ortaya çıkan reaktif oksijen türevlerinin olası etkilerinin değerlendirilmesi amacıyla iki alt gruba ayrıldı. İkiye ayrılan semen örnekleri santrifüj işleminin uygulanmadığı swim-up ve santrifüj uygulanan konsantrasyon yöntemleriyle hazırlandı ve immünositokimya için sperm yaymaları hazırlandı. Hazırlanan örnekler streptavidin-biotin peroksidaz yöntemiyle fosfo tirozin monoklonal antikoruyla işaretlendi.Yapılan değerlendirmelerde sperm tirozin kinaz aktivasyonunun spermlerin kuyruk bölgesinde lokalize olduğu, vakaların ekspresyon seviyelerinin bireysel farklılıklar gösterdiği izlendi. Normospermili vakalarda konsantrasyon grubunda swim-up grubuna göre aktivasyonun arttığı ancak bu artışın anlamlı olmadığı izlendi. Lökospermili vakalarda da konsantrasyon yöntemi uygulanan grupta bir artış gözlendi. Normospermili ve lökospermili gruplar arasında ise anlamlı bir fark tespit edilmedi. Normo ve lökospermili vakalarda reaktif oksijen türevlerinin sperm tirozin kinaz aktivitesi üzerine etkili olduğu söylenebilirse de bireysel farklılıkları ve sonuçlarını açıklayacak ileri çalışmaların yürütülmesi gerekmektedir.
İnsan serum albumin konsantrasyonlarının intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu sonuçları üzerine etkileri
İnfertilite bir çiftin korunmasız 1 yıl cinsel ilişkiye rağmen gebelik elde edememesidir. Bu çiftler tedavi amacı ile yardımcı üreme tekniklerine (YÜT) yönlendirilebilir. Bu yöntemlerden biri olan intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) sonrasında oositler uygun kültür mediumu içinde ve inkübatör ortamında kültüre edilir. Amaç in vitro ortamda implantasyon potansiyeli yüksek olduğu düşünülen iyi kalitede embriyoların gelişimini destekleyerek anne adayının uterusuna transfer etmektir. Bu süreçte kullanılan kültür ortamlarına ``medium'' denmektedir. Primer protein kaynağı, mediumlara %5-20 arasında değişen oranlarda eklenmektedir.Bu çalışmada, insan serum albumin (HSA) konsantrasyonlarının (%5 ve %10) ICSI sonrasında fertilizasyon, embriyo gelişimi ve embriyo kalitesi ile ilişkisi olup olmadığı incelendi. Bu amaçla, 1. gruptaki 50 olgudan toplanan metafaz II (MII) oositler, ICSI uygulandıktan sonra, transfer gününe kadar %5 HSA eklenmiş mediumda kültüre edildi. 2. gruptaki 50 olgudan toplanan MII oositler, ICSI uygulandıktan sonra, transfer gününe kadar %10 HSA eklenmiş mediumda kültüre edildi. Çalışma gruplarının yaşları, infertilite süreleri, toplanan oosit sayıları, MII oosit sayıları benzer bulundu. Gruplar arasında fertilizasyon ve klivaj oranları açısından anlamlı fark belirlenmedi. Transfer gününde oluşan embriyolar kalitelerine göre 4 alt gruba ayrıldı (Grade 1, Grade 2, Grade 3, Grade 4). Bu çalışma gruplarının embriyo kaliteleri arasında anlamlı fark belirlenmedi. 1. ve 2. çalışma grupları, transfer gününe göre 2. ya da 3. gün oluşan embriyo kalitelerine göre yine 4 alt gruba (Grade 1, Grade 2, Grade 3, Grade 4) ayrıldığında, 2. çalışma grubunun 3. günde yapılan embriyo transfer olgularında ``Grade 3 embriyo'' gelişimi daha fazla bulundu.Bu verilere dayanarak, hasta sayısının daha fazla olduğu, ayrıca embriyo transferi ve gebelik sonuçlarının da değerlendirilebildiği yeni çalışmaların yapılması, bundan sonraki araştırmalarda izlenecek yol olmalı kanaatindeyiz.
Azospermik olgulardan alınan tese dokularının ultrastrüktürel incelenmesi ve nos izoformlarının etkisinin değerlendirilmesi
Evli çiftlerde yaklaşık olarak %10-15 oranında infertilite görülmektedir ve bunların da yaklaşık %50?sini erkeğe bağlı nedenler oluşturmaktadır. Erkek infertilitesinin başlıca sebeplerinden biri, semende hiç sperm bulunmayan azospermi olgusudur. Nitrik oksit sentaz (NOS) izoformlarının (eNOS, iNOS, nNOS) testis dokusu ve bileşenlerinde varlığının gösterilmiş olması dikkatleri nitrik oksit (NO)?in spermatogenez üzerine olan etkisine çekmiştir. NO?in sperm maturasyonu ve motilitesi üzerine de etkili olduğu belirlenmiştir. Ayrıca spermatogenik seri hücre döngüsünde, hücreler arası bağlantılardaki bozukluklar sperm üretimini engellemektedir. Bu çalışmada; azospermi olgularından testiküler sperm ekstraksiyonu (TESE) ile testiküler doku elde edildi. Testis dokularının Hematoksilen-eozin (H-E), Masson?un üçlü boyaması tekniğini ve Toluidin mavisi kullanarak ışık mikroskobu düzeyinde genel morfolojisini inceledik. İmmunohistokimyasal olarak NOS izoformlarını ve sıkı bağlantı proteini olan zonula okludensi (ZO-1) gösterdik. Bununla bağlantılı olarak geçirimli elektron mikroskobu (TEM) düzeyinde ultrastrüktürel yapısını incelemeyi planladık. Bunun sonucunda elde ettiğimiz bulgulara göre NOS izoformları ile tubüler yapının etkisini değerlendirmeyi amaçladık. Elde ettiğimiz bulgularda spermatozoa bulunmayan gruplarda seminifer tubül yapısının bozulduğu ve hiyalinize olduğu görüldü. eNOS reaksiyonunun spermatozoa bulunan gruplarda bulunmayanlara göre oldukça yüksek olduğu belirlendi. iNOS reaksiyonu spermatozoa bulunmayan gruplarda oldukça yüksek gözlenirken nNOS reaksiyonunda anlamlı bir fark bulunamadı. Spermatozoa bulunan grupta, kan-testis bariyerinde normal ZO-1 reaksiyonu gözlendi. Sadece Sertoli Hücre Sendromu (SSHS) olarak değerlendirdiğimiz spermatozoa bulunmayan grupta, ZO-1 reaksiyonu Sertoli hücrelerinin tüm yan yüzeyinde gözlendi. Elektron mikroskobu bulgularımız ışık mikroskobu bulgularını desteklemekteydi. Bu bulgular Sertoli hücrelerindeki bozulmuş ZO-1 reaksiyonun ve seminifer tubüllerdeki artmış iNOS reaksiyonunun, spermatogenezin zarar görmesindeki faktörlerden biri olabilir. Bu nedenle Sertoli hücreleri arasındaki sıkı bağlantılar spermatogenezinin önemli bir rolü olduğu kabul edilir.
Düşük fertilizasyona neden olan sperm örneklerinde fosfolipaz C zeta'nın immunfloresan gösterimi ve PLC gen mutasyonlarının tayini
Erkek infertilitesi ve sebebi bilinmeyen infertilite, infertilite olguları arasında en sık görülenleridir. Mikroenjeksiyon yöntemi ile erkek infertilitesinin çözümünde çok önemli bir yol katedilmiş olsa da mikroenjeksiyon sonrası görülen fertilizasyon problemleri üzerinde hala yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Mikroenjeksiyon sonrası fertilizasyonun olmayışı büyük ölçüde sperm hücresinin oosit aktivasyonunu sağlayamamasına bağlanmaktadır. Fosfolipaz C Zeta (PLC?); ayırt edici özellikleriyle sperm hücresi kaynaklı bir fosfolipaz olan çözünür 'sperm hücresi faktörü'dür ve oosit aktivasyonunu sağlayan en önemli faktörlerdendir. Fertilizasyon esnasında; sperm hücresi, oosit aktivasyonu için gerekli olan sürekli ve tekrarlayan intrasellüler serbest kalsiyum (Ca+2) salınımını tetikler. Sperm hücresi ekstraktlarındaki Fosfolipaz C Zeta eksikliği ise kalsiyum salınım yeteneğini inhibe eder. Oosit aktivasyon bozuklukları (OAD), Fosfolipaz C Zeta'nın anormal ekspresyonu, lokalizasyonu ve protein yapısına bağlanmıştır. Çalışmamızda; düşük fertilizasyona neden olan sperm örneklerini (globozoospermik, total fertilizasyon başarısızlığı (TFF), nükleer anomali, total immotil) normospermik örneklerle karşılaştırarak, Fosfolipaz C Zeta molekülünün lokalizasyonunu immunfloresan yöntemiyle belirlemeyi ve bu olgularda deoksiribonükleik asit (DNA) dizi analizi yöntemiyle bilinen mutasyonların Fosfolipaz C Zeta'nın 15 ekzonunda taranmasını ve yeni mutasyon ve polimorfizmlerin belirlenmesini amaçladık. Bu çalışma sonucunda düşük fertilizasyon gösteren sperm örneklerinde Fosfolipaz C Zeta lokalizasyonu normospermi grubuna göre baş ve post-akrozomal bölgelerde azaldığı ya da hiç olmadığı belirlendi. DNA dizi analizi ile düşük fertilizasyona neden olan sperm örneklerinde pek çok değişim saptandı. Literatürde hiç yer almamış ve protein farklılaşmasına neden olan bazı değişikliklerin yanı sıra stop kodonuna dönüşen bir nükleotid değişimi de saptandı. Sonuç olarak, Fosfolipaz C Zeta molekülünün düşük fertilizasyon gösteren bireylerdeki fertilizasyonda oosit aktivasyonunda etkili rolünün olduğu ortaya koyulmaktadır.
Kronik sudan kaçınma stresi ile testis dokusunda oluşturulan hasarı üzerine fulvik asitin tedavi edici etkisinin araştırılması
Amaç: Organizmada strese bağlı infertilite oluşumunda oksidatif stres, apoptoz ve inflamasyon önemli rol oynar. Stres, vücudun çeşitli içsel ve dışsal uyaranlara verdiği otomatik bir tepkidir. Kronik sudan kaçınma stres modelinin testis dokusunda oksidatif hasar oluşturduğu bilinmektedir. Fulvik asit, antioksidan, antiapoptotik ve antiinflamatuvar özelliklere sahip, toksik olmayan bir ajandır. Bu çalışmanın amacı kronik stresin testislerde oluşturduğu hasarın fulvik asit ile geri döndürülmesidir. Gereç ve Yöntem: 18 adet Sprague–Dawley erkek sıçan kullanıldı. Deney grupları: Kontrol (K), Kronik Stres (KS) ve Kronik Stres+Fulvik Asit (KS+FA). Testis dokusundan elde edilen histolojik kesitler Hematoksilen&Eozin ve Toluidin mavisi ile boyandı; ZO-1, β-aktin ve iNOS immünohistokimya işaretlemeleri yapıldı. Biyokimyasal olarak TAS/TOS, OSI, KAT, GPx ve SOD düzeyleri ölçüldü. Bulgular: Histopatolojik incelemelerde testis doku kesitlerinde, K grubuna kıyasla KS grubunda bazal membranda düzensizlik, seminifer tübülün germinal epitel bölgesinde açılmalar gözlendi. KS+FA grubunda hasar devam ederken bazal membranda düzelme görüldü. Seminifer tübüllerdeki germinal epitel arasındaki açılmaların azaldığı gözlenirken biyokimyasal bulgular da histolojik bulguları destekledi. Sonuç: Kullanılan fulvik asitin iyileştirici etkisinin olduğu ancak antioksidan etkisinin ortaya çıkarılması açısından daha yüksek dozlarda kullanılacağı çalışmaların yapılması gerektiği sonucuna varılmıştır. Anahtar Kelimeler: Antioksidan, İnfertilite, Fulvik Asit, Sudan Kaçınma Stresi, Oksidatif Stres
Betülinik asidin endometrial kanser hücrelerinde mTOR yolağı aracılı olası antikanser etkilerinin araştırılması
Endometrial kanser dünya çapında en yaygın jinekolojik kanserlerden biridir ve her yıl dünya çapında tahminen 42.000 kadın bu kanserden hayatını kaybetmektedir. Günümüzde endometrial kanser için kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi gibi tedavi yöntemleri kullanılmaktadır. Şu anda kemoterapi için kullanılan ilaçlar, iyileşme oranını arttırmada sınırlı bir başarıya sahiptir. Bu nedenle endometrial kanser tedavisinde kullanılabilecek doğal, zararsız ve maliyeti düşük bileşiklere acil ihtiyaç vardır. Lupan tipi triterpen olan ve bitkiler âleminde yaygın olarak bulunan betülinik asit tümör büyümesini seçici olarak inhibe edebilmesi ve hücre apoptozunu indükleyebilmesi gibi özellikleriyle son yıllarda kanser tedavisi için dikkat çekmektedir. Bu çalışmanın amacı betülinik asitin insan endometrial kanser hücrelerinde mTOR yolu aracılı anti kanser etkilerinin araştırılmasıdır. Betülinik asitin Ishikawa hücre canlılığı üzerine etkisi CCK-8 yöntemi ile, apoptoz ve mTOR yolağında görevli olan genlerin ekspresyonu üzerine etkisi gerçek zamanlı PCR, mTOR yolağında görevli proteinlerin ekspresyonu üzerine etkisi immünohistokimya ve Western blot ile apoptoz üzerine etkileri ise Annexin V ile belirlenmiştir. Betülinik asitin Ishikawa hücrelerinde IC50 dozu 48. Saate 50 µM olarak belirlenmiştir. Betülinik asit uygulaması Ishikawa hücrelerinde Bcl2 (P=0.008) ekspresyonunun anlamlı azalmasına ve kaspaz 8 (P=0.001) ekspreyonunun artmasına neden olmuştur. Annexin V sonuçları ile betülinik asit uygulamasının Ishikawa hücrelerinde apoptozu tetiklediği desteklenmiştir. Betülinik asit uygulanan grupta apoptoza uğrayan hücrelerin oranı ortalama %22±3.23 (P=0.02) iken kontrol grubunda %2.31±0.2'dir. mTOR ile ilişkili genlere bakıldığında betülinik asit, AKT1 (P=0.0001) ekspresyonunun anlamlı azalmasına RAPTOR (P=0.00002) ekspresyonunun ise anlamlı artmasına neden olmuştur. Betülinik asit uygulaması mTOR yolağında görevli proteinlerinin ekspresyonunda da anlamlı bir azalmaya yol açmıştır. Ishikawa hücrelerinde p-PI3K, p-AKT ve p-mTOR pozitif hücre yüzdesi kontrol grubunda sırasıyla, %89.39 ± 5.19, %74.84 ± 5.07 ve %82.02 ± 6.14'tür. BA uygulanan grupta bu değerler sırasıyla %49.12 ± 19.12 (P=0.002), %44.46 ± 7.39 (P<0.001) ve %53.70 ± 8.94 (P<0.001)'tür. Çalışma sonuçlarımıza göre betülinik asitin Ishikawa hücrelerinde mTOR sinyal yolağını hedef alarak hücre proliferasyonunu azalttığı ve apoptozu tetiklediği, ayrıca betülinik asit endometrial kanser tedavisinde potansiyel bir anti-kanser ajan olabileceği gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Apoptoz, Betülinik asit, Ishikawa, mTOR
Farklı fiksatiflerin bazı testis hücrelerindeki AQP-9 immunoreaktivitesi üzerine etkilerinin karşılaştırılması
Fiksasyonu problemli olmasından dolayı testisler ile yapılan histomorfolojik ve immunohistokimyasal çalışmalarda en uygun fiksatifi belirleme çalışmaları zaman zaman histopatolojinin konusu olmuştur. İmmunohistokimyasal analizlerde iyi bir fiksatiften beklenen en önemli özellik aranan proteini iyi koruması ve immunoreaktiviteyi güçlü bir şekilde ortaya çıkarmasıdır. Bu çalışmada, farklı fiksatiflerin sıçan testisleri üzerindeki histomorfolojik etkileri ve testis hücrelerindeki AQP-9 boyanma şiddetleri üzerindeki etkileri karşılaştırılmıştır. Çalışmada histopatolojide rutin olarak kullanılan %10'luk nötral tamponlu formaldehit (%10'luk NTF), modifiye Davidson (mDF), Bouin (BF) ve Stieve's (SF) fiksatifleri kullanıldı. Çalışmada fiksatiflerin her biri için 6'şar adet, toplam 24 adet testis dokusu kullanıldı. Daha önce hazırlanan parafin bloklardan alınan kesitler rutin histolojik prosedürlerden geçirildi, immunohistokimyasal metot kullanılarak AQP-9 antikoru ile işaretlendi ve histomorfometrik ve immünohistokimyasal analizleri yapıldı. Histomorfometrik ölçümlerimiz mDF ve SF fiksatiflerinin sıçan testisinin morfolojik bütünlüğünü birbirine yakın düzeyde iyi koruduğunu ve hücresel detayları daha iyi ortaya çıkardığını gösterdi. Ayrıca morfolojik bütünlüğü koruma yönünden en kötü performans %10'luk NTF'ye aitti. İmmunohistokimyasal analizlerimiz BF'nin seminifer tübüllerin germ ve Sertoli hücrelerindeki AQP-9 ekspresyonunu açığa çıkarma yönünden en iyi performansa sahip fiksatif olduğunu, onu sırasıyla mDF ve SF'nin takip ettiğini gösterdi. SF'nin ise interstisyel alanın Leydig hücrelerindeki AQP-9 ekspresyonunu açığa çıkarma yönünden en iyi performansa sahip fiksatif olduğu, onu sırasıyla mDF ve BF'nin takip ettiğini görüldü. Ayrıca %10'luk NTF'nin her iki testis alanında da AQP-9 ekspresyonunu açığa çıkarma yönünden en kötü performansa sahip olduğu tespit edildi. Ölçümlerimiz de göstermektedir ki, sıçan testis dokusunda bundan sonra yapılacak histomorfometrik çalışmalarda mDF ve SF'nin, AQP-9 ekspresyonuna yönelik yapılacak immunohistokimyasal analizlerde birbirlerine yakın değerlere sahip olan SF, mDF ve BF testis fiksasyonu amacıyla tercih edilebilir.
Deneysel alzheimer modelinde farklı kaynaklardan elde edilen eksozom uygulanmasının mTOR-AKT-HIF-1α yolağı üzerindeki etkisi ve TRP kanalları ile ilişkisinin histopatolojik olarak değerlendirilmesi
Alzheimer hastalığı (AH)'nda eksozom uygulama yöntemi son yıllarda hastalığın patogenezini ve tedavisini araştırmak amacıyla kullanılmaya başlanmış olup gün geçtikçe kullanımı artmıştır. Bu yöntemin tedavi amaçlı olarak kullanılması oldukça önemlidir. Tez çalışmamızda göbek kordonu mezenkimal kök hücre (GK-MKH) ve yağ dokusu mezenkimal kök hücre (YD-MKH)'lerden elde edilen eksozomların tedavi amaçlı olarak klinik kullanıma sokulabilmesi için eksozom eldesi aşamalarının tespit edilmesi hedeflenmiştir. Bu hedef çerçevesinde ulaşılan sonuçlar histokimyasal ve immünhistokimyasal boyamalar ile de doğrulanmıştır. Çalışmamızda deneysel Alzheimer modeli oluşturulmuş sıçanlara intraserebroventriküler (ICV) ve intranasal (IN) eksozom uygulanması yapılmış ve her iki uygulama yönteminde de eksozomların beyin dokusuna ulaşabildikleri gösterilmiştir. Ancak, IN eksozom uygulama yönteminin ICV eksozom uygulama yöntemine göre beyin dokusuna daha az ulaşabildiği ve tedavideki etkinliğinin daha düşük olduğu değerlendirilmiştir. Yine de IN eksozom uygulama yönteminin uygulanabilirliğinin daha kolay olması ve bazı hayvanlarda etkisinin ICV eksozom uygulama yöntemine yakın olması önemli bir bulgudur. Bu nedenle yeni araştırmalarda eksozomların etkinliğinin artırılması amacıyla uzun vadeli uygulamaların yapılmasını önermekteyiz. Anahtar sözcükler: Alzheimer, rat, amiloid beta, eksozom, mTOR-AKT-HIF-1α, TRP
Bleomisin, etoposid, cis-platin tedavisi uygulanan sıçan modellemesinde oluşan sperm dna fragmantasyonuna glutatyonun etkisi
Testis kanseri üreme çağındaki genç erkeklerde (20-40 yaş) sık görülen malign tümörlerdendir. Tedavisinde kullanılan cis-platin bazlı kemoterapötik ajanlar ve spesifik Bleomisin, Etoposit ve cis-platin (BEP) kombinasyonu sağ kalımı arttırırken sağlıklı dokularda da hasar oluşmasına neden olmaktadır. Hasar oluşturduğu önemli dokulardan biri de testis dokusu ve sperm hücreleridir. Bu çalışmada uygulanan BEP tedavisinin sıçanlarda oluşturduğu sperm DNA bütünlüğü ve testis histomorfolojisi hasarları üzerine glutatyon (GSH) uygulamasının koruyucu etkisi araştırıldı. Üreme çağındaki 12 haftalık erkek sıçanlar (n=24) rastgele her grupta 8 tane olacak şekilde kontrol, BEP ve BEP+GSH olarak 3 gruba ayrıldı. BEP grubuna 9 hafta boyunca her biri 21 günlük 3 kür olacak şekilde ön çalışmada belirlenen BEP dozlarına göre (0,083; 0,83; 0,17 mg/kg) tedavi intraperitonal olarak uygulandı. BEP+GSH grubuna BEP grubuna uygulanan kemoterapötik tedaviyle birlikte 9 hafta boyunca, her hafta düzenli olarak, haftanın 1.ve 4.gunlerinde Glutatyon 200 mg/kg uygulandı. Kontrol grubuna ise diğer gruplara ilaç uygulanan günlerde %0,9 NaCl intraperitonal olarak verildi. Grupların ağırlık artışları karşılaştırıldığında BEP+GSH grubunun ağırlık artışı BEP grubunun ağırlık artışına göre anlamlılık göstermedi (p=0,921). Kontrol grubundaki artış BEP grubu ve BEP+GSH grubuna göre yüksek bulundu (p˂0,027, p˂0,012). Benzer şekilde kontrol grubunun sol testis ağırlıkları (p˂0,017; p˂0,003), sol epididimis ağırlıkları (p˂0,029; p˂0,037), sağ epididimis ağırlıkları (p˂0,002; p˂0,004), testis ağırlık indeksleri (p˂0,0017; p˂0,001) BEP grubu ve BEP+GSH grubuna göre yüksek bulundu. BEP+GSH uygulanan grup ile kontrol grubunda morfolojik anomali oranı ve sperm DNA fragmantasyonu BEP grubuna göre oldukça düşük bulundu (p˂0,001; p˂0,001). BEP+GSH grubu ile kontrol grubunun serum testosteron seviyesi ve sperm sayısının BEP grubuna göre yüksek olduğu görüldü. Testislerde seminifer tübül epitel kalınlıklarının ve Johnsen skorlarının kontrol grubu ve BEP+GSH grubunda BEP grubuna göre daha kalın olduğu görüldü (p<0,000). Sonuç olarak GSH tedavisinin, BEP tedavisi alan sıçanlarda sperm sayısını, sperm morfolojik yapısını ve testis morfolojisini iyileştirmiş ve sperm DNA fragmantasyonunu azaltmış, bu nedenlerden dolayı kemoterapötiklerin sebep olduğu erkek infertilitesinde potansiyel iyileşme sağlamıştır.
Polietilen tereftalat yapılı nanoplastiklere sub-kronik maruziyetinin testis ve sperm üzerinde meydana getirdiği hasarın fare modelinde araştırılması
İnfertilite, 12 ay veya daha fazla düzenli korunmasız cinsel ilişki sonrası gebelik elde edilememesi ile tanımlanan erkek veya dişi üreme organlarından kaynaklanan bir hastalıktır. Birçok genetik faktör ve yaşam tarzı faktörünün erkek infertilitesi ile ilişkili olduğu düşünülür. Yaşam tarzı faktörlerinden biri olan mikro ve nanoplastiklere maruziyetin de infertilitede etkili olabileceği çalışmalarda bildirilmiştir. Bu çalışmada sentetik yapılı polimerlerden biri olan polietilen tereftalat (PET) nanoplastiğinin erkek üreme sağlığı üzerine etkisinin araştırılması amaçlandı. Beş haftalık 18 adet Balb-C türü fare rastgele seçilerek kontrol grubu, düşük doz PET-NP ve yüksek doz PET-NP uygulama grubu olarak üç gruba ayrıldı (n=6). 28 gün boyunca 100'er µL olacak şekilde sırası ile kontrol grubuna serum fizyolojik, düşük doz grubuna 0.1 mg/gün PET nanoplastiği ve yüksek doz grubuna 0.5 mg/gün PET nanoplastiği oral gavaj ile verildi. Sub-kronik PET nanoplastiği uygulaması sonucunda deneklerin testis organ endekslerinde kontrole kıyasla anlamlı bir değişim görülmezken (P<0.05), hem düşük hem de yüksek doz uygulama gruplarının sperm sayımlarında kontrole kıyasla anlamlı azalmalar görüldü (P<0.05). Benzer bir şekilde hem düşük hem de yüksek doz uygulama gruplarında sperm morfolojileri incelendiğinde normal morfolojiye sahip sperm oranlarında anlamlı azalış görüldü (P<0.05). Ayrıca, yüksek doz PET nanoplastiklerine maruz kalan grupta, sperm boyun anomalilerinde kontrole kıyasla anlamlı artış görüldü (P<0.01). COMET analiz yöntemi ile belirlediğimiz DNA hasarı sonuçlarında ise, PET nanoplastiklerine maruz kalan grupların sperm %kuyruk DNA miktarında anlamlı artış görüldü (P<0.05). Son olarak, testislerden alınan histolojik kesitlerin tübül yapıları Johnsen skorlaması ile değerlendirildiğinde, PET plastiğine maruz bırakılan her iki grupta da spermatogenezde kontrole kıyasla anlamlı bir değişim görüldü (P<0.05). Sonuç olarak sub-kronik PET nanoplastik maruziyeti, sperm sayısını azaltmakta, sperm morfolojisinde bozulmalara neden olmakta, spermlerde DNA kırıkları meydana getirmekte ve spermatogenez aşamalarında negatif etkiler oluşturmaktadır. Tüm bu negatif etkiler neticesinde PET nanoplastiği erkek üreme sağlığını olumsuz yönde etkilemektedir.
Nepeta italica Subsp. cadmea ekstraktının dondurulmuş-çözdürülmüş teke spermleri üzerine etkisinin araştırılması
Sperm kriyoprezervasyonu, reaktif oksijen türevlerinin (ROS) aşırı üretimine bağlı olarak sperm kalitesini ve ardından fertilizasyon yeteneğini olumsuz etkiler. Kriyoprotektanların sulandırıcıya eklenmesi, spermi oksidatif stresin (OS) zararlı etkilerinden koruyabilir. Flavonoidler ve fenolik bileşikler açısından zengin bitki ekstraktları gibi doğal kaynaklı antioksidanların, kriyoprotektif ajanlar olarak kullanılmasına yönelik çalışmalar yapılmaktadır. Bu çalışmada, Ankara teke spermasının, motilite, akrozom membran bütünlüğü ve DNA fragmentasyonu üzerine, antioksidan ve flavonoid içeriği bakımından zengin olan Nepeta italica subsp. cadmea esansiyel yağının üç farklı dozunun (0.75 µl/10 ml, 1.5 µl/10 ml ve 6 µl/10 ml) dondurma-çözdürme sonrası etkileri araştırılmıştır. Bitkiler, çiçeklenme döneminde Honaz dağından (Denizli, Türkiye) toplanmış ve oda sıcaklığında, gölgede kurutulmuştur. Toz haline getirilen bitkinin, esansiyel yağı Clevenger aparatı sistemi kullanılarak hidrodistilasyonla ekstrakte edildikten sonra, amber renkli şişe içinde 4ºC'de saklanmıştır. Tekelerden, üreme sezonunda elektroejakülatör ile alınan ejakülatlar birleştirilmiş, tris ana stok solüsyonu ile bitki yağının üç farklı dozu sulandırıldıktan sonra dondurulmuştur. Çözdürme sonrası motilitede, kontrol grubu ile diğer gruplara göre, yağın 0.75 µl/10 ml'lik dozunun iyileştirme yaptığı belirlenmiştir (p<0.05). Akrozomal membran bütünlüğü ve DNA fragmentasyonu analizlerinden de benzer sonuçlar elde edilmiştir. Dondurma-çözdürme sonu akrozomal membran bütünlüğünde esansiyel yağın 0.75 µl/10 ml dozu, kontrol ve 1.5 µl/10 ml ile 6 µl/10 ml dozlarına göre daha yüksek değerde bulunmuştur (p<0.05). DNA fragmentasyon analizinde ise, esansiyel yağın 0.75 µl/10 ml dozu, kontrol ve 1.5 µl/10 ml ile 6 µl/10 ml dozlarına göre daha düşük değerde bulunmuştur (p<0.05). Sonuç olarak, esansiyel yağın 0.75 µl/10 ml'lik dozunun, Ankara tekesi spermlerinde dondurma-çözdürme sonrası, motilite, akrozomal membran bütünlüğü ve DNA fragmentasyonu parametreleri üzerinde kriyoprotektif etkisi belirlenmiştir. Sperm kriyoprezervasyonunda, antioksidan etkilere sahip ve flavonoid içeren Nepeta italica subsp. cadmea esansiyel yağının en uygun dozunun kriyoprotektan olarak kullanılabileceği gösterilmiştir. Bununla birlikte, sperm kriyoprezervasyonunda bitki esansiyel yağının belirlenen dozlarının olası kriyoprotektif etkilerini, farklı parametrelerle de çalışarak ortaya çıkarılmasına ihtiyaç vardır.
Sıçanlarda streptozosin ile oluşturulan diyabette probiyotiklerin böbrek dokusundaki etkilerinin araştırılması
Toplumda görülme sıklığı giderek artan ve önemli bir halk sağlığı sorunu olan diyabet tüm dokularda olduğu gibi böbrek dokusunda da hasara sebebiyet veren endokrin, metabolik bir hastalıktır. Probiyotiklerin yeterli miktarlarda alındığında sağlığa olan faydalarından dolayı hastalıkların tedavisi ve önlenmesinde etkili olabilecekleri düşünülmektedir. Bizim çalışmamızda da diyabet hastalığında probiyotiklerin etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda 34 adet Wistar albino cinsi erkek sıçan kullanılmış ve gruplar grup K, grup P, grup Dm, grup DmP ve grup PDm olmak üzere 5'e ayrılmıştır. Grup K' ya ait sıçanlara 8 hafta boyunca oral gavaj ile PBS, grup P'ye ait sıçanlara 8 hafta boyunca oral gavaj ile 0.6 mg/kg VSL#3 probiyotik takviyesi uygulanmıştır. Grup Dm'ye 50 mg/kg streptozosin intraperitonel tek doz verilerek diyabet oluşturulmuştur. Grup PDm'deki sıçanlara çalışmanın ilk 4 haftası boyunca probiyotik takviyesi uygulanmış, daha sonra diyabet oluşturulmuş, diyabet oluşturulduktan sonraki 4 hafta boyunca probiyotik uygulamasına devam edilmiştir. Grup DmP'de yer alan sıçanlarda streptozosin (50 mg/kg intraperitoneal) ile diyabet oluşturulmuş ve sonrasında 4 hafta boyunca probiyotik uygulanmıştır. Deneyin başlangıcı ve bitiminde sıçanların kan şekeri ölçümleri yapılmış, diyabet oluşturulmak istenen sıçanlar için kan glikoz değeri 250 mg/dl kabul edilmiştir. Deneyin sonlandırılması ile sıçanlar intraperitonal olarak 90 mg/kg ketamin + 10 mg/kg ksilazin verilerek anestezi altında sakrifiye edilmiştir. Biyokimyasal değerlendirme için kan serum örnekleri ve histokimyasal analizler için böbrek dokuları elde edilmiştir. Sonuç olarak probiyotiklerin diyabetin bıraktığı hasara karşı kan glikoz seviyelerinde koruyucu etkisinin olduğunu fakat tedavi edici herhangi bir etkisi olmadığını gözledik. Diyabetin sebep olduğu serum üre ve BUN artışına karşı probiyotiklerin iyileştirici etkisi olduğu sonucuna ulaştık. Fakat kreatinin için anlamlı bir değişim göremedik. Yaptığımız histokimyasal değerlendirmelerde probiyotiklerin diyabet ile oluşan böbrek dokusundaki hasara karşı olumlu yönde etkisinin olduğunu tespit ettik. Probiyotiklerin diyabete karşı olumlu etkilerini immünohistokimyasal olarak alfa-SMA ve Bcl-2 ekspresyonları ile de gözledik.
Ovulasyon indüksiyonunun, polikistik over sendromu oluşturulan sıçanlardaki PI3K/AKT sinyal yolağına ve miRNA ekspresyonuna etkisi
Polikistik over sendromu (PCOS), dünya genelinde üreme çağındaki kadınların %4-21'ini etkileyen, infertilite nedeni olan, metabolik bozukluklar ile karakterizedir. miRNA ekspresyonlarının değişmesinin serviks kanseri, endometriozis, zayıf ovaryum yanıtı ve kardiyovasküler hastalıklara katkıda bulunur. Bu yüzden bazı miRNA'lar, PCOS'ta anormal metabolizma, bozulmuş oosit kalitesi ve düşük endometrial reseptivite için yeni biyobelirteçler olabileceği bulunmuştur. Bu çalışmada amacımız ovulasyon indüksiyonunun, PCOS hastalarındaki PI3K-AKT sinyal yolağına ve miRNA ekspresyonuna etkisini incelemektir. 28 Sprague Dawley erişkin dişi sıçanlar rastgele 3 gruba ayrıldı. Kontrol grubu yalnızca 25 gün boyunca %0.9 izotonik soydum klorür (1mg/kg) ile gavaj uygulanırken, PCOS ve PCOS+OI gruplarına 25 gün boyunca (1mg/kg) Letrozol gavaj yoluyla uygulandı. Ovulasyon indüksiyonu sağlanması için 25. gün 150-300 IU/kg gebe kısrak serum gonadotropini intraperitoneal enjeksiyonuyla süperovülasyon yapıldı. 48 saat sonra 150-300 IU/kg insan koryonik gonadotropini (hCG) intraperitoneal olarak verildi. Kan FSH, östrojen ve testosteron düzeyleri ELİSA yöntemiyle incelendi. Ovaryum dokuları histopatolojik olark değerlendirildi. İmmünohistokimyasal olarak PI3K/AKT yolağı değerlendirilmesi, miR-451a, miR-33b-5p, miR-378a-5p, miR-486-5p miR-140, miR-320a ekspresyonları RT-PCR yöntemiyle belirlendi. Çalışmamızda vajinal smear bulguları, kan hormon düzeyleri deneysel PCOS modeli oluşturduğumuzu göstermiştir. Ovulasyon indüksiyonunun T ve E2 düzeyini daha da arttırması ve FSH düzeyini Kontrol grubuna göre anlamlı olarak düşürdü (p<0,05). PCOS+OI grubunda miRNA analizlerinde miR-140, 378 ve 486'nın ekspresyonu düşmesi ve miR-451 artışı istatistiksel olarak anlamlı saptandı (p<0,05). İmmmünohistokimyasal analiz sonucunda PI3K, AKT, p-PI3K, p-AKT ekspresyonları PCOS+OI grubunda PCOS grubuna göre istatistiksel anlamlı pozitif reaksiyon gösterdi. Ovulasyon indüksiyonu, PCOS deneysel sıçan modelinde miR-140, 378 ve 486 ekspresyonunu azaltıp, miR-451 ekspresyonunu arttırarak, PI3K/AKT sinyal yolağını aktive etmiştir. Bu yolağın aktivasyonu granüloza hücre apoptozisini ve otofajik hücre ölümünü inhibe etmiş olup foliküler atreziyi önlemeye yardımcı olmuştur. Bu sonuçlar PCOS'un patogenezinin anlaşılmasına yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda infertilite sebebi sayılan PCOS hastalarına tedavi için yeni bir yön sağlayabilir.
Yaşlı fare ovaryumunda melatoninin PTEN/PI3K/AKT yolağına etkisi
Günümüzde, modern yaşam ile birlikte hayatımıza giren mevcut alışkanlıklar; kötü beslenme, uykusuzluk, stres ve daha birçok durum dolaylı olarak infertiliteye sebep olabilmektedir. Mevcut yaşam şartları, üreme yaşını ileriye taşımıştır. Kadın üreme sorunlarına bakıldığında, ilerleyen yaşın vücutta biriktirdiği mutasyonlar ve menstrual sikluslarla vücuttan düzenli olarak atılan oositler nedeniyle, over rezervi giderek azalmaktadır. Canlıların sirkadiyen ritimlerinin hücresel faaliyetler üzerindeki etkisi incelendiğinde, üretimi karanlık ve aydınlığa göre belirlenen endojen melatonin hormonunun etkisi bilinmektedir. Bu çalışmada; literatürde yaşlanma karşıtı özellikleri ve antioksidan özelliği bilinen eksojen melatonin hormonunun, yaşlı fare ovaryumunda PTEN/PI3K/AKT yolağına etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda, 12 haftalık 24 adet, 20 aylık 24 adet olmak üzere toplamda 48 adet Balb/c cinsi sağlıklı dişi fare kullanıldı. Deney için kullanılan erişkin ve yaşlı fareler; Erişkin Kontrol (EK) Grubu, Erişkin Melatonin (EM) Grubu, Erişkin Sham (ES) Grubu, Yaşlı Kontrol (YK) Grubu, Yaşlı Melatonin (YM) Grubu, Yaşlı Sham (YM) Grubu olmak üzere toplamda 6 gruba ayrıldı. Grup EK ve YK'ya ait farelere, 7 gün boyunca hiçbir uygulama yapılmamıştır. Grup EM ve YM'ye ait farelere, 7 gün boyunca (10mg/kg intraperitoneal) melatonin verilmiştir. Grup ES ve ES'ye ait farelere, 7 gün boyunca %10'a seyreltilmiş etil alkol intraperitoneal olarak uygulandı. 8. Gün itibariyle ketamin/ksilazin 200/10mg/kg intraperitoneal olarak farelere verildikten sonra ovaryum dokuları çıkarıldı. Hayvanlar servikal dislokasyon yöntemi ile sakrifeye edilerek deney sonlandırıldı. Histokimyasal ve immünohistokimyasal analizler için ovaryum dokuları muhafaza edilerek, doku takip ve bloklama prosedürleri izlendi. Yaşlı kontrol grubu ile yaşlı melatonin grubu karşılaştırıldığında, folikül sayılarındaki artış dikkat çekiciydi. Çalışmamızda melatoninin çözücüsü olarak kullanılan etil alkolün uygulandığı, sham gruplarına ait dokularda, atretik haldeki foliküllerin sayısındaki artış belirgindi. Sonuç olarak; folikül sayısı bakımından erişkin gruplarda, melatonin uygulanan grupla kontrol grubu arasında istatiksel anlamlılık bulunamadı. PTEN/PI3K/AKT ekspresyonu erişkin gruplarda kontrol ve sham arasında farklılık göstermezken yaşlı deneklerde melatonin uygulanan grupta diğer iki gruba karşı artmıştı. Melatoninin, ovaryum dokusundaki etkilerinin daha iyi anlaşılabilmesi için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Deneysel hipotiroidinin ovaryum follikülleri üzerine etkisi
Hipotiroidi, tiroid hormonlarının (T4 ve T3) yetersiz üretimi sonucu vücut fonksiyonlarının yavaşlamasına neden olan bir durumdur. Üreme sağlığını etkileyerek menstrüel siklus ve fertiliteyi bozabilir, tekrarlayan gebelik kayıplarına yol açabilir. Hayvan çalışmalarında, hipotiroidinin follikül olgunlaşmasını engellediği ve ovaryum fonksiyonlarını bozduğu gözlemlenmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF), hücre büyümesi ve farklılaşmasında önemli rol oynayan bir polipeptittir; epidermal büyüme faktör reseptörü (EGFR) ise EGF'nin bağlandığı reseptördür. Tiroid hormonları, EGF ve EGFR seviyelerini etkileyebilir ve hipotiroidi, EGFR seviyelerinde azalmaya neden olabilir. EGF, granüloza hücrelerinin büyümesini ve follikül gelişimini destekler, oosit olgunlaşması ve yumurtlama için gereklidir. Bu çalışmanın amacı, yetişkin sıçanlarda indüklenen hipotiroidinin ovaryum follikülleri üzerindeki etkilerini ve hipotiroidi indüklenmiş ovaryum folliküllerinde EGFR etkisini incelemektir. Çalışmamızda 18 adet Wistar dişi sıçan kullanılmıştır. Rastgele seçilen ve içme suyuna 30 gün boyunca 10 mg/kg metimazol eklenen 10 adet sıçan hipotiroidi grubunu, geri kalan 8 adet sıçan kontrol grubunu oluşturmuştur. Metimazol ile indüklenmiş deneysel hipotiroidinin ovaryum üzerine biyokimyasal, histopatolojik ve mRNA ekspresyonu değişimi açısından etkileri araştırılmıştır. Metimazol verilen sıçanların serum T3 seviyesinde anlamlı derecede azalma olduğu gözlendi. Hipotiroidi grubundaki sıçanların ortalama vücut ve ovaryum ağırlıkları, primer, sekonder ve tersiyer folliküllerde anlamlı derecede azalma olduğu tespit edildi. İmmünohistokimyasal olarak EGFR ekspresyonunun da hipotiroidi grubu sıçanlarda azaldığı görüldü. GZ-PZR analizi sonucunda kontrol grubuna göre metimazol grubu Sıçanların HB-EGF, EGFR, GPER1 ve ESR1 gen ekspresyonu artarken, RAF1 ekspresyonlarının azaldığı gözlendi. Metimazol sıçan ovaryum folliküler gelişimi ve oosit kalitesinde ciddi bozulmalara yol açmaktadır.
Endometriozis oluşturulan sıçanlardaki metformin ve dienogest'in PI3K/AKT sinyal yolağına etkisi
Endometriozis, pelvik ağrı ve infertilite ile karakterize iyi huylu ve östrojen bağımlı yaygın bir hastalıktır. Çalışmamızın amacı, Endometrioziste verilen Dienogest ve Metformin tedavilerinin iyileşmeye etkisini değerlendirmek ve PI3K/AKT sinyal yolağına etkisini açıklayabilmektir. Çalışmamızda sıçanlar rastgele olarak gruplara ayrıldı. Kontrol: (n=8) Hiçbir şey uygulanmayan grup; Endometriozis (n=8): Deneysel endometriozis oluşturulan grup; Endometriozis+Dienogest: (n=8) Deneysel endometriozis oluşturulan ve 28 gün boyunca Dienogest 0.3 mg/kg/gün oral olarak verilen grup; Endometriozis+Metformin: (n=8) Deneysel endometriozis oluşturulan ve Metformin 100 mg/kg/gün oral olarak verilen gruptur. Tüm dozlar 21. günden 49. güne kadar oral olarak uygulandı. 49. günde endometriyal lezyon alanı tekrar değerlendirildiğinde ve sol uterin boynuzu çıkarılıp, hayvanlar sakrifiye edildi. Kan örneklerinden östradiol(E2) , progesteron ve VEGF analizi ELİZA yöntemiyle bakıldı. Alınan dokular formaldehitte tespit edildikten sonra rutin doku takibinin ardından kesitler alınıp hematoksilen eozin boyandı. Dokularda PI3K, p-PI3K, AKT, p-AKT reaksiyonları immunohistokimyasal olarak değerlendirildi. Sıçan endometriozis ve uterus dokularına PI3K, p-PI3K ve AKT mRNA ekspresyon değişimi reverse transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanılarak ölçüldü. Grupların başlangıç ve son ağırlıkları arasında herhangi bir anlamlı farklılık saptanmadı. Kan E2 düzeyi Endometriozis+Metformin grubunda diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek saptandı. Progesteron ve E2 düzeyi kontrol grubuna göre Dienogest grubunda yüksek bulunması ile birlikte istatistiksel olarak anlamda değildi. En yüksek kan hormon değerleri Endometriozis+Metformin grubundaydı. Lezyon çapı hem Dienogest hem de Metformin grubunda azalmıştı. Metformin grubundaki azalma istatistiksel olarak anlamlıydı (P<0,05). PI3K, p-PI3K ve AKT ekspresyonu endometriozis odağında tedavi gruplarında artmıştı. Fakat uterus dokusunda PI3K ve p-PI3K ekspresyonu azaldığı saptandı. AKT ekpresyonu Metformin grubunda istatistiksel olarak anlamlı yüksekti. Sonuç olarak Metformin ve Dienogest endometriozis sıçan modelinde endometriozis implantların gerilemesine neden oldu. En etkili tedavinin makroskobik, biyokimyasal, mikroskobik ve moleküler düzeyde Metformin tedavisiyle olduğu belirlendi.
Doxorubicin ile oluşturulan nefrotoksisite üzerine difenhidraminin koruyucu etkisinin değerlendirilmesi
Doksorubisin (DOX), çeşitli tümörlerin tedavisinde kullanılan bir antrasiklin antitümör antibiyotiktir. Nefrotoksisite DOX kullanımının en sık görülen yan etkilerinden biridir ve bu nedenle kullanımı sınırlıdır. Dox'un sitotoksik etkilerini en aza indirmek için farklı bileşikler kullanılmaktadır. Bir antihistaminik ilaç olan difenhidraminin (DPH) DOX hasararına yanıt olarak antioksidan, anti-inflamatuar ve anti-apoptotik etkileri gösterebileceği ileri sürülmüş, ancak etki mekanizması henüz bilinmemektedir. Bu çalışmanın amacı, DPH'ın DOX kaynaklı nefrotoksisiteye karşı koruyucu etkisinin biyokimyasal, immunohistokimyasal ve histopatolojik yaklaşımlar kullanılarak belirlenmesidir. Kırk erkek Wistar sıçanları rastgele dört gruba ayrıldı: kontrol grubu, Dox grubu (20 mg/kg, i.p.), DPH grubu (20 mg/kg i.m.) ve DOX+DPH grubu (20 mg/kg i.p. ve 20 mg/kg i.m). 10 gün sonra sıçanların serum ve böbrek dokuları toplanarak biyokimyasal böbrek fonksiyon testleri, oksidatif stres belirteçleri, antioksidan enzim durumları ve histopatolojik değişiklikler incelendi. Serum üre (BUN), kreatinin (CR), katalaz (CAT), glutatyon (GSH), melondialdehid (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), total antioksidan kapasite (TAS), total oksidan kapasite (TOS), oksidatif system indeksi (OSİ) konsantrasyonları ELİSA tekniği ile tespit edildi. İnflamatuar durumu belirlemek için IL-1, IL-6, TNF-α ve CRP düzeyleri immünohistokimya ile değerlendirildi. DOX böbreklerde glomerüler vakuolizasyon ve dejenerasyon, Bowman kapsülüne genişleme, tübüler ve glomerüler kapiller dejenerasyon ve düzensizlik ve fibrozis gibi bazı histopatolojik değişikliklere sebep oldu. Ayrıca serum IL-1, IL-6, TNF-α ve CRP immünoreaktivitelerinin DOX grubunda arttığı gözlendi. DOX uygulaması serum BUN and kreatinin konsantrasyonunu artırdı. DOX uygulaması ile MDA ve ISO konsantrasyonu artarken GSH, SOD, CAT, TAS konsantrasyonları azaldı. DPH, böbrek dokusunda DOX kaynaklı histopatolojik değişiklikleri inhibe etti. DPH uygulaması serum kreatinin, BUN ve MDA düzeylerini azalttı, serum antioksidan parametrelerinde, enzimatik aktivitede ve inflamatuar proteinlerin ekspresyonunda doksorubisinin neden olduğu değişiklikleri tersine çevirdi. DPH antioksidan mekanizmayı iyileştirerek, inflamasyonu azaltarak ve böbreğin histolojik yapısını koruyarak Dox'un neden olduğu nefrotoksisiteyi hafifletti. Toplu olarak bu bulgular, DPH sıçanlarda DOX kaynaklı nefrotoksisiteye karşı koruyucu etkilerini ortaya koymaktadır. Böylece DPH, DOX kaynaklı böbrek toksisitesine karşı umut verici yeni bir koruyucu ilaç olarak etkinlik göstermiştir.
MCF-7 VE MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin metastatik karakterine silymarin'in etkisinin 2 boyutlu ve 3 boyutlu kültür yöntemleriyle karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi
Meme kanseri, dünya genelinde kadınlar arasında en yaygın kanser türlerinden biridir ve metastaz, kanserin ölümcül hale gelmesinde kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışmada, Silymarin'in iki farklı meme kanseri hücre hattı (MCF-7 ve MDA-MB-231) üzerindeki etkileri incelenmiştir. Hücreler, hem iki boyutlu (2D) hem de üç boyutlu (3D) kültürlerde yetiştirilmiş ve Silymarin ile tedavi edilmiştir. Araştırmada, Silymarin'in hücrelerin yayılmasını ve metastazla ilişkili gen ve proteinlerin ekspresyonunu nasıl etkilediğini belirlemek için çeşitli analizler yapılmıştır. Bu çalışmanın amacı, meme kanseri hücre hatları olan MCF-7 ve MDA-MB-231'de, silymarin'in metastatik özellikler üzerindeki etkilerini araştırmak ve bu etkilerin iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) hücre kültür modellerinde nasıl farklılaştığını değerlendirmektir. Çalışmada silymarin'in etkin dozunu belirlemek amacıyla MTT hücre canlılığı analizi hem 2D hemde 3D kültür metodları kullanılarak tayin edildi. Belirlenen dozlar ile 2D kültür metodları olan yara iyileşme deneyi, PCR, Western Blot ve immünohistokimyasal analizler kullanılarak epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) proteinlerinin ifadeleri değerlendirildi. Eş zamanlı olarak 3D kültür yöntemiyle sferoid oluşturularak transwell hücre göçü, PCR, Western blot ve immünohistokimyasal analizler gerçekleştirildi. Genetik analizleri ve histokimyasal analizler için hücrelere uygulamalar yapıldı. Sonuç olarak, silymarin'in hem 2D hem de 3D hücre kültür modellerinde meme kanseri hücrelerinin proliferasyonunu, göçünü ve EMT sürecini etkili bir şekilde modüle edebildiği bulunmuştur. 3D kültürler, silymarin'in anti-kanser etkilerini kapsamlı bir şekilde yansıtmakta ve in vivo ortamı daha iyi taklit ederek gerçekçi sonuçlar elde etmektedir. Çalışmamızın bulguları, silymarin'in meme kanseri tedavisinde potansiyel bir ajan olarak değerlendirilebileceğini desteklemektedir.
Diyabetik sıçanlarda yara iyileşmesi üzerine incir çekirdeği yağı ve safranın etkileri
Amaç: Bu çalışmanın amacı, incir çekirdeği yağı ve safranın diyabetik yaralarda iyileşmeyi destekleyici etkilerini değerlendirmektir. Elde edilen veriler, doğal ürünlerin tedavi potansiyeline katkı sağlayabilir. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada, 6–8 haftalık, 250–350 g ağırlığında toplam 42 adet erkek Wistar albino sıçan kullanıldı. Hayvanlar, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık döngüsünde, 25 ± 2 °C sıcaklık ve %60–65 nem oranına sahip standart koşullarda, ad libitum beslenme ile 7 gün süreyle adaptasyon sürecine alındı. Tüm hayvanlar tekli kafeslerde tutuldu, kafesleri günlük olarak temizlendi. Diyabetin induksiyonu için sıçanlara literatüre uygun olarak 50 mg/kg dozunda 1 M, 4,5 pH sodyum sitratla seyreltilmiş streptozotosin intraperitoneal olarak enjekte edildi. Cerrahi işlemler öncesinde intraperitoneal olarak xylazine HCl (10 mg/ml) ve ketamin HCl (50 mg/ml) ile genel anestezi sağlandı. Sıçanlar rastgele olarak 7 gruba (n=6) ayrıldı. Deneklerin sırt bölgesine orta hatta, 15mm çapında ve aralarında 1 cm mesafe bulunan üç adet tam kat deri insizyonu yapıldı ve 3., 10. ve 21. günlerde doku örnekleri alındı. Bulgular: Çalışmamızda, yara iyileşmesini değerlendirmek amacıyla makroskobik (ölçüm, gözlem, fotoğraf) ve mikroskobik (histolojik, immünohistokimyasal) yöntemlerle toplanadı; mikro veriler histolojik skorlama ile analiz edildi. Sonuç: İncir çekirdeği yağı ve safranın diyabetik sıçanlarda yara iyileşmesi üzerinde olumlu etkileri olabileceğine dair önemli bir anlayış sunabilir. Anahtar Kelimeler: Diyabet, Rat, Yara İyileşmesi, İncir Çekirdeği Yağı, Safran.
Kıkırdak rejenerasyonunu hızlandırmak için oluşturulan hidroksi apatit- grafen oksit- kitosan doku scaffold üzerine insan sünnet derisinden elde edilmiş mezenkimal kök hücrelerin uygulanması
Amaç: Kıkırdak dokusundaki rejenerasyon problemleri uzun vadeli etkili çözüm üretebilecek biyobozunur iskele ve kök hücrelerin kullanıldığı bir iskele önem kazanmaktadır. Böylece oluşturacağımız scaffold'da amacımız kıkırdak rejenerasyonunun oluşmasını sağlamak ve kıkırdak hasarı için uygun bir tedavi yöntemi oluşturmaktır. Gereç ve Yöntem: Hidroksiapatit-grafen oksit-ve kitosan bazlı bir iskele oluşturuldu. Daha sonrasında elde edilen scaffold üzerine İnsan sünnet derisi kökenli mezenkimal kök hücreler ekildi. Kök hücre scaffold etkileşimi için 2 saat inkübatörde bekletildi. Daha sonrasında scaffold içindeki kök hücreleri kondrositlere farklılaştırmak için 20 gün boyunca kıkırdak farklılaşma besiyeri uygulandı. Scaffoldlardaki kök hücrelerin kondrositlere farklılaştığını göstermek için histokimyasal analiz yapıldı. Bu analiz için Alcian Blue kullanıldı. Ve scaffold içindeki hücrelerin canlılığı için 1, 7, ve 14. Günlerde MTT analizi yapıldı. Bulgular: Scaffold üzerindeki kök hücrelerin kondrositlere farklılaştığını göstermek için kullandığımız Alcian Blue boyaması için 1 farklılaşma grubu 1 tane de kontrol grubu oluşturuldu. Kontrol grubu ve farklılaşma grubu arasındaki sonuçlara bakıldığında farklılaşma grubunda hücrelerin çekirdekleri kırmızı, matriksi ise maviye boyanmıştır. Fakat kontrol grubunda herhangi bir boyama olmamıştır. Bu bulgular bize scaffold içinde kök hücrelerin olduğunun göstergesidir. Sonuç: Bu çalışmada elde Hidroksiapatit-grafen oksit- kitosan iskelesi içinde insan sünnet derisi kökenli mezenkimal kök hücrelerin kondrositlere farklılaştığını göstermektedir.