Theses supervised by Doç. Dr. Mehmet Öztürk
11 theses · Bolu Abant İzzet Baysal University, Aksaray University, İnönü University
Mutations of THR169 and PRO172 amino acids of BSH enzyme from lactobacillus plantarum and structural and functional analysis of the mutants
Bile salt hydrolase (BSH) (EC 3.5.1.24) has a very important role in host metabolism. Glycine and taurine in bile salts can be liberated by BSH which is called deconjugation. This property of BSH exert health benefits to the host such as reduction of blood cholesterol. Therefore BSH active probiotic strains are used in the treatment of hypercholesterolemia related diseases. Moreover, using BSH active strains as an alternative to antibiotic growth promoter (AGP) is under research. However, deconjugation of bile salts may have side effects to the host. Studies showed the relationship between BSH and a couple of diseases; colorectal cancer, cholesterol gallstone and bowel diseases. For this reason, understanding the mechanism of BSH enzyme is crucial. Even though BSH effects on human are well studied, there are not enough information about its mechanism of catalytic activity, substrate preferences and folding. In this study, two conserved amino acids, Thr-169 and Pro-172 from Lactobacillus plantarum B14 strain were substituted for valine and histidine respectively in pCON1 construct by site-directed mutagenesis then mutant bsh genes were inserted into the pET22b expression vector, and expressed in Escherichia coli BRL(DE3) strain. Mutant BSH enzyme activities were determined by ninhydrin assay with six different human bile salts, glycocholic acid, glycodeoxycholic acid, glycochenodeoxycholic acid, taurocholic acid, taurodeoxycholic acid, taurochenodeoxycholic acid. The results showed that T169V mutation decreased the activity of BSH. Distinctly; inactive enzyme was obtained from P172H mutant. Meanwhile, stability and folding of the BSH proteins were not affected by these mutations. Our finding demonstrated that these two amino acids might be responsible for catalytic activity of BSH enzyme but not for stability of it.
Cloning of bile salt hydrolase gene (BSH) ) from human originated Lactobacillus plantarum and characterization of BSH enzyme by site directed mutagenesis
The gastrointestinal microbiota plays an important role in human physiology and is liable for nutritional, physiological and immunological functions of the host. Microbial colonization of gastrointestinal system significiantly affect the genetic factors of colorectal cancer etiology. The microbial products of the toxic secondary bile acids such as lithocholic acid and deoxycholic acid caused colon cancer by influencing inflammation, DNA damage and apoptosis induction. The hydrolysis of glycine or taurine-conjugated bile acids is the gateway reaction for the occurrence of secondary bile acids. BSH enzymes (EC 3.5.1.24) from various sources rather differ in characteristics, substrate preference and specificity. To show relationship between BSH enzymes and toxic secondary metabolites, structure of the BSH must be better understood, but the structure and reaction mechanism of such an important BSH enzyme are not known very well. Site-directed mutagenesis is used to understand the structure and function of the enzyme due to the importance of the substitution of the codons coding amino acids supposed to be responsible for substrate specificity. In this study, Lactobacillus plantarum B14 BSH gene encoding 324-amino acids was cloned and the codons of the partially conserved amino acids, Phe-18, Tyr-24, Asn-79, Leu-138 and Asn-180 supposed to be responsible for substrate specificity, substituted by site directed mutagenesis. All mutant BSHs were purified using an E. coli BLDRE3-pET22b expression system. The stability of the mutant enzymes and molecular weight 37 kDa were confirmed by SDS–PAGE. The high BSH activity of Lb. plantarum B14 was determined qualitatively by Direct Plate Assay and quantitatively by Ninhydrin assay. The effects of the mutations on substrate specificity and catalytic activities of BSH were investigated by partially purified of mutant BSH enzymes with six different bile salts. The study showed that Lb. plantarum B14-BSH exhibited greater hydrolysis toward glyco-conjugated bile salts compared to tauro-conjugated bile salts and the BSH activities of mutant enzymes showed signifciantly decreasing alternations towards different bile salts.
Molecular studies on the cloning and expression of human beta interferon gene in E. coli
Human interferon beta (hIFNβ), produced by many cell types in mammals in response to viral and nonviral infections, acts as an immunoregulator and have a potential to become an important therapeutic drug for several diseases such as multiple sclerosis, asthma, hepatitis B and C, human papillomavirus and various cancers. Considering the clinical applications and convenience of the rIFNβ production due to its molecular size, generating a low-cost production system, which could provide as much as pure and high yield of this therapeutic protein, is very important. Prokaryotic secretory systems are mostly preferred for the production in order to secrete proteins into the periplasm or out of the cell membrane. Thus, secretoy system simplifies the downstream processing and reduces the protein degradation and cost. It is a quietly desirable and customisable system for secretion of IFNβ1b. In Turkey, licensed domestic production of recombinant proteins, imported at high prices, has not been achieved. There are some reports describing the construction of novel vectors expressing human rIFNβ1b in the periplasm of the E. coli cells. In this study, for production of rIFNβ1b protein in periplasmic space, codon optimisated rIFNβ1b gene according to E. coli codon table was provided by in silico bioinformatic tools. The obtained gene was cloned into pET22b expression vector which contains the pelB signal peptide. Then recombinant IFNβ1b peptide synthesis was performed in E. coli/BLR(DE)3 strain induced with 0.4 mM IPTG at 25°C and then isolated from the medium, periplasmic and cytoplasmic space of the host and they were pufied with the Ni-NTA affinity colon. The production of the rIFNβ1b, (~18 kDa) was determined by %12 SDS-PAGE and Western Blot analysis. Our results indicated that the intracellular soluble expression of the optimized IFNβ1b protein did not take place. Eventhough, this was not confirmed by experimetally, we thought that because of the improper codon optimization, folded form of rIFNβ1b mRNA was produced and this structure prevented the translation of rIFNβ1b mRNA. Reconstruction of the prokaryotic secretion system and codon optimizations may improve the more convenient production and purification of rIFNβ1b protein.
Lactobacillus plantarum B14'den elde edilen rekombinant mutant safra tuzu hidroz (STH) enzimlerinin fonksiyonel ve yapısal analizi
Bile salt hydrolase (BSH), synthesized by some intestinal bacteria, catalyzes the hydrolysis of taurine or glycine-linked bile acid into the amino acid and deconjugated bile acid in human intestine. Deconjugated bile acids potentially play an important role in the reduction of blood cholesterol level and formation of some gastrointestinal diseases such as cholestasis, gallstone formation and colon cancer. Because of the link between BSH and human health, the structural and biochemical features of BSHs necessitate an intense study to better understand their role in regulating bacterial and host metabolism. BSHs exhibit higher variations in their catalytic activities and substrate specificities. However, six amino acids, supposed to be responsible from catalytic activity, are totaly conserved in all members of the BSH family. In order to analyze the correlation between two of these strictly conserved amino acids and catalytic activity of BSH, the asparagine-170 (N170) and arginine-223 (R223) amino acids were substituted for the valine-170 (V170) and phenylalanine-223 (F223) amino acids respectively by PCR-based site directed mutagenesis. The mutant recombinant BSHs (rBSHs) were expressed in E. coli BLR(DE3) strain. While the effect of the mutations on catalytic activity was detected by direct plate and ninhidrin assays, the effect of the mutations on formation of the BSHs was observed by SDS-PAGE analysis. It was found that V170 and F223 mutations resulted in prevention of BSH formation. This is the first experimental work showing that the N170 and R223 could be critical amino acids for folding or stability of the BSH, but not for the catalytic activity of this enzyme as predicted by in silico analysis of BSH related data in literature.
Yetişkinlik dönemi bağlanma türünün bireylerin siyasal liderlere yönelik bakış açılarıyla ilişkisi
Bu çalışma, bireylerin bağlanma stillerinin liderlik tercihleri üzerindeki etkilerini incelemeyi amaçlamaktadır. Araştırma bağlanma stilleri ile liderlik tarzları arasındaki ilişkiyi, ayrıca cinsiyet, sosyoekonomik düzey ve eğitim düzeyinin bu ilişkiler üzerindeki etkilerini analiz etmektedir. Bunun yanı sıra katılımcıların duygusal tepkisellik, dayanıklılık ve hassasiyetleri üzerine de incelemeler yapılmıştır. Bulgular, kaçıngan ve kaygılı bağlanma stillerinin liderlik tercihlerini önemli ölçüde şekillendirdiğini ortaya koymuştur. Kaçıngan bağlanma stiline sahip bireyler, daha otoriter ve kontrolcü liderlik tarzlarını tercih ederken, kaygılı bağlanma stiline sahip bireyler de benzer şekilde otoriter liderlik tarzlarına eğilim göstermektedir. Kaygılı bağlanma, karizmatik liderlik üzerinde ise olumsuz bir etki yapmaktadır. Eğitim düzeyi arttıkça, bireylerin karizmatik liderlik tercihleri de güçlenmektedir. Ayrıca, kadınların demokratik ve karizmatik liderlik tarzlarına, erkeklerin ise otoriter liderlik tarzlarına daha fazla eğilim gösterdiği saptanmıştır. Sosyoekonomik düzey ve eğitim düzeyi arttıkça, güvensiz bağlanma olasılıklarının azaldığı gözlemlenmiştir. Bu bulgular, liderlik eğitimlerinde bireylerin bağlanma stillerinin dikkate alınmasının önemini vurgulamaktadır. Ayrıca, liderlik tarzlarının geliştirilmesi ve bireysel farklılıkların yönetilmesi açısından bağlanma stillerinin rolünün ne kadar etkili olduğu araştırmada tespit edilmiş ve daha fazla araştırılması gerektiği sonucuna varılmıştır.
Lactobacillus plantarum GD2'den safra tuzu hidrolaz genlerinin (BSH) moleküler klonlanması ve karakterizasyonu
Bile Salts Hydrolase (BSH) enzymes catalyse the hydrolysis of taurine and glycine-linked bile salts into amino acid residues. The precise function of BSHs is still unknown, but some hypothesis have been proposed about playing role in nutrition, cholesterol lowering and colorectal cancer etc. BSHs are frequently synthesized by intestinal commensal lactobacilli. BSHs from different lactobacilli strains exhibit higher variation in sequence, pH optimum, kinetic properties and substrate specificity. In this study, bsh1 gene from L. plantarum GD2 was cloned into pET22b expression vector and overexpressed. At first; the gene was amplified by PCR using by species specific oligonucleotide primers and then cloned into pJET1.0 or pBluescript II SK+ cloning vector and pET22b expression vector. After clones were transformed to XL1-Blue and BLR(DE3) Escherichia coli host strains respectively, the bsh1 gene was expressed in E.coli BLR(DE3) host by induction of 0.1 mmol 1-1 of isopropylthio galactopyranoside. The overexpressed recombinant protein was purified using B-PER 6xHis Fusion Protein Purification Kit and deconjugation ability of the enzyme was tested with six conjugated bile salts by ninhydrin protein assay. Four genes, bsh1, bsh2, bsh3 and bsh4 were identified in the genome sequence of L. plantarum GD2 and sequenced. Comparison of the deduced amino acid sequences of Bsh1 with previously known sequences revealed high homology with BSH enzymes of several microorganisms. Biochemical characterization of the purified Bsh1 revealed some distinct characteristics not observed in other species of Lactobacillus. The purified Bsh1 enzyme showed preferential activity against glyco-conjugated bile acids and show highest activity against glycodeoxycholic acids. In this study, the primary structure of Bsh1 enzyme was characterized and analysed to further studies. It is thought that site-directed mutagenesis on conserved amino acids of BSH enzyme and structural analysis will be required for the future studies to investigate key residues of the active site, substrate binding pocket and substrate selectivity of BSH enzyme.
E.Coli de Lactobacillus plantarum dan izole edilen safra tuzu hidrolaz enziminde Arg16phe and Asp19leu mutasyonlarının oluşturulması ve karakterizasyonu
Probiotics are thought to have an important role in the lowering of the high cholesterol level that is shown as the main reason for cardiovascular diseases. Drugs used for treatment are expensive and have a lot of side effects so promoting the importance of the probiotics. There are a lot of studies proving that probiotics especially, intestinal bacteria such as Lactobacillus and Bifidobacterium, are lowering the amount of cholesterol with their Bile salt hydrolase (BSH) enzymes, but we do not know much about this enzyme. To characterize BSH enzyme one of the methods is; site direct mutagenesis and the other method is crystallography. However, no mutagenesis study on BSH enzyme was found in literature except Cys2 amino acid. In this study, fully conserved amino acids, Arg-16 and Asp-19 of L. plantarum species, were substituted for phenylalanine and leucine amino acids respectively in pCON1 construct using appropriate primers. Afterwards, mutant bsh genes were transferred to pET22b expression vector. The recombinant mutant proteins were purified using a Ni2+ chelated column and then were analyzed in respect to their activity and stability by direct plate assay, ninhidrin assay and polyacrylamide gel electrophoresis, respectively.While Direct plate assay and Ninhidrin assay results indicated that all of the mutations resulted in inactive BSH enzymes, polyacrylamide gel electrophorese results showed that Arg-16 mutant BSH protein was folded, but Asp-19 mutant protein was not. Our results revealed that while Arg-16 amino acid is responsible for the catalytic activity of BSH enzyme, Asp-19 amino acid is required for the folding of the BSH enzyme and its stability. Therefore, this work emphasized that further site directed mutagenesis studies, especially on the amino acids supposed to be responsible for catalytic activity and bile salt substrate specificity of the BSH enzyme, are required.
Süfyân b. Uyeyne'nin fıkhî görüşlerinin Hanefî mezhebi açısından tahlili
Süfyan b. Uyeyne hicri ikinci yüzyılın bilinen önemli ulemasından biridir. Bu çalışmada etbâu't tâbiîn döneminin önemli isimlerinden olan Süfyân b. Uyeyne el Hilalî'nin fıkhî görüşleri tespit edilerek Hanefî mezhebi ile karşılaştırılması yapılmıştır. Bu amaçla hadis kaynakları, tabakât, mezhep ve çeşitli tefsir kitapları araştırılmış, bunlar içerisinde dağınık halde bulunan bilgilerden faydalanılmıştır. Çalışmamız giriş ve iki bölümden oluşmaktadır. Girişte çalışmanın konu, sınır, yöntem ve kaynaklarına değinilmektedir. Birinci bölümde Süfyân b. Uyeyne'nin yaşadığı dönem, hayatı ve ilmî kişiliği hakkında bilgiler verilmektedir. İkinci bölümde temizlik, namaz, zekat, oruç ve hac gibi ibadetlere dair görüşleri Hanefi mezhebi ile karşılaştırılarak genel bir tahlil yapılmaktadır. Üçüncü bölümde Süfyân b. Uyeyne'nin muamelat ve ahvalu'ş şahsiyeye dair görüşlerinin Hanefi mezhebi ile karşılaştırılması yapılmıştır. Ayrıca sonuç bölümünde karşılaştırma tablolaştırılarak okuyucuya kolaylık sağlanması amaçlanmaktadır.
Şeybani'nin el-Asl isimli eserinde istihsan metodunun uygulanışı
Bu tez Muhammed b. Hasan eş-Şeybânî'nin Kitâbu'l-Asl isimli eserinde istihsan metodunun nasıl uygulandığını konu edinen bir çalışmadır. Söz konusu eser Hanefî Mezhebinin temel fıkıh kaynaklarından olması sebebi ile önem arz etmektedir. Çalışma üç bölümden oluşmaktadır. Birinci bölümde İmam Muhammed'in biyografisi ve çalışmamıza esas aldığımız eseri Kitâbu'l-Asl'ın tanıtımına yer verilmiştir. İkinci bölümde islam hukukunda istihsan metodu ile ilgili genel bilgiler yer almaktadır. Üçüncü bölümde ise Şeybani'nin Kitâbu'l-Asl'ında yer alan istihsan örneklerine yer verilmiştir. Anahtar kelimeler: İslam Hukuku, Fıkıh, Şeybâni, Kitâbu'l-Asl, İstihsan
İslam hukukunda kadının şahitliğinin cinsiyet ile temellendirilmesine analitik bir bakış
Bu çalışmanın amacı, İslam hukukunda kadının şahitliğinin cinsiyet ile temellendirilmesine analitik bir bakış olarak değerlendirilmesidir. Yaptığımız çalışmanın sonucunda Kur'an ve hadislerde bu konunun nasıl gündeme geldiğini tespit ederek belirlemeye çalıştık. Araştırma olarak seçmiş olduğum bu konu, bazı önemli problemlerin çözümünü sağlayacak mahiyettedir. Çünkü konu olarak Kadının şahitliği meselesinin, bazı şeylerin ispatı sadedinde kullanılmasında etkisi bulunmaktadır. Şahitlik başlı başına delil olması açısından İslâm Hukukunda önemli bir yer teşkil etmektedir. Hz. Peygamber (sav), herhangi bir dava için huzuruna gelenlere şahit getirmelerini ve meramlarını anlatırken, olayı olduğu gibi anlatmalarını talep ediyordu. Çünkü Hz. Peygamber (sav) nihai hükmünü, şahitlerin beyanları muvacehesinde veriyor ve şahitliğin ehemmiyetini vurgulama babında "Güneş kadar açık biliyorsan şahitlik yap, yoksa bırak!" şeklinde şahide ikazda bulunuyordu. Kur'an, erkek ve kadını bağımsız kişiliklere sahip bireyler olarak ele almıştır. Ancak bu iki cinsin fizyolojik ve psikolojik özellikleri birbirinden farklı olduğundan erkek ve kadın, her konuda eşit değerlendirilmemiştir. Unutulmamalıdır ki, her eşitsizlik, adaletsizlik demek değildir. Allah'ın erkek ve kadın hakkında koyduğu hükümler, bir bütün olarak değerlendirildiğinde mutlak bir eşitliğin olmadığını, ancak hiç kimsenin hakkını zayi etmeyecek şekilde adale-tin tesis edildiğinin rahatlıkla görülebileceği kanaatindeyiz. Çalışmamızda da kadının şahitliği konusu çerçevesinde oluşan birtakım şüpheleri belirtip bu şüpheleri değerlendirdik. Anahtar Kelimeler: İslam Hukuku, Şahitlik, Kadının Şahitliği
Azerbaycan aile hukukunun İslam aile hukuku ile mukayesesi
Azerbaycan aile hukukunun İslam aile hukuku ile mukayesesinin yapılmasının amaçlandığı çalışmada, Azerbaycan ve İslam hukukunda aile kavramı nikah, evlilik, boşanma ve nafaka ile ilgili hükümler incelenirken, Azerbaycan Aile Mecellesi ve İslam dinindeki mezheplerin ilgili görüşleri mukayeseli olarak incelemiştir. Azerbaycan'da, geçmişten gelen kültürünün de etkisiyle aile kavramına önem veren bir yapı hakimdir. Çoğunlukla geniş aile yapısının hakim olduğu ülkede erkeğin egemen olduğu ataerkil bir yapı bulunmaktadır. Günümüzde geniş aileler yerini anne, baba ve çocuktan oluşan çekirdek aileye bırakmış olsa da aile büyüklerinin aile üzerindeki etkileri halen devam etmektedir. Azerbaycan'da aileye verilen değer Aile Mecellesindeki hükümlere yansımış durumdadır. Benzer şekilde İslam'da da aile kavramına önem verilmekte; ailenin yapısı, kurulması, korunması ve sürdürülmesi önemli görülmektedir. Kur'an-ı Kerim'de ve Hazreti Muhammed'in hadislerinde aile yapısı ile kadın ve erkeğin görevleri sarih bir şekilde ortaya konmaktadır. İslam dinin sevgi, saygı, hoşgörü, sağlıklı iletişim gibi kavramların aile ilişkilerinde de olması beklenmektedir. Ayrıca Hazreti Muhammed'in ailesi ile yaşadıkları İslam dininde aileye verilen önemi açıklamak konusunda yol gösterici mahiyettedir. Anahtar Kelimeler: Aile, Aile Hukuku, Azerbaycan, İslam Hukuku