Theses supervised by Prof. Dr. Arzu Ersöz
19 theses · Anadolu University, Eskişehir Technical Üniversity
Yaban turbu-peroksidaz çapraz bağlı katalitik kolon geliştirilmesi ve PEDOT/PSS üretiminde kullanılabilirliği
Bu çalışmada; yaban turbu horseradish peroksidaz (HRP) enziminin iyon değişim kromatografisi ile saflaştırılmasına yönelik 2-akrilamido-2-metil-1-propan sülfonik asit (AMPS) bağlı katyonik değiştirici özellikte kriyojel kolon geliştirilmiş ve bu kolonun HRP saflaştırılmasındaki etkinliği araştırılmıştır. Daha sonra, saflaştırılan HRP kullanılarak kriyojel kolon geliştirilmiş ve bu kolon kullanılarak enzimatik polimerizasyon yöntemi ile iletken poli(3,4-etilendioksitifoyen (PEDOT) polimeri sentezlenmiştir. Bu doğrultuda ilk aşamada; hidroksi etilmetakrilat (HEMA) monomeri, N,N' metilenbisakrilamit (MBA) varlığında polimerleştirilerek AMPS kriyojel kolon hazırlanmıştır. Şişme testi, BET, SEM ve FT-IR analizleri ile hazırlanan kriyojel kolonun karakterizasyonu, Bradford yöntemi ile saflaştırılan HRP' nin protein içeriği ve SDS Page analizi ile molekül ağırlığı belirlenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında; MBA, HEMA ve rutenyum tabanlı amino asit monomerleriyle fotosensitif çapraz bağlama (ANADOLUCA) yöntemi kullanılarak HRP kriyojel kolon hazırlanmıştır. Daha sonra, HRP kriyojel kolondan poli(sodyum 4-sitirensülfonat) (Na/PSS) ve 3,4-etilendioksitiyofen (EDOT) monomeri ile peristaltik pompa kullanılarak PEDOT/PSS polimeri sentezlenmiştir. Sentezlenen polimerin Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) ile molekül ağırlığı belirlenmiştir.
Bazı hastalıkların tanısı için sitrulin baskılı ve modifiye nanosensör geliştirilmesi
Multiple Skleroz (MS); özellikle genç erişkinlerde görülen, normal gelişimini tamamlamış olan miyelinin (sinirlerin etrafındaki kılıfın) yıkımı (demiyelinizasyon) ile şekillenen, sebebi tam olarak bilinmeyen santral sinir sisteminde dağınık lezyonların bulunduğu bir hastalıktır. Merkezi sinir sistemi, miyelinin yaklaşık % 35'i farklı izoform ve izomerlerin karışımını içeren miyelin kılıf ile korunmaktadır. Bu miyelin kılıfda en çok bulunan proteinlerden biri olan Miyelin Temel Protein (MBP) dir. MS hastalarında, MBP yapısındaki argininlerin sitruline dönüşmesi söz konusudur. Bu nedenle, sitrulin aminoasidinin tayininin gerçekleştirilmesi ile MS hastalığının varlığı tespit edilebilir. Romatoid Artrit (RA) ise, dünyada ve ülkemizde en sık rastlanılan otoimmün hastalıktır. RA'de sitrulinlenmiş yapılara karşı üretilmiş otoantikorlar uzun süredir bilinmekte ve tanı amacıyla kullanılmaktadır. Anti sitrulinlenmiş siklik protein (anti-CCP) antikorlarının keşfi RA tanısı için önemli bir aşama olmuştur. Bu çalışmada, sitrulin tayini için moleküler baskılama tekniği ile karbon nanotüp (CNT) ve Altın (Au) nanoparçacıkları yüzeyinde sitrulin aminoasidine duyarlı polimerler elde edilmiştir. Bu modifiye polimerler sayesinde MS hastalığında MBP'nin demiyelinizasyonu sonucu ortaya çıkan sitrulin aminoasidinin sitruline özgü bağlanma bölgeleri ile bağlanarak dedeksiyonunun sağlanıp sağlanmadığı araştırılmıştır. Diğer taraftan, RA'de ortaya çıkan ve sitrülinlenmiş yapılara spesifik bir şekilde bağlanabilen Anti-CCP otoantikorlarının sitrülin modifiye polimerle etkileştirildiğinde RA teşhisi gerçekleştirilip gerçekleştirilmediği araştırılmıştır.
Karbonik Anhidraz Enziminin Afinite Kromatografisiyle Saflaştırılması ve Biyoteknolojik Uygulamaları
Bu çalışmada, koyun karaciğerinden karbonik anhidraz (CA) enzimi, yeni bir afinite destek geliştirilerek saflaştırılmıştır. Bu tez kapsamında; öncelikle karbonik anhidraz enziminin inhibitörlerinden biri olan sülfonamid ile treonin aminoasidi arasındaki etkileşim mimik edilerek sülfonamid ve MA-Treonin ön-organizasyonu sonrası çapraz bağlayıcılar eşliğinde kriyojel kolon sentezlenmiştir. Sentezlenen kriyojel kolonun karakterizasyonu şişme testi, BET, FT-IR ve SEM analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın bir sonraki aşamasında, koyun karaciğerinden elde edilen ham ekstrakttan CA enziminin Hızlı Protein Sıvı Kromatografi (FPLC) ile saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılan CA enziminin Bradford yöntemi ile protein içeriği, UV spektrometrik ölçümler ile esteraz ve hidrataz aktivitesine göre optimum aktivite gösterdiği koşullar tespit edilmiş, Dairesel Dikroizm (CD) Spektroskopisi ile ikincil ve tersiyer yapılarındaki değişim değerlendirilmiş ve Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) ile molekül ağırlığı tayin edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Karbonik anhidraz, kriyojel kolon, sülfonamid, treonin, mimik etkileşim
Rekombinant anti-vegf üretilmesi ve nanokonjugatının geliştirilmesi
Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)'nin kanser metabolizmasındaki rolü literatürde ortaya konulmuş olup bu çalışmada, insan kanında da bulunan, VEGF'ye bağlanan ve iki zincirden oluşan bloklayıcı Anti-VEGF antikorunun rekombinant olarak üretilmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda, insan kanından total RNA izole edilmiş, buradan cDNA sentezlenmiş ve Anti-VEGF antikorunun iki zincirinin gen dizisine spesifik primerler kullanılarak PCR reaksiyonları ile anti-VEGF genleri klonlanmıştır. Daha sonra klonlanan genler yine aynı teknikle birleştirilip tek zincir haline getirilmiş ve uygun klonlama, ekspresyon plazmit vektörleri ve konakçılar ile birlikte ekspresyonu sağlanmıştır. Çalışmanın son aşamasında, konakçı bakteriden, ağır ve hafif zincirinin birbirine bağlı olduğu rekombinant Anti-VEGF antikorunun izolasyonu ve saflaştırması gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma nikel afinite kromatografisi kullanılarak sağlanmış ve Western Blot ile proteinin karakterizasyonu yapılmıştır. Daha sonra; Anti-VEGF antikorunun, dış ortam koşullarına dayanıklılığını arttırmak için, rutenyum tabanlı aminoasit monomerleri ile fotosensitif çapraz bağlamayı sağlayan ANADOLUCA metodu kullanılarak Nano-Anti-VEGF konjugatı üretilmiştir. Bu VEGF nanobloklayıcının karakterizasyonları Zeta ile boyut analizi, SEM ile yüzey morfolojisi ve CD spektroskopisi ile sekonder yapısı incelenerek ortaya konulmuştur. Nano-Anti-VEGF'nin ilaç sektöründe, tedavi sürecinin nasıl devam ettiğini izleyebilmek amacı ile moleküler görüntüleme teknolojisi sayesinde takip edilebilirliğini sağlamak için akridin, BODIPY ve FITC gibi farklı floresans özellikteki maddeler ile konjugatı sentezlenmiştir.
Üç boyutlu biyosargı geliştirilmesi için kolajen ve dopa'nın biyoteknolojik üretimi
Yara iyileşmesi birbirinden farklı hücreler, hormanlar ve büyüme faktörlerinin rol aldığı karmaşık bir olaydır. Son yıllarda, aljinat, kolajen, kitosan vb. içeren birçok yara sargısı ticari olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada kolajen tabanlı yara iyileşmesine katkıda bulunacak MADOPA içeren hidrojel geliştirilmiştir. Hidrojelde kullanılacak kolajen, koyun derisinden pepsin ekstraksyon yöntemi ile izole edilmiş, Sirius red miktar tayini, Uv-vis spektroskopisi, CD spektroskopisi, SDS-page ve FT-IR-ATR ile karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. Hidrojelin diğer yapı taşı olan MADOPA üretimi için, kültür Mantarından (Agaricus Bisporus) tirozinaz enzimi ekstraksyon, amonyum sülfat çöktürmesi ve sephadex g-75 jel filtrasyon ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma sonucunda karakterizasyonlar, FT-IR, SDS-page, BCA miktar tayini, tirozinaz aktivite tayini şeklinde yapılmıştır. Çalışmamızdaki üçüncü basamak poli (HEMA-MAH-Cu(II) kriyojel kolon kullanarak immobilize tirozinaz sistemi geliştirmektir. Elde edilen kolonun karakterizasyonu şişme testi, FT-IR, SEM ve kolon verimi ile karakterize edilmiştir. Dördüncü basamak MAT'ın MADOPA'ya dönüşmesidir. Bu basamakta immobilize ve serbest enzimin aktivite farkları son ürün MADOPA'ya bakarak karşılaştırılmıştır. Son basamak olarak yara sargısı olarak kullanılacak Kolajen-ko-DOPA-ko-MATrp-Ru(bipyr)2-Cl hidrojel sargı 3B biyoyazıcı ile geliştirilmiştir. Bu materyal, biyobozunabilir, biyouyumlu ve non-toksiktir.
10,12-pentakosadiynoik asit tabanlı biyotayin sistemleri
Doğada bulunan birçok biyolojik bileşik arasında, glukoz tartışmasız yaşam için en kritik olanlardan biridir. Bu çalışmada; polimerleştiği zaman eşsiz kromatik özellikler sergilemekte olan, konjuge polidiasetilen bir sistem oluşturan 10,12-Pentakosadiynoik asit (PCDA) tabanlı ve glukozun nitel analizini hedefleyen bir konjuge lipozomal yapı geliştirilmiştir. Uzun alifatik bir uca ve karbonil ile hidroksil gruplarına sahip PCDA'nın türevi olan PCDA-NHS; NHS/EDC yöntemi kullanılarak sentezlenmiştir. PCDA-NHS karakterizasyonu, FT-IR, 13C NMR, 1H NMR analizleri ile yapılmıştır. PCDA-NHS lipozom, 2 metakriloiloksietil fosforilkolin (MPC), ve PCDA kullanılarak ince film hidrasyon ve sonikasyon yöntemi ile sentezlenmiş olup; karakterizasyonu için Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), boyut ve zeta potansiyeli analizleri yapılmıştır. Lipozom, yaklaşık olarak 212,8 nm boyutunda bulunmuştur. Moleküler ağırlığı 25,5 kDa ve boyutu yaklaşık olarak 462,6 nm olan karbonhidrat bağlayıcı protein Konkanavalin A, sentezlenmiş olan lipozoma inkübe edilerek konjuge edilmiştir. Konjugasyon sonrasında lipozom boyutlatları zetametre cihazı ile yaklaşık olarak 791,1 nm olarak ölçülmüş ve protein konjuge edilmiş bu lipozomlarla glukoz deteksiyonu yapılarak kolorimetrik cevap yüzdeliği hesaplanmış olup UV absorpsiyon çalışmaları yapılmıştır. Sonuç olarak, elde edilen lipozomal yapının glukoz deteksiyonunda gelecek vadeden bir yaklaşım olduğu düşünülmektedir.
Şelataz saflaştırılması ve uygulamaları
Yapılan bu çalışmanın amacı, klorofil sentezinin ilk basamağı olan Magnezyum protoporfirini, protoporfirin IX ve Mg+2 varlığında ve magnezyum şelataz enzimi katalizliğinde laboratuvar koşulları çerçevesinde sentezlemektir. Bu doğrultuda yeşil bitki yapraklarından magnezyum şelataz enzimi izole edilerek saflaştırılmıştır. Magzeyum şelataz enzimini saflaştırmak için boya afinite kromatografi tekniği ve sibakron mavisi boya olarak kullanıştır. Sentezlenen boya afinite kolonunun karakterizasyonu, kızılötesi spektroskopi (IR), şişme testi ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüsü gibi parametreler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Saflaştırılan magnezyum şelataz enzimi ve magnezyum içeren protein karışımı, Magnezyum protoporfirin sentezi için destek materyal olarak, ANADOLUCA metodu ile Poli (HEMA-ko-Magzenyum-şelataz) kolonuna immobilize edilmiştir. Sentezlenen kriyojel kolonların karakterizasyonu için şişme testleri yapılmış ve IR ve SEM görüntüleri alınmıştır. Protoporfirin IX ve Mg+2 iyonunu içeren çözeltisinin kolondan geçirilmesiyle sentezlenen Magnezyum protoporfirin fluorimetrik yöntemle belirlenmiştir.
Kan tayin ve yapay kan unsurlarının geliştirilmesi
Yüksek kan kaybına neden olan cerrahi operasyonlar, kan transfüzyonu gerektiren acil durumlar ve transfüzyon sırasında ortaya çıkan hemolitik reaksiyonlar, eşleştirme işleminin yol açtığı zaman kaybı, viral hastalıkların bulaşma riski sebebiyle oksijen taşıyan kan ikamelerine olan gereksinim, son dünya savaşı itibari ile fazlasıyla artmıştır. Salgın hastalıklar, doğal ve insan kaynaklı felaketler nedeniyle ortaya çıkan kan ihtiyacını karşılama amacıyla kullanılması hedeflenen oksijen taşıyan kan ikameleri ile ilgili çalışmalar, son yıllarda yeni bir biyoteknoloji araştırma alanı oluşturmuştur. Bu çalışmada ise oksijen taşıyan kan ikamesi olarak kullanılması amaçlanan hemoglobin kapsüllenmiş lipozom sistemleri geliştirilmiştir. Hemoglobinin zamanla oksitlenip methemoglobine (met-Hb) dönüşmesini engellemesi amacıyla antioksidan olarak kullanılan seryum oksit nanopartiküller de (nanoseria) lipozomun içine enkapsüle edilmiştir. Karakterizasyon işlemi Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), boyut analizi için ZetaSizer ve kapsülleme veriminin belirlenmesi için UV-vis spektroskopisi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak, hemoglobin bazlı oksijen taşıyan kan ikamesi, toksik ve antijenik olmayan, stabilitesini uzun süre koruyabilen nano-taşıyıcı sistem olarak geliştirilmiştir. Çalışmanın ikinci aşmasında ise likit kristale dayalı, kan grubu tayininde alternatif olarak kullanılabilecek evet/hayır prensibi doğrultusunda, yeni nesil ve hızlı teşhise yönelik bir yöntem geliştirilmiştir. Çalışmada öncelikle (4'-siyano-[1,1'-bifenil]-4-yl) boronik asit sentezlenip, NMR ile karakterize edilmiştir. Boronik asit, glikoza olan yüksek afinitesi sayesinde, anti-A ve anti-B antikorlarının yapısında bulunan glikoz ile etkileştirilmiştir. Nematik özellik kazandırılan antikorlar kan antijeni ile etkileştirildiğinde likit kristalin yönleniminde oluşan farklılık polarize ışık mikroskobu altında görüntülenmiştir. Anahtar Sözcükler: Lipozom, Hemoglobin, Nanoseria, met-Hb, Likit kristal
3B biyoyazıcı teknolojisi ile cerrahi sonrası peritoneal adezyonların önlenmesine yardımcı lidokain yüklü nanopartikül içeren membran geliştirilmesi
Yapılan çalışmada, 3B biyoyazıcı teknolojisi kullanılarak, cerrahi sonrası peritoneal adezyonların önlenmesine yardımcı, operasyon bölgesinde analjezi sağlamak amacıyla lidokain moleküler bellekli nanopartikül içeren, kullanımı kolay, biyouyumlu ve biyobozunur membran geliştirilmiştir. Üretilen membranın yüksek biyouyumluluğa sahip olması gerektiğinden, 3B biyoyazıcıda basımı yapılacak biyomürekkep, izole edilen kolajen, karboksimetilselüloz ve sentezlenen lidokain moleküler bellekli nanopartiküllerden oluşmaktadır. 3B biyobasım ile üretilen membran, çapraz bağlama ajanı olan EDC/NHS ve sitrik asit ile çapraz bağlanmıştır. Membranın karakterizasyon çalışmaları; SEM, optik mikroskop, şişme testi, biyouyumluluk ve biyobozunurluk testleri ile yapılmıştır. Ayrıca ilaç salım çalışmaları HPLC ile analiz edilip, kümülatif olarak hesaplanmıştır. Geliştirilen peritoneal adezyonları önlemeye yardımcı membranın biyouyumluluğu, adezyon gelişimi için kritik süre olan ilk 7 gün yapı bütünlüğünü yüksek oranda koruması, yüksek su tutma kapasitesiyle sonuçlanan hidrofilik özelliği, yoğun gözenekli yapısı ve hızlı lidokain salım profili ile rejeneratif tıp yaklaşımı olarak doku mühendisliği alanında kullanıma uygun yenilikçi bir üründür. Anahtar Sözcükler: 3B biyoyazıcı, kolajen, lidokain, peritoneal adezyon, rejeneratif tıp
Igy saflaştırılması ve biyogörüntüleme ajanı olarak değerlendirilmesi
Günümüzde biyolojik örneklerin görüntülenmesi, yaşam bilimlerinde moleküllerin, hücrelerin ve dokuların daha etkin bir biçimde analizi olarak kabul edilmektedir. Biyogörüntüleme teknolojisinin gelişimi, araştırmacıların örnekleri daha önce mümkün olmayan yollarla görselleştirmelerini ve ölçmelerini sağlamıştır. Görüntülemede nicel yöntemler ve görüntü analizindeki gelişmeler, bir teknoloji olarak görüntülemenin bilim dünyasına ne gibi katkılarda bulunabileceğini gözler önüne sermektedir. Yapılan tez çalışmasında, akciğer fibroblast hücreleri ile akciğer epitel karsinomu hücreleri arasındaki ayrımı kolaylaştıracak bir biyogörüntüleme yöntemi geliştirilmiştir. Çalışmada, özgün bir yöntem olan "Aminoasit Dekore Edilmiş Işık Destekli Konjugasyon Yaklaşımı" (ANADOLUCA) metoduyla sentezlenmiş floresans özellikteki İridyum kompleksi, yüksek yükleme kapasitesi nedeniyle laponit kiline bağlanmıştır. Ayrıca; antikor yönlendirici olarak, tavuk yumurta sarısından saflaştırılan immünoglobulin Y (IgY) kullanılmıştır. Saflaştırılan IgY'nin, SDS-PAGE, UV-Vis spektroskopisi, FT-IR ve CD spektroskopisi analizleri ile karakterizasyonu yapılmıştır. IgY'ye bağlı anti-transferrin antikor (ATAb) ile transferrinin etkileşimiyle kompleksin hücre içine girmesi sağlanarak floresans mikroskobunda görüntüleme yapılmıştır. Laponit ve İridyum (III) (Ir3+) kompleks için karakterizasyon çalışmaları FT-IR, Zeta boyut analizi, floresans spektroskopisi, SEM analizleriyle yapılmıştır. Son olarak floresans mikroskobuyla görüntüleme yapılarak kompleksin biyogörüntüleme ajanı olarak etkinliği gösterilmiştir.
Biyonanokonjugatların yapay kan amaçlı kullanımlarının araştırılması
Yapay kan, kanın oksijen taşıma görevini yerine getiren, tüm kan grupları ile uyumlu, mikroorganizmalardan arındırılabilen ve kanın oksijen taşıma görevini yerine getiren maddelerdir. Bu amaçla, çalışmanın ilk aşamasında MACys monomeri kullanılarak P(HEMA-ko-MACys) nanoküreleri sentezlenmiştir. Bu nanokürelere, tiyo ene reaksiyonu esas alınarak Fe3+-Protoporfirin IX kovalent olarak bağlanmıştır. Sentezlenen P(HEMA-ko-MACys-Fe3+-Protoporfirin IX) nanokürelerinin oksijeni tersinir bir şekilde bağlayıp bırakabilmesi amacıyla bu nanoküreler P(HEMA-ko MACys-Fe2+ -Protoporfirin IX) nanokürelerine dönüştürülüp serum albumini ile kompleks oluşturması incelenmiştir. Karbonik anhidraz (CA), karbondioksiti bikarbonat ve protona dönüştüren bir metaloenzimdir. Çalışmanın ikinci aşamasında, CA enziminin saflaştırılması için, yeni bir biyokromatografik PHEMA-pABSA kriyojel kolonu sentezlenerek karakterize edilmiştir. Poli-ε-kaprolakton (PCL), birçok moleküle karşı yüksek geçirgenliğe sahip ve toksik olmayan biyobozunur sentetik bir polimerdir. Çalışmanın üçüncü aşamasında, bu polimer bir fotosensitif amino asit monomeri olan klorobis(2-2'-bipridil)MATyr-Ru(II) ile fonksiyonlandırılıp P(CL-Ru(II)bis(2-2′-bipiridil)MATyr) sentezlenmiştir. Enkapsülleyici ajan olarak bu polimer kullanılıp ANADOLUCA konsepti, çift emülsiyon çözücü buharlaştırma tekniği ve EDC/NHS yöntemiyle yeni bir oksijen taşıyıcı sistem olan P(CL-Ru(II)bis(2-2′-bipiridil)MATyr-ko-Hb-CA)-Fe2+/3+-Protoporfirin IX) nanoküreleri sentezlenip karakterize edilmiştir. Sülükler kan emici canlılar olup geleneksel tıpta kullanımı gün geçtikçe artmaktadır. Çalışmanın son aşamasında, yapay kan amaçlı sentezlenen biyonanokonjugatların tıbbi bir sülük türü olan Hirudo verbana tarafından besin olarak kullanılması ve hemoglobin türleri (oksiHb, metHb, deoksiHb) üzerindeki etkisi ayrıntılı olarak incelenmiştir.
Mimetik antimikrobiyal peptitlerin geliştirilmesi ve etkileşimlerinin incelenmesi
Antimikrobiyal peptit (AMP) sınıfından olan ve amfifilik bir lipopeptit olan surfaktinin mikrobiyal hücre zarını hedef alarak, delik gelişimine ve hücre çökmesine neden olduğu bilinmektedir. Özellikle Bacillus subtilis kaynaklarından surfaktinin fermentasyon ve saflaştırılması kritik önem taşıyan adımlardandır. Ayrıca bu biyosentez süreci sonrasında, biyokimyasal sentez ile mimetik surfaktin eldesi de yeni endüstriyel kullanım sahaları açısından büyük önem kazanmıştır. Bu amaçla, çalışmanın ilk aşamasında karnitini ligand olarak barındıran metal-şelat yapısına surfaktinin lipofilik uçlarını tanılayan molekül baskılanmış polimerler (MIP) sentezlenerek, kriyojel kolona gömüldüğü bir akış sistemi geliştirilmiş ve ardından biyo-ekstratlardan halkasal surfaktinin ayrımı ve saflaştırılması incelenmiştir. Bu tamamı tarafımızdan geliştirilen yeni ayırma malzemelerinin karakterizasyonlarının yanı sıra adsorpsiyon-desorpsiyon işlemleri de ortaya konulmuştur. Çalışmanın ikinci aşamasında, saflaştırılan halkasal surfaktinden yola çıkılarak lineer surfaktin (L-surfaktin) elde edilmiştir. Bunun için gerekli lipaz tabanlı kriyojenik kolon sistemi de ilk defa bu çalışmada üretilerek L-surfaktin ve D-sorbitol-L-surfaktin ile F127 pluronik-L-surfaktin mimetik AMP yapılarının biyokimyasal akış kolonunda sentezlenmesinde kullanılmış ve karakterizasyon işlemleriyle de desteklenmiştir. Çalışmanın üçüncü aşamasında ise üretilen halkasal ve lineer surfaktin tabanlı mimetik yapıların bijel (BJ) üretiminde ve hidroksiapatit (HAp) sentezinde kullanılabilirliği ortaya konularak elde edilen bulgular karakterizasyonla desteklenmiştir. Son olarak tez kapsamında sentezlenen surfaktin yapılarından yola çıkılarak hazırlanan mimetik AMP yapılarının antimikrobiyal etkileri incelenmiş ve tartışılmıştır.
Çok fonksiyonlu ve biyomimetik proprotein konvertazların (PPC) geliştirilmesi ve biyoteknolojik uygulamaları
Pankreatik ß-hücrelerinin otoimmün hasarı sonucu ortaya çıkan mutlak insülin eksikliğinde hastalar, mutlak veya göreceli bir insülin yetersizliğine karşı optimal glisemik kontrolün sağlanması için fizyolojik insülin salınımını taklit edecek ekzojen insülin uygulanmasına gereksinim duyarlar. Biyomimetik enzimlerin en büyük özellikleri, enzimlerin geri kazanımı ve geri kazanım özelliği olan enzimlerin tekrar kullanılabilirliğidir. Bu çalışmada; biyobenzer ilaç olan rekombinant insülinin üretim metodolojisinde yer alan rekombinant proinsülin mature insüline dönüşümünü katalizleyen mimik proprotein konvertaz enzim sentezi gerçekleştirilmiş ve aktivite çalışmaları yapılmıştır. Bu doğrultuda proinsülin-insülin dönüşümünü katalizleyen proprotein konvertaz enzimin aktif bölgesinde yer alan histidin, aspartik asit ve serin amino asitlerine monomerleşecek şekilde metakrilat fonksiyonel gruplar eklenerek moleküler baskılama teknolojisi ile Pyr-Arg-Thr-Lys-Arg-MCA molekülü kalıp olarak kullanılıp literatürde yer almayan mimik proprotein konvertaz enzimi sentezlenmiştir. Aktivite sonuçlarında Vmax 6,24 μmol/dak ve Km 3,23 olarak hesaplanmıştır. Sentezlenen mimik proprotein konvertaz enziminin 8 tekrarda aktivitesinde sadece %14 kayıp olduğu gözlemlenmiş olup, insülini oluşturan A ve B zincirlerini birleştirme yöntemiyle insülin üretme işlemindeki verim kayıplarının önüne geçilmesinin yanı sıra enzimatik proinsülin-insülin dönüşümündeki enzim üretim maliyetini azaltması beklenmektedir.
Geniş substrat spesifisitesine sahip tekrar kullanılabilir sentetik enzim geliştirilmesi
Bu çalışmada, doğal enzimlerin sınırlı substrat özgüllüğüne alternatif olarak, hemoglobin (Hbg) temelli, geniş substrat spesifitesine sahip nanoenzimlerin in vitro sentezi ve karakterizasyonu yapılmıştır. Hbg'nin aktif bölgesini taklit etmek amacıyla yapay Hem kompleksi sentezlenerek doğal Hbg ile kıyaslanmıştır. Sentezlenen nano Hbg ve zeolitik imidazol metakriloil histidin kafes (ZMHF) tabanlı mimik enzimleri, Fourier Dönüşümlü Kızılötesi spektroskopisi (FT-IR), Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve Zeta Sizer cihazları ile detaylı bir şekilde karakterize edilmiştir. SEM görüntülerinde nano Hbg yapıların morfolojisi ayrıntılı olarak sunulmuş olup, zeolitik yapıya eklenen metakriloilli fonksiyonel monomerler sayesinde morfolojide belirgin değişiklikler gözlemlenmiştir. Mimik nano Hbg enzimlerinin aktivitesini, kararlılığını genişletilmiş pH ve sıcaklık aralıklarında optimize etmek için Zeolitik imidazol kafesler eklenmiştir. Sentezlenen her bir enzim için substrata olan ilgisi, reaksiyon hızı, katalitik aktivitesi ve spesifik aktivitesi detaylı kinetik analizlerle belirlenmiştir. Uygulama çalışmaları kapsamında, Miyeloperoksidaz ve Hem Oksijenaz-1 enzimlerinin katalitik ürünlerinin tespiti için özgün prosedürler geliştirilmiş ve tatmin edici sonuçlar elde edilmiştir. Zimografi benzeri bir teknik uygulanarak basit, düşük maliyetli ve görsel olarak tayin imkanı sunan bir prosedür oluşturulmuştur. Elde edilen bulgular, mimik nano Hbg ve ZMHF temelli enzimlerin biyokataliz ve biyosensör uygulamaları için önemli bir potansiyel sunduğunu göstermektedir. Sunulan detaylı karakterizasyon verileri ve başarılı uygulama sonuçları, bu çalışmanın alana önemli bir katkı sağlayacaktır. Anahtar Sözcükler: Hemoglobin, Nanoenzim, Zeolitik imidazol kafesler, Aktivite.
Proteomik ön hazırlık amaçlı katı faz zenginleştirme sistemlerinin geliştirilmesi
Serum proteinleri hastalıkların teşhisini sağlayan biyolojik belirteçlerin belirlenmesi için kullanılır. Kan serumunda albumin ve immunoglobulin G (IgG) oldukça yüksek derişimde olduğundan, bu proteinler düşük derişimde olan biyolojik belirteçlerin tayinini engeller. Bu nedenle; serumun yaklaşık olarak % 80'inini oluşturan albumin ve IgG'nin serumdan uzaklaştırılması önem kazanmaktadır. Bu tez çalışmasında, öncelikle üç farklı nanopartikül sistemi ile kan serumundan albumin ve IgG'nin uzaklaştırılması gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, Fe2O3 nanopartiküllerine ilkinde Protein A (Pro A), ikincisinde Cibacron Blue F3GA (CB) ve üçüncü olarak da aynı anda hem Pro A hem de CB bağlanmasıyla üç farklı katı faz sistemi hazırlanmıştır. Hazırlanan nanopartiküller karakterize edilerek, sulu çözeltiden ve serumdan albumin ve IgG uzaklaştırılması gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan katı-faz sistemlerinin albumin ve IgG'yi etkili ve hızlı bir şekilde uzaklaştırabildiği gözlenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında ise, yumurtalık kanseri teşhisinde biyolojik belirteç olarak kullanılan kanser antijen (CA 125) ve lizofosfatidik asit (LPA) tayini için katı-faz sistemleri hazırlanmıştır. Moleküler baskılama yöntemi kullanılarak karbon nanotüp (CNT) ve Fe2O3 nanopartikülü katı desteğine fosfoserin ve LPA baskılanmasıyla CA 125 ve LPA'yı tanıyabilen nanosensörler sentezlenmiş, karakterize edilmiş ve nanosensörlerin tayin limitleri belirlenmiştir.
Neo-natal fc reseptör (fcrn) saflaştırılması için kolon geliştirilmesi
Neo-natal FcRn reseptör, insanda FCGRT geni tarafından kodlanan ve molekül kütlesi 46 kDa olan bir proteindir. IgG-Fc reseptörü olarak da bilinmektedir ve majör histokompatibite kompleksi (MHC) sınıf I yapısına benzemektedir. FcRn reseptörü, anne-çocuk arasında gerçekleşen IgG döngüsünün gözlenmesinde etkin rol oynayan tek reseptördür veIgG antikoruna Fc bölgesinden bağlanmaktadır. Ayrıca; asidik pH (6.0-6.5)'da bağlanma gözlenirken fizyolojik pH ya da daha yüksek pH'larda etkinlik gözlenmemektedir. Bu nedenle; Fc reseptörlerinin ayırımı ve saflaştırılması, immunoglobulin yapısında olan ilaç taşıyıcı, ayırma ve diagnostik platformların geliştirilmesinde önemli rol oynayacaktır.Bu çalışma kapsamında; neonata lFcRn reseptörünün insan plasentasından ayırımı ve saflaştırılması için IgG yapısının bir monomer ligand olarak kullanıldığı ve fotosensitif polimerizasyon yoluyla sentezlendiği P(IgG-co-HEMA) kriyojel kolon hazırlanmıştır. Bu doğrultuda; ilk olarak plasenta epitelyum dokusundan özellikle sinsitiyotrofoblastların bulunduğu bölümlerden alınan kesitler Triton X 100 ile homojenize edilmiştir. Daha sonra; IgG-FcRn etkileşiminin asidik pH'larda gerçekleşip fizyolojik pH'larda gerçekleşmemesinden yararlanılarak ve P(IgG-co-HEMA) kriyojelinin kolon malzemesi olarak kullanıldığı Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) ileFcRn reseptörünün ayırımı sağlanmıştır.
Hiyaluronik asit tabanlı ve hedefli nano taşıyıcı sistem geliştirilmesi
Dünya Sağlık Örgütünün (WHO) istatistiklerine göre her yıl yaklaşık 8,8 milyon insan kanserden hayatını kaybetmektedir ve 2020 yılı içerisinde bu ölümlerin 13 milyonu geçmesi beklenmektedir. Mevcut kanser ilaçlarının dezavantajlarını elimine etmek için hedeflenmiş nano-taşıyıcı sistemler üzerine çalışmalar önem kazanmıştır. Bu çalışmada; tümör hücre yüzey reseptörü olan CD44'ü hedefleyecek Hiyaluronik asit (HA) tabanlı nano-taşıyıcı lipozomal yapı geliştirilmiştir. Yaklaşık 95 kDa boyutunda HA, Streptococcus equi hücre kültüründen Sephadex G-75 kullanılarak saflaştırılmış ve, immobilize Hiyaluronidaz kolon sistemi ile 5 kDa boyutuna getirilmiştir. HA karakterizasyonu, Jel Geçirgenlik Kromotografisi (GPC), Heksadesiltrimetilamonyum bromür (CTAB) yöntemi ile yapılmıştır. Saflaştırılan HA, ANADOLUCA yöntemi ile hedefleme ajanı olarak kullanılacak MATyr-Ru(bipy)2-HA kompleksine dönüştürülmüş, ayrıca hem ikincil ajan olarak hem de görüntüleme için ''Green Fluorescent Protein'' (GFP) kullanılmıştır. siRNA enkapsüle lipozom, 1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC), 2 metakriloiloksietil fosforilkolin (MPC), ve kolesterol (Chol) kullanılarak ince film hidrasyon ve sonikasyon yöntemi ile sentezlenmiş; karakterizasyonu için Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), boyut ve zeta potansiyeli analizleri yapılmıştır. Lipozom, yaklaşık olarak 90 nm boyutunda bulunmuştur. Sonuç olarak, elde edilen nano-taşıyıcı lipozomal yapının kanser hücrelerinin hem görüntülenmesinde hem de tedavisinde umut vadeden bir yaklaşım olduğu düşünülmektedir.
AGO2 proteininin saflaştırılması ve mikro RNA etkileşimlerinin incelenmesi
Bu çalışmada; RNA interferansı efektör proteini olarak bilinen Argonat 2 (AGO2) proteininin immunoafinite saflaştırılması ve AGO2 proteini içeren nanoprotein partiküller hazırlanarak, hazırlanan bu nanoprotein partiküllerin mikro RNA (miRNA) bağlanma etkinliklerinin kantitatif olarak belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun için ilk aşamada, fotosensitif rutenyum tabanlı amino asit monomeri, bis(2-2ʹ-bipiridil)(MATrp)2-rutenyum (II) kullanılarak ANADOLUCA metoduna göre poli(HEMA-ko-anti-AGO2) kriyojeli sentezlenmiş ve SEM, FT-IR ve su tutma kapasitesi testi ile karakterize edilmiştir. Daha sonra; sentezlenen bu kriyojel kolon ile AGO2 proteini, sığır karaciğeri sitoplazma ekstraktından tek adımda immunoafinite yoluyla saflaştırılmıştır. Saflaştırılan örneğin moleküler ağırlığı ve saflığının belirlenmesi için SDS-PAGE metodu; örnek içerisindeki AGO2 proteininin varlığını net olarak belirlemek için ise EMSA metodu kullanılmıştır. En son aşamada; AGO2 bazlı nano blok polimerler fotosensitif mikroemülsiyon polimerizasyonu metodu kullanılarak hazırlanmış ve hazırlanan bu partiküller SEM ve zeta ile karakterize edilip ticari miR-335' e bağlanma afiniteleri belirlenmiştir. Sonuç olarak, miR-335' in AGO2 partiküllerine yüksek bir afinite ile bağlandığı belirlenmiştir.
Protein G saflaştırılması için biyokromatografi materyali geliştirilmesi
Bu çalışmada Streptekokal Protein G saflaştırılmasına yönelik IgG bağlı makro gözenekli kriyojel kolon dolgu materyali geliştirilmiş ve bu kolon dolgu materyalinin Protein G saflaştırılmasındaki etkinliği araştırılmıştır. Bu amaçla; çalışmanın ilk aşamasında fotosensitif rutenyum tabanlı aminoasit monomeri, bis(2,2'-bipiridil)MATrp-MATrp-rutenyum(II) kullanılarak ANADOLUCA metoduna göre poli(HEMA-ko-IgG) makro gözenekli kriyojel sentezlenmiştir. Sentezlenen kolon dolgu materyali, şişme testi, SEM ve FT-IR analizleri ile karakterize edilmiştir. Poli(HEMA-ko-IgG)'nin bağlama kapasitesi çalışmaları rekombinat Protein G kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında; gerçek numune ile kolonun etkinliği incelenmiştir. Bu amaçla Streptococcus equi bakterisi kültüre edilmiş, hücre duvarı parçalanmış ve uygun ön deriştirme işlemlerinden sonra poli(HEMA-ko-IgG) kriyojeli kullanılarak Protein G saflaştırılmıştır. Çalışmanın son aşamasında ise saflaştırılmış Protein G'nin SDS-PAGE yöntemi kullanılarak molekül ağırlığı ve saflığı kontrol edilmiştir.