Theses supervised by Prof. Dr. Burhan Arıkan
15 theses · Çukurova University
Haloalkalofil bacillus sp. izolasyonu, amilaz selülaz ve ksilanaz enzimlerinin üretimi, karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulamalarda kullanılabilirliği
Bu çalışmada, Van Gölü topraklarından izole edilen haloalkaloflik Bacillus sp. suşlarından amilaz, selülaz ve ksilanaz enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla bakterilerin besiyerlerinde üreme ve enzim üretme yetenekleri ve aktivite gösterdiği optimum sıcaklık, pH ve NaCl konsantrasyonu saptanmıştır.Bacillus sp. AB-17 suşundan üretilen amilazın SDS-PAGE analizinde iki band elde edilmiş ve moleküler ağırlıkları 66.25 ve 58 kDa olarak belirlenmiştir. Enzim, optimum aktivitesini 150ºC ve pH 10.5'da gösterirken, 0.5-3.4M NaCl'de ortalama %67'lik aktivite ile halofil özellikte olduğu saptanmıştır.Bacillus sp.C-14 suşundan izole edilen endoglukanaz enzimin molekül ağırlığı 61 kDa olarak belirlenmiş, optimum aktivite ise 50°C'de pH 11.0'de görülmüştür. Maksimum enzim aktivitesi %20 (3.4M) NaCl konsantrasyonunda (%133) elde edilmiştir.Bacillus sp X13 suşundan elde edilen ksilanaz enziminin optimum aktivitesi 40ºC de pH 6.0'da gerçekleşmiştir. Enzim pH 5.0-6.0 aralığında 15 dk süreyle aktivitesini %100 koruyabilmiş, SDS-PAGE analizinde ise moleküler ağırlıkları 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kDa olan dört band tespit edilmiştir.Bu sonuçlara göre AB-17 amilaz enziminin Nişastanın sıvılaştırılması ve tekstil endüstrisinde nişastanın uzaklaştırılmasında kullanılabilecek bir enzim olduğu belirlenmiştir. C14 endoglukanaz enziminin tuzlu ortamlarda yüksek düzeyde aktivite göstermesi, halo-stabilitesinin yüksek olması ve deterjanlara dirençli olması bu enzimin tekstil uygulamaları, kağıt endüstrisi ve hayvan yemi üretimi gibi uygulamalarda kullanılabileceğini göstermektedir. X13 Ksilanaz enzimi ise besin endüstrisinde prebiyotik üretiminde ve selülaz ve pektinaz enzimine gerek kalmadan meyve suyu üretiminde kullanılabileceği önerilebilir.
Pseudomonas sp. suşlarında cold shock protein izolasyonu ve SDS-PAGE analizi
Bu araştırmada, soğuk şoku protein izolasyonu için Çukurova Üniversitesi Balcalı Hastane Laboratuarından alınan, Pseudomonas aeruginosa balcalı-1, Pseudomonas aeruginosa balcalı-2 ve Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 suşu kullanılmıştır. Soğuk şoku protein sentezi için, 5, 10, 20 ºC sıcaklıklar seçilmiş ve bu sıcaklık değerlerinde 60 ve 480 dakika süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Cold shock proteinlerin moleküler ağırlığının saptaması için, SDS-PAGE jel sistemi kullanılmıştır.P. aeruginosa ATCC 27853 suşundan izole edilen 1700 ve 18130 Da ağırlığındaki proteinler, diğer proteinlere göre daha fazla sentezlenmiştir. Bu iki protein soğuk şok muamelesi ile ortaya çıkmıştır.P.aeruginosa Balcalı 1 `in 20ºC' de 60 dakika ve 5, 10, 20 ºC'de 480 dakika sonra 77066 Da' luk cold shock protein sentezledikleri bulunmuştur.SDS_PAGE analizleri P. aeruginosa Balcalı-2 suşunda 22666 ve 21576 Da' luk iki farklı protein ürettiğini gösterdi.Araştırmada kullanılan suşlar içerisinde Pseudomonas Balcalı-1 ve 2 suşlarının, P. aeruginosa ATCC 27853 suşundan daha yüksek düzeyde soğuk şok yanıt oluşturmuştur.Sonuç olarak P.aeruginosa' nın 3 farklı suşu, soğuk şokuna maruz bırakıldığında, 10 ºC sıcaklıkta 60 dakika inkübasyon süresinde en fazla protein sentezi gerçekleştirmiştir.
Prostat kanserinin ELAC2 ve SRD5A2 genlerindeki polimorfizmler ile ilişkisinin araştırılması
Prostat kanseri, prostat bezindeki hücre proliferasyonu ve hücre ölümü arasındaki dengenin bozulması ve organ hacminin malign büyümesi olarak tanımlanabilir. Prostat kanseri hastalığına neden olan faktörler; hormonal, diyet, çevresel ve genetik faktörler olarak sıralanabilir. Prostat kanserine neden olan pek çok gen vardır. Bunlar; ELAC2, SRD5A2, HPC1, HPCX, AR, PSA ve vb. genler sayılabilir. ELAC2 geni 24 ekzondan meydana gelip, 25.1 kb büyüklüğündedir ve 17p11.2'de haritalanmıştır. Steroid 5?-redüktaz Tip II enzimi, 28.398kDa moleküler ağırlıkta olan bir enzimdir. Sorumlu olan gen SRD5A2 olarak isimlendirilmekte olup, 5 ekzon ve 4 introndan meydana gelmektedir. Bu gen, 2p22-23'te haritalanmış ve gen büyüklüğü yaklaşık olarak 56.4 kb'dır. Bu çalışmanın amacı; prostat kanseri ile ELAC2 geni Ser217Leu ve Ala541Thr polimorfizmleri ile SRD5A2 geninin Ala49Thr ve Val89Leu polimorfizmleri arasındaki ilişkiyi araştırmaktır. Bu amaçla, polimorfizmlerin bulunduğu bölgeler Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılmıştır. Polimorfizmler uygun restriksiyon enzimleri kullanılarak Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP) yöntemi ile belirlenmiştir. Bu çalışmada; ELAC2 geni Ser217Leu (p=0,001<0,05) ve SRD5A2 geni Ala49Thr (p=0,001<0,05) polimorfizmleri ile prostat kanseri arasındaki ilişki istatistiki olarak anlamlı bulunmuştur. Ancak, ELAC2 geni Ala541Thr (p=0,494<0,05) ve SRD5A2 geni Val89Leu (p=0,460<0,05) polimorfizmleri ile prostat kanseri arasındaki ilişki istatistiki olarak anlamlı bulunmamıştır.Anahtar Kelimeler: Prostat kanseri, ELAC2 geni, SRD5A2 geni
Cellulase-free alkaline xylanase enzim üreticisi Bacillus sp. suşlarının izolasyonu, enzim üretimi, karakterizasyonu ve biyoteknolojik kullanım olanaklarının araştırılması
Bu çalışmada, değişik ortamlardan izole edilen alkalifilik Bacillus sp. suşlarından selülaz aktivitesi olmayan ksilanaz izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla bakterilerin farklı sıcaklık ve pH aralığında katı besiyerinde üreme ve enzim üretme yetenekleri araştırılmıştır. Ayrıca çeşitli kimyasalların ve NaCl'ün farklı konsantrasyonlarının enzim aktivitesi üzerindeki etkileri belirlenmiştir.Bacillus sp. X6 suşundan üretilen enzimin SDS-PAGE analizi sonucunda moleküler ağırlıkları 62.4 kDa ve 22 kDa olan iki aktivite bandı tespit edilmiştir. Enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 30ºC bulunmuştur. Enzim 30-100ºC arasında 60 dakikada aktivitesinin yaklaşık %86'sını korumuştur. Enzim pH 8.0'de optimum aktivite gösterirken, 24 saat süreyle 30ºC'de pH 7.0-12.0 aralığında ortalama %57 kalan aktivite ile alkali-stabil özellik göstermiştir. X6 enzimi %15 NaCl konsantrasyonunda %60'lık optimum aktivite göstermiştir. H2O2 (%75), MnCl2 (%65) ve ß-merkaptoetanol (%149) enzim aktivitesini önemli düzeyde arttırırken, diğer kimyasallar aktivitede azalmaya neden olmuştur. İnce tabaka kromatografisi ile açığa çıkan hidroliz ürününün maltoz olduğu saptanmıştır.Bu sonuçlara göre X6 enzimi, psikrotolerant, ekstrem-termofil, mezofil, alkalifil, halotolerant, termostabil ve alkali-stabil özellik göstermektedir. Bu özelliklerinden dolayı X6 selülaz aktivitesi olmayan ksilanaz enzimi, bio-bleaching uygulamalarında, kağıt ve kağıt hamuru endüstrisinde, meyve suyunun saflaştırılmasında ve tekstil endüstrisinde ağartma işlemlerinde kullanılabilir özelliktedir.
Alkali soğukta aktif proteaz üreticisi Bacillus sp. suşlarının izolasyonu, enzim üretimi, karakterizasyonu ve enzimin biyoteknolojik kullanım olanakları
Bu çalışmada değişik ortamlardan izole edilen alkalifilik Bacillus sp. suşlarından alkalin cold aktif proteaz enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla bakterilerin katı besiyerlerinde üreme ve enzim üretme yetenekleri belirlenmiştir. Ayrıca değişik NaCl konsantrasyonunun ve çeşitli kimyasalların etkisi saptanmıştır.Bacillus sp. suşundan üretilen proteazın SDS-PAGE analizinde 49.5kDa moleküler ağırlığına sahip aktivite bandı elde edilmiştir. Enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 25ºC olduğu bulunmuş ve enzim 10-80ºC aralığında 30 dakikada %91.32 aktivitesini korumuştur. Enzim, optimum aktivitesini pH 12.0'da gösterirken, 24 saat süreyle 23ºC pH 8.0-12.0 aralığında ortalama %94.14 kalan aktivite ile alkali stabil özellik göstermiştir. NB-16 enzimi %5 NaCI konsatrasyonunda %92.14 optimum aktivite göstermişitir. Enzim aktivitesi ß-merkaptoetanol (%159), üre (%122), IAM (%177), PHG (%123) ile önemli düzeyde artarken, SDS (%54) ile aktivitede azalma gözlenmiştir.Bu sonuçlara göre proteaz enzimi, cold aktif, psikrotolerant, alkalifilik ve alkali-stabil özellik göstermektedir. Bu özelliklerinden dolayı cold-aktif alkalin proteaz enzimi gıda işletmeleri, özellikle deterjan ve biyoremesdiasyon gibi bazı endüstriyel uygulama alanlarında kullanılabilir özelliktedir
Cold aktif alkalin amilaz enzimi üreten Bacillus sp. suşlarının izolasyonu, enzim üretimi, karakterizasyonu ve endüstriyel kullanım olanaklarının araştırılması
Bu çalışmada, Ankara ve Tuz Gölü'nden izole edilen alkalifilik Bacillus sp. suşlarından amilaz enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu yapılmıştır. Bu amaçla, enzimin optimum aktivite sıcaklığı ve pH'sı, pH stabilitesi, sıcaklık stabilitesi, SDS-PAGE zimogram analizi ve ince tabaka kromatografisi analizi gerçekleştirilmiştir.Bacillus sp. NCA35 amilaz enziminin moleküler ağırlığı SDS-PAGE zimogram analizinde 205 kDa bulunmuştur. Enzim optimum aktivitesini 25ºC ve pH 8.0'de göstermiştir. Enzim 10-40ºC arasında 30 dakikada aktivitesinin yaklaşık %96'sını korumuştur. Amilaz enzimi 25ºC'de 24 saat süreyle ortalama %53 stabil kalmıştır. Enzimin aktivitesi %3 NaCl'de 60 dakika süre ile %56 korunmuştur. Enzimin aktivitesini %1 ß-merkaptoetanol (%103) indüklerken, 5mM BaCl2, EDTA, CaCl2, NaCl, ZnCl2, MnCl2, 3mM PMSF ve 8M üre, sırasıyla, %27, %42, %35, %43, %40 %36, %41 ve %58 inhibe etmiştir. İnce tabaka kromatografisi analizinde, reaksiyon ürünlerinin glikoz, maltoz ve maltoz türevli oligosakkaritler olduğu bulunmuştur.Bu sonuçlara göre, NCA35 enzimi, soğukta aktif, asido-alkali, termostabil ve pH-stabil özellik göstermektedir. Bu özelliklerinden dolayı NCA35 amilaz enzimi, deterjan, gıda ve içecek endüstrileri ile biyoremediasyon uygulamalarında ve prebiyotik üretiminde kullanılabilme potansiyeline sahiptir.
Termofil Bacillus sp.'den alkalin, termofilik, oksidant dirençli selülaz üretimi ve karakterizasyonu
Bu çalışmada Adana ilinden alınan toprak ve doğal gübre ile biyokompost örneklerinden Bacillus suşları izole edilmiştir. CMC substratı içeren katı besiyerinde çeşitli pH ve sıcaklık koşullarında Bacillus sp. CY-3 suşunun enzim üretme yeteneği araştırılmış ve maksimum enzim üretimi için optimum pH ve sıcaklık değerleri tespit edilmiştir. Daha sonra kısmi olarak saflaştırılan enzimin karakterizasyonu yapılmış ve endüstriyel kullanılabilirliği araştırılmıştır.SDS- PAGE yöntemi kullanılarak moleküler ağırlığı sırasıyla 80 kDa ve 72 kDa olan 2 bant tespit edilmiştir. Kısmi olarak saflaştırılmış enzim pH 9'da 100 ºC'de optimum aktivite göstermiştir. Aktivitesi 100 ºC'de 60 dk inkübasyon sonucunda pH 6-13 arasında %65'ten ve 20-120 °C arasında da %83'ten fazla aktiviteyle stabil olduğu tespit edilmiştir. Enzim EDTA, MnCl2, ZnCl2, MgCl2,SDS, Triton-X-100, Tween 20, Tween 80, Mercaptoethanol, Phenontroline, PMSF, Iadoasetamide ve üre varlığında sırasıyla %34, 53, 29, 36, 17, 32, 31, 29, 25, 33, 13, 34 ve 30 oranında inhibe olmuştur. Bununla birlikte, CaCl2, CoCl2 ve H2O2 varlığında ise sırasıyla %31, 21 ve 16 indüklenmiştir. %3 ile 30 arasında değişen çeşitli NaCl konsantrasyonlarında %66'dan fazla aktiviteyle stabil olduğu tespit edilmiştir.Sonuç olarak; Enzimin göstermiş olduğu yüksek termostabillik, pH stabilliği ve deterjanların, metal iyonlarının ve H2O2 gibi bazı katkı maddellerinin varlığındaki stabilliği bu enzimi tekstil, deterjan ve diğer endüstri uygulamalarında potansiyel olarak kullanışlı yapmaktadır.
Termohalofil bacillus sp.'den (Asidik, alkali ve nötral) selülaz enzimi üretimi ve karakterizasyonu
Bu çalışmada, topraktan ve komposttan izole edilen termofilik Bacillus sp.suşlarından asidik, alkali ve nötral selülaz enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.Bacillus sp.SC61 suşundan izole edilen CMCaz optimum aktivitesini pH3.0 ve 60°C'de göstermiştir. pH2.0-6.0 aralığında %42, 80-100°C aralığında %72 stabil olduğu, MnCl2 ve ß-merkaptoetanolle indüklendiği ve NaCl'ün değişen konsantrasyonlarında %89 stabil olmasıyla halostabil olduğu belirlenmiştir. Enzimin son ürünü maltozdur. Moleküler ağırlığı 88 kDa olarak belirlenmiştir. SC61 CMCaz enziminin EDTA ile %52 inhibe olması metalloenzim yapısında olduğunu PMSF ile tamamen inhibe olması serin veya thiol grubu bulundurduğunu göstermektedir.Bacillus sp.SC6 suşundan izole edilen CMCaz'ın optimum aktivitesini pH 6.0 ve 70°C'de gösterdiği, pH 4.0-8.0 aralığında %93, 50-90°C'de %97 stabil olduğu belirlenmiştir. Tween-20, ß-merkaptoetanol, EDTA, MnCl2ve NaCl ile indüklenmektedir. Enzimin son ürünü maltotriozdur ve moleküler ağırlığı 121kDa olarak hesaplanmıştır. PMSF ile %4 inhibe olması setin rezidüsü bulundurmadığını, EDTA ile %99 indüklenmesi metalloenzim yapısında olmadığını göstermektedir.Bacillus sp.SC41 suşundan izole edilen enzimin optimum aktivitesi pH 12.0 ve 70°C'de göstermiştir. %3-25 NaCl varlığında ortalama %109 aktivite göstermiştir. Son ürünü maltoz olarak belirlenmiştir. 30-100°C'de %87 ve pH 9.0-12.0 aralığında %87 stabildir. Moleküler ağırlığı 76 kDa olarak hesaplanmıştır. EDTA ile %35 inhibe olan enzim metalloenzim özelliğindedir. PMSF'yle %31 inhibe olması serin rezidüsü bulundurduğunu göstermektedir.Bu sonuçlara göre elde edilen CMCaz enzimlerinin, biostoning ve biofinishing uygulamalarında, gazete kağıtlarının geri dönüştürülmesinde, meyve suyu endüstrisinde, biyoetanol ve biyoyakıt üretiminde kullanılması önerilebilir.
Isolation and characterization of a novel tyrosinase enzyme from native bacterial straine, production of the enzyme by cloning, characterization of the recombinant enzyme and analysis of its biotechnological applications such as production of l-dopa and melanin
Tyrosinase is a type 3 copper-containing enzyme that catalyzes the conversion of L-tyrosine to L-DOPA and finally to melanin. Melanin has a broad spectrum of biotechnological and biological functions and it is widely used in pharmacology, cosmetics and other industrial fields. L-DOPA is the preferred drug for treatment of Parkinson's diseases. In this study a Bacillus sp. having tyrosinase enzyme was isolated from native and the strain was identified by morphological, biochemical and molecular analysis. Production of the enzyme by the native isolate was optimized using classical and statistical (Box- Behnken design) methods and the enzyme was characterized. After that the tyrosinase coding gene was cloned in two expression system (E.coli BL21 (DE3) pLysS and Rosetta-gami 2 (DE3) pLysS) using pET22b as an expression vector and expression of the gene in the two expression system was compared. The gene fragment was sequenced using with Sanger sequencing method. The sequence was subjected to insilico analysis using different bioinformatics programs and websites. Conversion of l-tyrosine to L-DOPA and melanin was evaluated by TLC and HPLC methods. The isolated strain showed up to 99% homology with Bacillus megaterium. Production of the enzyme by the native M36 Bacillus sp. was determined as 0.05IU/ml, after optimization of culture condition it was reached to 0.38 IU/ml; also this product was reached to 31 IU/ml after optimization of expression of recombinant M36 tyrosinase enzyme. The optimum temperature for native and recombinant M36 tyrosinase activity was 40 °C and 45-50°C also; optimum pH for native and recombinant enzyme activity was 7.0 and 7.5 respectively. In SDS-PAGE analysis the native and recombinant M36 tyrosinase enzyme determined as 34kDa and 35 kDa, respectively. M36 melanin produced in this research, showed structural similarity with standard synthetic melanin from sigma according to the solubility, FT-IR and EPR analysis. Also it showed notable anti-bacterial, anti-UV and ant-oxidant effects. MTT assay showed the M36 melanin to have anti-cancer effect.
Alkali ve termostabil keratinaz üretıcısı doğal Bacillus sp. ve Streptomyces sp. suşlarında genetik manipülasyon ile enzim üretıminin arttırılması, enzim üretimi, karakterizasyonu ve endüstriyel alanlarda kullanılabilirliliğinin araştırılması
Alkalin keratinaz; deri işletme, deterjan, tarım ve hayvancılık endüstrisi ile protein hidrolizatlarının üretimi gibi birçok alanda çok geniş bir kullanım alanına sahiptir. Mikrobiyal kaynaklı alkalin keratinaz araştırmaları ile ilgili çok kaynak mevcut olmakla birlikte, düşük maliyetli substrat ile yüksek verimlilikte enzim üretimi için çalışmalar yoğun bir şekilde devam etmektedir. Bu çalışmada, alkali ve termostabil keratinaz üreticisi doğal Bacillus sp. ve Streptomyces sp. suşlarının izolasyonu, tanımlanması, geliştirilmesi, besiyeri optimizasyonu ve enzimlerin biyokimyasal karakterizasyonu ve endüstriyel kullanılabilirlikleri analiz edilmiştir. Mutasyon çalışmaları sonunda UV mutant C11-UV8 suşunun üreme süresi 2 kat azalırken enzim veriminin 2.7 kat arttığı (1405 U/ml), EMS mutant C1-EMS80 suşunun keratinaz üretiminin 8 kat arttığı ve geniş sıcaklık aralığında ana suşa göre çok daha stabil olduğu saptanmıştır. Bacillus licheniformis C11 suşundan izole edilen Bacillus licheniformis C11 keratinaz geni, pET22b(+) vektör sistemine klonlanmış ve E.coli (Rosetta-gami (DE3)pLysS) hücresine transfer edilmiştir. Rekombinant protein (keratinaz) üretimi 18 saat sonunda ana suşa göre 3.3 kat artış göstermiştir (1728 U/ml). Elde edilen verilere göre doğal ve rekominant keratinaz enzimi; deri, deterjan, biyoremediasyon, yem ve tarım gibi endüstriyel uygulamalarda kullanılabilecek özelliktedir.
Doğal Bacillus sp. suşlarından β-mannanaz enzim izolasyonu, karakterizasyonu ve biyoteknolojik uygulanabilirliği
Bu çalışmada, topraktan izole edilen Bacillus sp. suşlarından elde edilen β-mannanase enziminin izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bakterilerin farklı pH ve sıcaklık aralıklarında katı besi yerinde üreme ve enzim üretme yetenekleri incelenmiştir. Farklı kimyasal, inhibitörler, şelatörler ve metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine etkisi gözlemlenmiştir. SDS-PAGE analizi sonunda MAN23 mannanase enziminin moleküler ağırlığının 40 kDa ile 15kDa ağırlığında 2 banddan oluştuğu saptanmıştır. Enzim optimum aktivitesini 60°C ve pH 6'da göstermiştir. Enzim 30°C ila 80°C derece arasında %93 oranında aktif olup mezotermofil özelliktedir. Enzim pH 6.0-8.0 arasında asidonötral özellik göstermiş olup aktivitesini %52 oranında korumuştur. Enzim MnCl2 ve β-merkaptoetanol ile %117 ve %108 oranında aktivite göstermiştir. %3, %5 ve %10 konsantrasyondaki NaCl ile reaksiyonda aktivite ortalama %52 olarak hesaplanmıştır. Yapılan yıkama performansı denemelerinde deterjan katkısı olarak kullanıldığında bebek maması, lekesinde %100 giderim sağlanmıştır. TLC analizi sonunda enzim mannanı D-mannoz, mannobioz ve mannotrioza hidroliz etmiştir. Bu sonuçlara göre MAN23 enzimi termotolerant, termofil, asidofil, halotolerant ve asidostabil özellik göstermektedir. Bu özelliklerden dolayı MAN23 mannanase enzimi deterjan, yem endüstrisinde ve biyolojik atıkların geri dönüşümünde kullanılabilir özellik göstermektedir.
Bacillus sp. suşlarından izole edilen asidik, alkali, termostabil amilaz ve pullulanaz enzimlerinin üretimi, karakterizasyonu ve biyoteknolojik kullanım olanaklarının araştırılması
Bu çalışmada, topraktan izole edilen nötral Aeribacillus pallidus NA1 suşundan alkali amilaz, asidik Geobacillus lituanicus NA2 suşundan asidik amilaz, nötral Geobacillus thermoleovorans NP1 suşundan asidik pullulanaz ve asidik Anoxybacillus rupiensis NP2 suşundan alkali pullulanaz elde edilmiş ve karakterize edilmiştir. Bu amaçla, enzimlerin optimum sıcaklık ve pH değerleri, sıcaklık ve pH stabiliteleri, çeşitli kimyasalların enzim aktiviteleri üzerine etkileri belirlenmiş, SDS-PAGE zimogram ve ince tabaka kromatografisi (TLC) analizleri gerçekleştirilmiştir. NA1, NA2, NP1 ve NP2 enzimlerinin optimum aktivite gösterdikleri pH değerleri, sırasıyla, 9.0, 4.0, 6.0 ve 9.0'dur. Optimum aktivite sıcaklıkları, sırasıyla, 50, 60, 50 ve 60ºC olan enzimler termofil özelliktedir. NA2 asidik amilaz ve NP2 alkali pullulanaz, nişasta ve pullulanı hidrolize ederek son ürün olarak glukoz, maltoz ve maltotrioz açığa çıkarmışlardır. Bütün enzimler, %30 konsantrasyona kadarki nişastayı ortalama %90 düzeyinde sıvılaştırmıştır. NA1 alkali amilaz ile BriX sisteminde %19 glikoz değeri elde edilmiştir. NA1 alkali amilaz 165 kDa, NA2 asidik amilaz 200 kDa ve NP2 alkali pullulanaz 113 kDa'dur. NP1 asidik pullulanaz, zimogram analizinde 112 ve 107 kDa'luk iki aktivite bandı göstermiştir. NA2 asidik amilaz ve %1 deterjan karışımı yemek sosu, bebek maması ve çikolata lekeleri üzerinde %100 performans göstermiştir. İzole edilen enzimler nişastanın sıvılaştırılması, biyoetanol üretimi ve deterjan endüstrisi başta olmak üzere, çeşitli biyoteknolojik ve endüstriyel uygulamalarda kullanımları açısından yüksek potansiyele sahiptir. Anahtar Kelimeler: Amilaz, Amilopullulanaz, Asidik, Alkali, Termofilik
Denizel kökenli asidik proteaz enzim üreticisi Bacillus sp. suşlarının izolasyonu, enzim üretimi, karakterizasyonu ve biyoteknolojik kullanım olanakları
Bu çalışmada Adana/Karataş bölgesi deniz suyundan Bacıllus sp. suşları izole edilmiştir. KAZEİN substratı içeren katı besiyerinde bakterilerin farklı Ph ve farklı sıcaklık koşullarında üreme ve enzim üretme yetenekleri incelenmiştir. Bacıllus sp. SG-11 suşunun enzim üretimi için optimum pH ve optimum sıcaklık değerleri tespit edilmiştir. Diğer aşamada kısmi olarak saflaştırılan enzimin karakterizasyonu yapılmış ve biyoteknolojik kullanım olanakları araştırılmıştır. Kısmi olarak saflaştırılan enzim optimum aktivitesini 70 ᵒC ph 5.0 de göstermiştir. Enzim pH 5.0-6.0 aralığında aktivitesini %92 oranında korumuştur. Enzim 20 ᵒC ve 150 ᵒC arasında %96 dan fazla aktif olduğu saptanmıştır. Farklı NaCI konsantrasyonlarında %3 ve %40 aralığında enzim aktivitesi %97 den fazla aktivite göstermiştir. Enzim EDTA, CoCl₂, SDS, Üre, PMSF, β-merkaptoetanol, CaCl₂, ZnCl₂, H₂O₂, Triton-X-100 varlığında %99 ve %118 aralığında aktivite göstermiştir. Yıkama performansında deterjan katkısı olarak kullanıldığında salça +yağ, bebek maması, kan, çikolata, ketçap lekelerinde %100 yakın etki göstermiştir. Yapılan TLC analizinde proteaz enzimi kazeini L-sistin, L-Glisin, Prolin ve Tyrozine aminoasitlerine hidroliz etmiştir. Anahtar Kelimeler: Proteaz , Bacillus sp.,SG-11, Asidik, Mezofil ,TLC
Bacillus sp. suşlarından üretilen asidik selülaz ve ksilanaz enzim kombinasyonu kullanılarak lignoselülozik materyalin enzimatik hidrolizi ve biyoetanol üretiminde kullanılabilirliğinin araştırılması
Çalışmada kendi izolatlarımız Bacillus sp. suşlarından selülaz ve ksilanaz enzimleri üretilmiş, karakterizasyonları yapılmış, suşlar moleküler olarak tanımlanmıştır. UV mutasyonu kullanılarak altı ve beş karbonlu şeker bileşiklerini fermente edebilen maya suşu geliştirilmiştir. Selülozik material önce fiziksel parçalama işlemleri sonra zayıf asit ve ısısal ön hidroliz işlemleri uygulanmış devamında farklı enzim kombinasyonları ile enzimatik hidrolize uğratılarak mutant ve rekombinat maya suşları ile etanol üretimi yapılmıştır. Selülaz üreticisi suş Bacillus cereus olarak tanımlanmıştır. Enzim optimum 60°C ve pH 6.0'da aktivite göstermektedir. Ksilanaz üreticisi suş Bacillus subtilis olarak tanımlanmıştır. Enzim optimum 50°C ve pH 6.0'da aktivite göstermektedir. Geliştirilen mutant Saccharomyces cereviciae suşu %23 alkol, %45 glikoz ve 35°C'de üreme yeteneği kazanmış, rekombinant ATCC 20618 suşu ile karşılaştırıldığında altı ve beş karbonlu şekerleri %86 alkole dönüştürmüştür. ATCC 20618 suşu ile %5 substrat kullanılarak elde edilen hidrolizattan 96 saatlik fermentasyon sonunda 0.35 ml/g, mutant suşumuzdan 0.30 ml/g etanol elde edilmiştir.
Doğal ve mutant Bacillus sp.suşlarından farklı ısıl kararlılığa sahip alkalin proteaz enzimlerinin izolasyonu, karakterizasyonu ve biyoteknolojik potansiyelinin araştırılması
Bu tez çalışmasında psikrofilik, mezofilik ve termofilik alkalin ekstraselüler proteaz enzim üreticisi doğal Bacillus sp. suşları izole edilmiştir. İzole edilen suşların biyokimyasal ve moleküler tanımlamaları yapılmıştır. Enzim verimliliğinin arttırılması amacıyla rastgele mutagenez (fiziksel, kimyasal ve kombine) uygulamaları ile suşların geliştirilmesi sağlanmıştır. Geliştirilen mutant suşların proteaz üretim ortamları optimize edilerek enzim üretimleri gerçekleştirilmiştir. Optimum enzim sentez koşullarında doğal ve mutant suşlardan üretilen proteaz enzimleri kısmi olarak saflaştırıldıktan sonra karşılaştırmalı olarak karakterize edilmiştir. Karakterizasyon çalışmalarında enzimlerin optimum pH ve sıcaklık değerleri, pH ve sıcaklık stabiliteleri, çeşitli kimyasalların varlığındaki stabiliteleri ve substrat spesifiteleri belirlenmiştir. Ayrıca ince tabaka kromatografisi (TLC) ve HPLC analizleri ile de kazein hidroliz ürünleri tespit edilmiştir. Karakterizasyon sonrası doğal ve mutant enzimlerin farklı endüstriyel alanlarda kullanılabilme potansiyellerinin belirlenebilmesine yönelik karşılaştırmalı uygulamalar yapılmıştır. 16s rRNA analizleri ile psikrofil, mezofil ve termofil alkalin proteaz üretici suşlar sırasıyla Bacillus mobilis TK31, Bacillus cereus TK16 ve Bacillus subtilis PTK56 olarak tanımlanmıştır. Psikrofil, mezofil ve termofil enzimlerin optimum aktivite gösterdikleri pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla, 9.0 ve 10ºC; 10.0 ve 40ºC; 9.0 ve 55ºC'dir. Rastgele mutasyonlar sonucunda en yüksek verim Bacillus mobilis TK31 ve Bacillus cereus TK16 suşları için kombine; Bacillus subtilis PTK56 suşu için ise kimyasal mutasyon uygulaması ile elde edilmiştir. Enzim üretim ortamlarının optimizasyonu ile psikrofil 31C-179 mutant enzimin aktivitesi (0,289 U/mL) yaban tip kontrolüne (0,077 U/mL) göre 3.75 kat; mezofil 76C-3 mutant enzimin aktivitesi (0,209 U/mL) yaban tip kontrolüne (0,114 U/mL) göre 1.83 kat ve termofil 56E-67 mutant enzimin aktivitesi (0,274 U/mL) yaban tip kontrolüne (0,201 U/mL) göre 1.34 kat artmıştır. İzole edilen enzimlerin farklı biyoteknolojik alanlarda uygulanabilme potansiyeline sahip olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Alkalin Proteaz, Psikrofil, Mezofil, Termofil, Rastgele Mutagenez, Suş Geliştirme