RNA
200 theses under this subject heading
Nörofibromatozis tip 1 tümör doku örneklerinde mitokondriyel miRNA verilerinin analizi ve değerlendirilmesi
Nörofibromatozis tip 1 (NF1, von Recklinghausen), toplumda 1/2500 insidansı ile ortaya çıkan bir otozomal dominant hastalık olup ciltte sütlü kahve lekeler (café au lait - CALM), çillenmeler, nörofibrom olarak isimlendirilen farklı boyutlarda iyi huylu tümörler ve malin periferik sinir kılıfı tümörleri (MPNST) gibi belirtiler verir. Bunun yanı sıra omurilikte, kafa sinirlerinde, beyinde tümörler gelişebilmekte ve omurga eğriliği gibi kemik şeklinde bozukluklar meydana gelebilmektedir. NF1 hastalarında saptanan mutasyonlar ile hastalığın fenotipi arasında bir ilişki mevcut değildir. Klinik çok değişkenlik gösterir. Hatta aynı aile içinde bile aynı mutasyonu gösteren bireylerin farklı klinik tablo gösterdiği de bilinen bir durumdur. Bu klinik değişkenliğin ortaya çıkmasındaki görüşlerden biri NF1 geni üzerindeki modifiye edici faktörlerin varlığıdır. Bu aday modifiye edici faktörlerden bir tanesi mikroRNA'lardır (miRNA). Ayrıca son yıllarda yapılan çalışmalar mitokondrilerin fonksiyonundaki değişikliklerin de bir modifiye edici faktör olarak NF1 hastalarının farklı fenotipler göstermesinde rol oynayabileceğini göstermektedir. Mitokondriler, kendine özgü sinyal yolaklarının varlığı ve hücrenin enerji üretim merkezi olmaları nedeniyle önemli organellerdir. Son yıllarda mitokondrilerle yapılan çalışmalar büyük oranda artmıştır. Mitokondrilerin, atasal bir anaerobik ökaryotik hücre tarafından hücre içine alınan bir bakteriden köken aldığı bilinmektedir, karşılaştırmalı analizler ile mitokondriyel fizyolojik süreçler ve bakterilerin olası katılımı gözden geçirilmektedir. Küçük kodlanmayan RNA'lardan olan miRNA'lar, gen ifadesinin post transkripsiyonel düzenleyicileri olarak fonksiyon gösteren RNA'lardır. Son zamanlarda, mitokondriyel miRNA'ların (mitomiR), mitokondriyel genomun translasyonel aktivitesini modüle ettiği ve mitokondriyel protein ifadesini ve fonksiyonunu düzenlediği gösterilmiştir. Mitokondrinin gelişim için gerekli olduğu doğrulanmış olsada, mitomiR'lerin enerji metabolizması, oksidatif stres, inflamasyon ve apoptoz dâhil önemli biyolojik süreçlerin düzenlenmesindeki rolleri daha yeni anlaşılmaya başlamıştır. Bu tez çalışmasında, NF1 hastalarından elde edilen kütanöz ve pleksiform nörofibrom tümör dokularındaki mitomiR'lerin ifadelerinin kontrol dokuya (CALM) göre değerlendirilmesi amaçlandı. Bunun için taze dondurulmuş 11 doku seçildi (Bir kontrol (CALM), beş kütanöz nörofibrom ve beş pleksiform nörofibrom tümör dokusu) ve bu dokularda seçilen 11 mitomiR'in ifadesi kantitatif gerçek zamanlı PZR (kRT-PZR) yöntemi ile değerlendirildi. Yapılan analiz sonucunda seçilen mitomiR'lerde anlamlı bir ifade artışı görülse de kütanöz ve pleksiform nörofibromlar arasında istatistiksel olarak bir fark görülmedi. Araştırılan mitomiR'lerin sayısının az olması nedeniyle daha geniş kapsamlı araştırmalar yapılması gerektiği öngörüldü.
Nonketotik hiperglisinemi hastalarında genotip-fenotip ilişkisinin değerlendirilmesinde etkin mikrorna'ların belirlenmesi
Nonketotik hiperglisinemi (NKH), glisin ensefalopatisi olarak bilinen otozomal resesif (OR) geçişli bir amino asit metabolizma bozukluğudur. Glisin parçalayıcı enzim kompleksindeki bozukluktan dolayı glisin vücutta birikir. Tanı beyin omurilik sıvısı (BOS) ve plazma glisin seviyelerindeki artış ile tespit edilir. NKH'de BOS/plazma glisin oranı genellikle 0,08-0.25 µmol/L'dir. BOS glisin seviyesindeki artış NKH'nin önemli bir göstergesidir ancak NKH için en güvenilir tanı yöntemi genetik analizdir. NKH'de ilk bulgular genellikle doğumda ya da ilk haftalarda meydana gelir. Glisin yüksekliği ketotik hiperglisinemi olarak adlandırılan propiyonik asidemi, metilmalonik asidemi ve beta ketothiolaz enzim eksikliğinde de görülebilmektedir. Bu hastalarda glisin yüksekliği ile ciddi asidoz ve ketozis bir aradadır. Bu duruma ketotik hiperglisinemi denilir. Ketozis, ketotik hiperglisinemide erken müdahale için uyarıcıdır. Literatürde NKH'nin ketotik hiperglisinemiden yaklaşık iki kat daha sık görüldüğü bildirilmiştir. BOS'da glisin artışı yapan bu durumlar BOS/plazma glisin oranında da yüksekliğe sebep olmaktadır. Bu durum NKH'de tanı için BOS/plazma glisin oranın yeterli bir kriter olmadığını göstermektedir ve NKH için daha spesifik bir tanı yönteminin varlığının önemini vurgulamaktadır. NKH'ye neden olan glisin parçalayıcı enzimdeki dört proteinden herhangi birindeki değişikliklerden kaynaklanan biyokimyasal patoloji iyi anlaşılmıştır ancak literatürde henüz genotip-fenotip ilişkisi bulunmamaktadır. MikroRNA'lar (miRNA) gen ifadesinin transkripsiyon ve transkripsiyon sonrası düzenleyicileri olarak fonksiyon gösteren, küçük kodlanmayan RNA'lardır. Düzenleyici rolleri nedeniyle hastalıklarda tanı ve tedavi bakımından yeni bakış açıları sağlayabilirler. Hastalıkla ilişkili miRNA'ları ve ilgili hedeflerini belirlemek, hastalığa yeni moleküler bakış açısı sağlayarak yeni terapötik stratejilerin tasarlanmasını sağlar. miRNA'lar vücut sıvılarında stabil formda bulunurlar, bu da onları rutin klinik işleme ve analize uygun hale getirir ve yeni hastalık biyobelirteçleri olarak kullanımlarının ve tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde kullanılır. NKH gibi metabolik blok sonucu toksik madde birikimi ile giden kalıtsal metabolik hastalıklarda erken tanı hayati önem taşımaktadır. Dolayısıyla kalıtsal metabolik hastalıklarda erken tanı için alternatif metotların geliştirilmesi önemlidir. miRNA'ların NKH gibi kalıtsal metabolik hastalıkların erken tanı için daha spesifik ve daha hızlı bir biyobelirteç olarak kullanılabileceğini düşünmekteyiz. Dolaşımdaki miRNA'ların biyobelirteç olarak kullanımları sayesinde; hızlı müdahale için bir hastalığın erken evrelerini tespit etmek, böylece hastalığı önlemek, iyileştirmek veya yavaşlatmak, benzer etiyolojilere sahip patolojileri ayırt etmek, prognozu tahmin etmek ve tedaviye yanıtın izlenmesinde faydalı olacağı düşünülmektedir. Literatürde pek çok kalıtsal metabolik hastalık miRNA çalışması yapılmış olmasına rağmen daha önce NKH miRNA ilişkisini inceleyen bir araştırma bulunmamaktadır. Bu çalışmasında NKH hastalığı ve miRNA'lar ile ilgili daha önce elde ettiğimiz bilgi birikimizi kullanarak NKH'daki miRNA'ların rolünü araştırmayı amaçlıyoruz. Çalışmada NKH hastaları ve sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubuna ait kan, idrar ve BOS sıvılarından izole edilen miRNA'lar karşılaştırılıp büyük ölçekli miRNA profillemesi gerçekleştirilecektir. Elde edilen miRNA'ların ifadesi analiz edilecek ve elde edilen sonuçlara göre kontrol ve hasta grubu arasında ifadesi önemli derecede farklılık gösteren miRNA'lar seçilerek qRT-PCR analizi ile doğrulanacaktır. Son olarak aday miRNA'nın NKH'de fenotipe olan etkisine bakılacaktır. Çalışmamız NKH miRNA ilişkisini inceleyen ilk çalışma olacaktır.
Kistik fibrozis hastalığında belirlenen aday miRNA'ların hasta nazal ve serum örneklerinde analizi
Kistik fibrozis transmembran regülatör (CFTR) genindeki mutasyonların sebep olduğu kistik fibrozis (KF), otozomal resesif kalıtılan ve yaygın görülen genetik bir hastalıktır. Bir klor kanalı olan CFTR proteini, cAMP ve protein kinaz A'ya bağımlı çalışmaktadır. Epitel yüzeyindeki sıvı homeostazisini sağlayan CFTR proteini, diğer klor kanallarının ve epitel sodyum kanallarının düzenlenmesinden sorumludur. Günümüze kadar yapılan çalışmalarda CFTR geninde 2100'den fazla mutasyon olduğu saptanmıştır. CFTR proteininin fonksiyonuna bağlı olarak sınıflandırılan mutasyonlar, CFTR proteininin sentezi, katlanması, taşınması, yerleşmesi ve doğru fonksiyon göstermesi gibi aşamalarına etki ederek hastalık ciddiyetinde önemli rol oynamaktadır. CFTR mutasyonlarının tanımlanması, hastalığın teşhis edilmesini sağlamakta ancak hastalık ciddiyeti, fenotipi ve ilerleyişi hakkında bilgi vermemektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar ile birlikte immün ve inflamatuar cevap, protein katlanması, iyon taşınımı ve oksidatif stres ile ilişkili genlerin ifadelerinin yanı sıra miRNA ifadelerinde gözlenen farklılıkların da hastalık patogenezini etkilediğine dair bulgular artmıştır. Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı ve Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Göğüs Hastalıkları Ünitesi iş birliği ile gerçekleştirilen ön çalışmalar sonucunda, aynı mutasyonu taşımasına rağmen ağır ve hafif klinik ciddiyete sahip kardeşler saptanmıştır. F508del mutasyonuna sahip ağır (n=2) ve hafif (n=2) seyir gösteren hasta kardeşlerden nazal sürüntü örnekleri alınmıştır. Nazal epitel hücreler kullanılarak elde edilen RNA'lar ile miRNA Array yöntemi gerçekleştirilmiş ve elde edilen ham veriler Transcriptome Analysis Console (TAC) programı ile analiz edilmiştir. Yapılan analiz sonrası ifadesi 2 kat ve üzeri artan ya da 2 kat üzeri azalan ortak, miR-449c-5p, miR-34c-3p, miR-34c-5p ve miR-4793-3p olmak üzere 4 miRNA tanımlanmıştır. Önerilen tez çalışmasında amacımız; grubumuzun ön veri olarak elde ettiği 4 miRNA'nın F508del mutasyonuna sahip ağır ve hafif seyirli KF hastalarının serum ve nazal sürüntü örneklerinde valide edilmesi, ekspresyonlarının karşılaştırılması, valide edilen miRNA'ların hedef genlerinin belirlenmesi ve hedef genler ile ilişkili yolakların tanımlanmasıdır. Elde edilen veriler KF'de hastalık seyrinin erken dönemde belirlenmesine kolaylık sağlayacak prognostik miRNA'ların belirlenebilmesini sağlayacak ve KF patogenezi ile ilişkili olan yeni yolaklar aydınlatılabilecektir.
MikroRNA-21 baskılanmış meme kanseri kök hücrelerinin insan kemik iliğinden izole edilen telositler ve telosit kaynaklı mitokondriler ile ko-kültürü
Bu tez çalışmasının amacı, meme tümöründe de tanımlanmış telositlerin ve telosit kaynaklı mitokondrilerin, meme kanseri kök hücrelerinin tümör gelişimine katkısının miR-21-5p'in üzerinden incelenmesidir. Bu tez çalışması kapsamında, ilk olarak insan kemik iliği mononükleer hücrelerinden CD34 ve CD117 pozitif telositlerin izolasyonu yapılarak akım sitometri, immün floresan boyama ve TEM analiz yöntemleri ile karakterizasyonu gerçekleştirildi ve telosit hücrelerinden mitokondriler izole edilerek immün floresan boyama ile karakterize edildi. Sonraki aşamada MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattından CD24- ve CD44+ kanser kök hücreleri izole edilerek akım sitometri ile karakterizasyonları yapıldı. Ardından kanser kök hücrelerinin miR-21-5p ifadeleri anti-miR-21-5p inhibitörünün transfeksiyonu ile baskılandı. Yapılan ko-kültür çalışmalarıyla kemik iliği kökenli telositlerin ve mitokondrilerin miR-21-5p baskılanmış kanser kök hücre idamesindeki rollerini incelenmek üzere vimentin ve ALDH1A1 protein seviyelerindeki değişimler Western Blot ile analiz edildi. SNAI1, LZTFL1, OCT3/4, ABCC11, CHD1 (E-Kaderin) ve CHD2 (N-Kaderin) gen ekspresyon değişimleri RT-qPCR yöntemi ile değerlendirildi. İzole edilen telositler CD44/CD117/α-SMA/CD31/CD45 ve CD34 yüzey belirteçlerini ifade ettiği, aynı zamanda vimentin ve PDGF-β'ya pozitif oldukları görüldü. Telositlerden izole edilen mitokondriler immünfloresan boyama ile takip edildi. Kanser kök hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu sonucunda miR-21-5p inhibisyonu gerçekleştirildi ve miR-21-5p gen ifadesinin inhibitör kontrole göre 132 kat azalmış olduğu RT-qPCR ile doğrulandı. Telositlerin ve mitokondrilerin miR-21-5p inhibe edilmiş kanser kök hücreleri ile ko-kültür sonrasında ise miR-21-5p, SNAI1, ABCC11, N-Kaderini, vimentin ve ALDH1A1 ifadelerinin düştüğü; E-Kaderin ve LZTFL gen ifadelerinin artığı saptandı. Bu tez ile ilk defa meme kanserinin ilerlemesinde telositlerin ve telosit kaynaklı mitokondrilerin miR-21-5p üzerinden EMT geçişini düşürebileceğini ve kanser metastazını azaltıcı bir etki gösterebilme potansiyeli bulunabileceğini gen/protein seviyesindeki analizlerle ortaya konmuştur.
Boruta ve elastik ağ algoritmalarının gen seçim performanslarının RNA dizileme veri setleri üzerinde karşılaştırılması: Bir monte carlo benzetim çalışması
Kanser Genom Atlası Programından elde edilen farklı kanser türlerine ait sekiz gerçek RNA dizileme veri seti kullanılarak ilgili kanser hastalığına önemli derecede etki eden genlerin seçilmesinde, Boruta Algoritması ve Elastik Ağ Genelleştirilmiş Doğrusal Modeller İçerisinde Determan'ın Algoritması uygulanmıştır. Boruta Algoritmasının kendi içerisinde bulunan, sınıflandırma yöntemlerine ve önemlilik ölçütlerine göre farklılaşan yöntemlerden yedi tanesine ait algoritmalar, ayrı ayrı olarak uygulanmış ve elde edilen sonuçlar sadece Elastik Ağ Algoritması ile değil aynı zamanda birbirleri ile de kıyaslanmıştır. Gerçek veri setlerine dayalı olarak bir Monte Carlo benzetim çalışması yapılmıştır. Özellik seçiminde kullanılan gen setleri; filtreleme, normalleştirme, dönüşüm ve tek değişkenli analiz olmak üzere dört aşamada ön işleme adımları uygulanarak elde edilmiştir. Özellik seçimi yöntemlerinin performansları Pozitif Kestirim Değeri, Duyarlılık, F1 Ölçüsü gibi ölçüler kullanılarak karşılaştırılmıştır. Çalışmada kullanılan veri setlerinin tümünde Elastik Ağ Algoritması, Pozitif Kestirim Değeri açısından öne çıkmıştır. Boruta Algoritmasının Ekstra Ağaçlar ve Random Ferns tabanlı yöntemleri, Duyarlılık Oranları açısından Elastik Ağ Algoritmasından daha iyi performans göstermiştir.
Nörometabolik hastalık nedeni olan mutasyonların drosophila melanogasterda modellenmesi ve sinaps fonksiyonu üzerine etkilerinin araştırılması
Sinaptopatiler nadir metabolik hastalıklar içerisinde önemli bir yer tutmasına rağmen, sinaptik disfonksiyona sebep olan mekanizmaların bilinmemesi teşhis ve tedaviyi zorlaştırmaktadır. Grubumuz tarafından son yıllarda sinaptopati ile ilişkilendirilebilecek UNC79 ve MBOAT7 gibi patojenik olduğu değerlendirilen yeni varyantlar saptanmıştır. UNC79 geni, NALCN ve UNC80 proteinleri ile birleşerek NALCN sızıntı kanalı olarak isimlendirilen bir kanalı oluşturmaktadır. Ekzom dizi analizi yaptığımız bir ailede UNC79 geninde patojenik olduğu değerlendirilen bir varyant saptanmıştır. UNC79 geninde varyasyon saptanan hastada gözlenen sinaptopatinin NALCN kanalının disfonksiyonuna bağlı olarak sinaptik iletimde meydana gelen disfonksiyon ile alakalı olabileceği düşünülmektedir. Fakat literatürde UNC79 geninin sinaps fonksiyonu üzerine etkilerini inceleyen veya UNC79 genini sinaptopati ile ilişkilendiren bir çalışma mevcut değildir. Yine aynı şekilde, NALCN kanalının diğer bileşenleri olan NALCN ve UNC80 genlerinde patojenik varyant saptanan hastalar literatürde mevcut olmasına ve benzer patofizyoloji göstermelerine rağmen bahsi geçen proteinlerin susturulması sonucu sinaptik proteinlerin miktarının değişip değişmediği ve sinaptik iletimin gerçekleştiği yerler olan aktif zonların sayısının nasıl değiştiği bilinmemektedir. MBOAT7 geni ise Lands lipid modelleme yolağında yer alan önemli enzimlerden biridir. Memelilerde fosfoinositidlerin sn-2 konumuna arakidonik asid takılmasından sorumlu oldugu bilinmektedir. Memeli beynindeki fosfolipidlerin sn-2 pozisyonunda çogunlukla arakidonik asit bulunduğu için, enzim beyinde daha önemli hale gelmektedir. Yukarıda verilen bilgiler ışığında UNC79 geni ve etkileşim içerisinde olduğu NALCN kanal bileşenlerinin (UNC80 ve NALCN) ve MBOAT7 geninin sinaps fonksiyonu ve sinaptik iletimde önemli rolleri olabileceği fikri güçlenmektedir. Fakat, proteinlerin yokluğunda sinaptik iletim, sinaps büyüklüğü ve şeklinin nasıl etkilendiği bilinmemektedir. Bu soruların cevaplanabilmesi için ilgili genler Drosophila melanogaster'de motor nöronlarında ve tüm beyinde doku bazlı susturulmuştur. Bahsi geçen genlerin moto-nöronal ve pan-nöronal olarak susturulması sonucunda Drosophila 3. instar larva nöromüsküler kavşağında bulunan brp ve glutamat reseptör miktarlarının kontrol grubuna göre arttığı/azaldığı yani sabit olmadığı gözlenmiştir. Sonucun sirkadiyen ritim ile ilişkili olup olmadığının anlaşılması için yabanıl tip sinek larvasının zamana baglı olarak disekte edilmesi sonucunda brp ve glutamat reseptörünün zamana baglı olarak osile ettiği ve bu osilasyon paterninin literatürde bahsi geçen sinek lokomotor aktivitesine benzediği gözlenmiştir. Son olarak NALCN Drosophila ortoloğu na motonöronal olarak susturulup zamana bağlı brp ve glutamat reseptör miktarı incelendiğinde proteinlerin zamana bağlı olarak osile ettiği, fakat osilasyonun kontrol grubuna göre kaydığı gözlenmiştir
Pankreas kanseri hücre hattında TFAM ekspresyon düzeyinin hücre fonksiyonları üzerine etkisi
Pankreas kanseri genellikle geç bir aşamada farkedilir çünkü çok ileri evrelere ulaşana dek semptomları görülmez. Kilo kaybı, karın bölgesinde ağrı, sarılık (karaciğerdeki toksik yapılanma nedeniyle cildin sarıya dönmesi) en yaygın görülen semptomlardır. Bunlar genellikle tümör belli bir büyüklüğe eriştikten sonra ortaya çıkar ve çoğu zaman bereberinde karaciğer metastazı vardır. Karsinomaların metastaz yapması için, epitelyal tümör hücreleri, birincil bölgede istila, ikincil bir yerde yayılma ve kolonizasyonu içeren karmaşık bir dizi olaydan geçer. Bu metastatik kaskadı, sadece tümör hücrelerinde çalışan sayısız sinyal yolu ile değil aynı zamanda stromal hücrelerle olan ilişkileri de modüle edilebilir. İstilacı yetenekler elde etmek için, epitelyal tümör hücreleri, hücre- hücre adezyonlarının kaybını kolaylaştıran ve hücre hareketliliğini, kök hücre benzeri özellikleri ve apoptoza karşı direnci arttıran bir işlem olan bir epitel-mezenkimal geçişine (EMT) maruz kalabilir. Bu özellikler, tümörün farklılaşmasını arttırdığı ve metastaza gidişi arttırdığı bilinmektedir. MikroRNA'ların hücre çoğalması, farklılaşması, kök hücrenin yenilenmesi ve apoptoz gibi birçok biyolojik süreçte düzenleyici işlevlerinin olduğu bilinmektedir. miRNA'lar, hedefledikleri mRNA'lara göre onkojenik veya tümör baskılayıcı özellik kazanabilirler. Kanserin gelişimini arttırdığı düşünülen miRNA'lar 'onkomir' olarak tanımlanmaktadır. Onkogen olarak işlev gösteren bu miRNA'lar hedefi olan tümör baskılayıcı genleri baskılayarak tümörün gelişmesine katkı sağlarlar. Genellikle kanserlerde kontrolsüz büyümeyi arttırıcı ya da antiapoptotik olarak fonksiyon gösterdikleri rapor edilmiştir. Görevleri bir onkogenin ekspresyonunu kontrol etmek olan miRNA'lar ise 'tümör baskılayıcı miRNA'lar' olarak tanımlanmaktadır. Tümör baskılayıcı miRNA'ların ekspresyonundaki azalışın onkogenlerin ekspresyonunu arttırdığı ve sonuçta tümör oluşumuna neden olduğu bilinmektedir. mir200 ailesinin düşük ekspresi, invazyon ve metastaz malign tümör ilerlemesinin göstergelerindendir. Taranan literatür bilgilerine göre mir200a; meme, over, prostat, kolorektal kanser, mide ve pankreas kanserlerinde tümör baskılayıcı olarak görev almıştır. Bu çalışmada, mir200a'nın tümör baskılayıcı özelliği üzerinde durularak araştırmalar yapılacaktır. Oksidatif fosforilasyondan sorumlu olan mitokondri, hücresel enerjinin üretim merkezidir. Warburg'un, kanserin oksidatif fosforilasyondaki veya mitokondrideki bozulmalardan kaynaklandığını öne sürmesiyle son yıllarda mitokondri ve kanser arasındaki ilişkiyi belirlemeye yönelik çok sayıda çalışma yapılmıştır. Elde edilen verilere göre kanser hücrelerinde mtDNA'da mutasyon birikimi çekirdek DNA'sına göre 10 kat daha fazladır. Bu mutasyonlar çoğu kez homoplazmiktir ve erken evre kanser hücrelerinde belirlenebilir. Bu bulgular mtDNA mutasyonlarının kanserin işaretçisi olarak kullanılabileceği fikrini doğurmuştur. Aynı zamanda bu işaretlerin erken evre kanserlerde belirlenebilmesi kanser tedavisine erken başlama olanağını sunması açısından da önemlidir. İnsan mitokondrilerindeki transkripsiyon, POLRMT adı verilen DNA'ya bağlı bir RNA polimerazı tarafından yönlendirilir. Transkripsiyonun başlatılması, POLRMT'nin TFAM (mitokondriyal transkripsiyon faktörü A) ve TFB2M (mitokondriyal transkripsiyon faktörü B2) ile ilişkisini gerektirir. TFAM, transkripsiyon aktivasyonuna ek olarak DNA'yı nükleoid içinde paketleyen bir DNA bağlayıcı proteindir. mir200a, TFAM'ı hedefleyerek downregüle etmektedir. Bu tezde, pankreas kanseri hücre hattında TFAM ekspresyon düzeyinin kanser hücre fonksiyonları üzerine etkisi, mir200a ile TFAM ilişkisi üzerinden araştırılacaktır.
Kolşisin direnci olan ailevi akdeniz ateşi hastalarında ifadesi değişen miRNA'ların inflamasyon ve ilaç direnci ile ilişkisinin belirlenmesi
Ailevi Akdeniz ateşi klinik heterojenitenin görüldüğü monogenik bir sistemik otoinflamatuvar hastalıktır. Ailevi Akdeniz ateşinde en yaygın tedavi yöntemi günlük kolşisin kullanımıdır. Fakat hastaların %2-5'lik kısmında kolşisin direnci görülmektedir. İlaç direncinin gelişiminde epigenetik mekanizmaların özellikle kodlamayan RNA'lardan mikroRNA'ların rol oynadığına dair çalışmalar mevcuttur. Bu sebeple kolşisin dirençli hastalarda ifadesi değişen mikroRNA'ların ilaç direnci ve inflamasyon ile muhtemel ilişkisinin değerlendirilmesi gerektiği düşünülmüştür. Grubumuz tarafından daha önce gerçekleştirilen miRNA 4.0 array ile mikroRNA ifade analizi yeniden değerlendirilmiş; kolşisin dirençli ve duyarlı hasta grupları arasında ifadesi en az 2 kat değişen 25 mikroRNA bulunmuştur. Bu mikroRNA'lardan ilaç direnci ile yüksek oranda ilişkili bulunanlar hasta grubunda kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile valide edilmiş, miR-183-5p ve miR-15b-5p'nin ifadesinin kolşisin dirençli hastalarda anlamlı şekilde azaldığı, miR-125a-5p'nin ifadesinin anlamlı olmayan bir azalış gösterdiği bulunmuştur. Biyoinformatik araçlar kullanılarak hem inflamasyon hem de ilaç direnci ile ilişkili genlerin listesi oluşturmuş, kolşisin dirençli hastalarda anlamlı azalış gösteren mikroRNA'ların ilaç direnci ve inflamasyonla ilişkili olası hedef genleri belirlenmiştir. Genlerin ifade analizi için yapılan kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu deneylerinde, kolşisin dirençli hastalarda azaldığı görülen mikroRNA'ların olası hedef genleri olarak seçilen NR3C1 ve NFKB1'in ifadesinin, aynı hasta grubunda arttığı gösterilmiştir. Grubumuzun önceki projeleri sırasında oluşturulmuş kolşisin dirençli hücre hattında da aynı mikroRNA'ların ve hedef genlerinin hasta grubuyla benzer değişim gösterdiği saptanmıştır. Bu çalışma sonucunda belirlenen ifadesi değişen mikroRNA'ların, ileride kolşisin direncinin erken tanısı için biyobelirteç olma potansiyeli taşıdığı düşünülmektedir. Anahtar kelimeler: AAA, kolşisin direnci, mikroRNA
Akciğer kanserine yönelik siRNA taşıyıcı polimerik nanopartiküllerin geliştirilmesi ve etkinliklerinin in vitro değerlendirilmesi
En yaygın kanser türü olarak bilinen akciğer kanseri aynı zamanda tüm kanser türleri arasında en yüksek ölüm oranına sahiptir. Tedavide kullanılan mevcut yöntemlerin düşük etkinliği ve ciddi yan ve toksik etkiler araştırmacıları istenmeyen sistemik etkileri azaltılmış, hedeflendirilmiş ve özgül etkisi arttırılmış tedavi yaklaşımları geliştirmeye yönlendirmektedir. Kirsten Rat Sarkom Viral Onkogen (Kras) proteininin akciğer kanserlerinde önemli bir role sahip olduğu ve akciğer adenokarsinom olgularının çoğunda bu yolağın etkinleştiği bilinmektedir. Bu tez kapsamında, alışılagelmiş yöntemlerle hedeflenemeyen mutant KRAS onkogenini hedeflemek üzere siRNA yüklü poli (laktik asit-ko-glikolik asit) (PLGA) nanopartiküllerin hazırlanması, tümör bölgesine seçici ve etkin olarak taşıma sağlamak üzere optimize edilmesi (aktif ve/veya pasif hedeflendirme ile) ve akciğer kanseri tedavisindeki etkinliğinin in vitro olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çift emülsiyon oluşturma-çözücü buharlaştırma yöntemi ile hazırlanan nanopartiküller katyonik özellik kazandırılmak üzere dioleil-3-trimetilamonyum propan (DOTAP) ve polietilenimin (PEI) ile, aktif hedeflendirme amacıyla da hiyalüronik asit ile modifiye edilmiştir. 190-245 nm aralığında partikül büyüklüğü, (-12) - (+14) mV aralığında zeta potansiyele sahip, polidispersite-indeksi 0,1 civarında siRNA yüklü nanopartiküller elde edilmiş, siRNA %80-100 enkapsülasyon etkinliği ile nanopartiküllere yüklenmiştir. In vitro çalışmalar ile nanopartiküllerin A549 kanser hücrelerinde ve sağlıklı BEAS-2B akciğer hücrelerinde 72 saatin sonunda hücre canlılığını etkilemediği, A549 hücrelerine özgül etkinlik göstererek hedef genin ekspresyonunda %50'ye kadar azalma, protein düzeyinde ise bazı formülasyonlar ile %90'ın üzerinde azalma sağlandığı gösterilmiştir. Ayrıca nanopartikül uygulaması sonrası hücrelerin metabolik profillerindeki değişiklikleri değerlendirmek için metabolomik analizler gerçekleştirilmiştir. Formüle edilen nanopartiküllerin akciğer kanserinde etkin bir tedavi yöntemi olabileceği değerlendirilmektedir.
E. coli hücrelerinden polimerik mikrokriyojeller ile RNA saflaştırılması
RNA saflaştırma, yaşam bilimlerini konu alan birçok çalışmada, özellikle viral, bakteriyel ve parazitik hastalıkların teşhisinde, kalıtsal bozuklukların diagnozunda, bir dizi hazırlayıcı ve analitik yöntemin kritik bir ilk aşamasını oluşturmaktadır. Bu bağlamda moleküler biyoloji teknikleri uygulamalarıyla hassas ve güvenilir sonuçlar elde etmek için saf ve bozulmamış halde saflaştırılmış RNA molekülleri gerekmektedir. Afinite kromatografisi, iyonik/hidrofobik etkileşimler, hidrojen bağı, disülfür köprüsü gibi moleküler etkileşimler kullanılarak bir karışımdaki belirli bir molekülün veya bir grup molekülün ayrılması, uzaklaştırılması ve saflaştırılması için kullanılan bir yöntemdir. Afinite kromatografisi; antikorlar, enzimler, hormonlar, DNA, reseptörler ve vitaminler dahil olmak üzere birçok biyomolekülün ayrılması ve saflaştırılması gibi biyokimyasal ve biyoteknolojik süreçlerde sıklıkla kullanılmaktadır. Boronat afinite kromatografisi, cis-diol içeren biyomoleküllerin izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılan yaygın bir saflaştırma yöntemidir. Son dönemlerde spesifik afinite etkileşimlerinden yararlanan kromatografik stratejileri giderek geliştirilmektedir. RNA'nın ayrılması için geliştirilen ii etkili tekniklerden yararlanarak boronat afinite kromatografisi, cis-diol grupları içeren çok çeşitli biyomoleküllerin biyoseçici ayrımı ve zenginleştirilmesi için umut verici bir yaklaşımdır. Geleneksel partikül bazlı adsorbanlar farklı ölçeklerde kolonlara eklenebilmeleri sebebiyle kromatografide sıklıkla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, genellikle nispeten küçük gözenek boyutlarına sahiptirler ve yavaş difüzyonlu kütle transferi, düşük akış hızları ve yüksek basınç düşüşü gibi bazı dezavantajlara neden olurlar. Bu nedenle, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı adsorbanlar geliştirilmiştir. En iyi bilinen alternatiflerden biri kriyojel bazlı adsorbanlardır. Kriyojeller, sıfır altı sıcaklıklarda jelleşme yoluyla üretilen makro gözenekli polimerik malzemelerdir. Ek olarak, kriyojeller, orijinal kalıbı ölçülerinde monolitik formda hazırlanır ve genellikle sadece kendi şekline uygun olan belirli bir kolonda kullanılır. Sunulan tez kapsamında, istenen ölçek ve şekilde sentezlenebilen mikron boyutlu kriyojeller, mikrokriyojeller olarak adlandırılmıştır, boronat afinite adsorbanı olarak imal edilmiştir. İki farklı türde sentezlenen PHEMA ve poli(HEMA-VPBA) mikrokriyojeller, SEM, FT-IR, μCT gibi çeşitli yöntemlerle karakterize edildikten sonra kesikli sistemde optimum adsorpsiyon koşullar belirlenmiştir. Yapılan tez çalışmasında, uygun karakterizasyona sahip olması nedeniyle Poli(HEMA-VPBA) mikrokriyojeller kullanılarak optimum koşullar pH 8.5 etilenamin tamponu 0.1 M CaCl2 tuz varlığı 37 oC olarak elde edilmiştir. Sulu çözeltiden RNA adsorpsiyonu deneyleri sonucunda 50. dakikadan sonra adsorpsiyon doygunluğuna ulaşıldığı, 0.5 mg/ml RNA derişiminde maksimum adsorpsiyon kapasitesinin 303 mg/g polimer olduğu bulgusuna erişilmiştir. Adsorpsiyon izotermi inceleme çalışmalarında Langmuir izotermine uygunluk gösterdiği ve ikinci dereceden izoterm kinetiği ile örtüştüğü belirlenmiştir. Mikrokriyojellerin tekrar kullanılabilirlik incelemeleri 8 kez yapılarak sonucunda 223.4 mg/g adsorpsiyon kapasitesi değerine ulaşılmıştır. Tezde, deney ve kontrol kolaylığı sağladığından dolayı biyokimyasal süreçlerde sıklıkla tercih edilen E. coli hücreleri kullanılmış ve E. coli hücrelerinden inkübasyon ve santrifüj işlemleri sonucunda RNA özütü elde edilmiştir. RNA özüt, desorpsiyon ajanı olarak 0.1 M borat tamponu 0.5 M CaCl2 vasıtasıyla yıkanmıştır. Yıkama sonucu agaroz jel elektoforez analizi sonucunda RNA'nın yüksek oranda başarılı şekilde saflaştırıldığı kanıtlanmıştır.
Kistik fibrozis patogenezinde aday miRNA ve hedef genlerinin biyoinformatik araçlarla tanımlanması
Kistik fibrozis transmembran regülatör (CFTR) genindeki mutasyonların sebep olduğu kistik fibrozis (KF) otozomal resesif kalıtılan oldukça yaygın görülen genetik bir hastalıktır. Hastalık ciddiyeti mutasyonların CFTR proteini üzerindeki etkisiyle ilişkilendirilse de aynı mutasyonu taşıyan hastalarda hastalık ciddiyetini epigenetik faktörlerin de etkilediği bilinmektedir. Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı ve Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Göğüs Hastalıkları Ünitesi iş birliği ile gerçekleştirdiğimiz ön çalışmalar sonucunda aynı mutasyonu taşımasına rağmen hastalık ciddiyeti farklı seyreden kardeşler saptanmıştır. Gerçekleştirdiğimiz ön çalışmalarda hasta kardeşlerden elde ettiğimiz nazal sürüntüler kullanılarak; hedeflenmiş transkriptomik Kistik Fibrozis PCR Array yöntemi ile ifade farklılığı gösteren genler ve yolaklar saptanmıştır. Bu tez çalışmasında amacımız, aynı CFTR mutasyonuna sahip olmalarına rağmen farklı klinik ciddiyete sahip hasta kardeşlerde ifade değişikliği gösteren, fenotipik farklılığı açıklamaya yönelik ortak miRNA'ların ve hedef genlerinin tanımlanmasıdır. Bu amaç ile Hacettepe Üniversitesi Kapsamlı Araştırma Projesinde (TSA 201816629) gerçekleştirilmiş olan miRNA array ham verisi farklı biyoinformatik araçlarla tanımlanmış, kardeşler arasında klinik heterojeniteye sebep olabilecek aday miRNA'lar ve hedefleriyle ilişkili yolaklar saptanmıştır. BRB-ArrayTool, TAC 4.0 ve MeV programları kullanılarak Affymetrix miRNA 4.0 Array mikrodizin sonuçlarının ham verileri analiz edilmiş ve aday miRNA'lar seçilmiştir. Analizler sonucunda ağır seyirli hastalarda hafif seyirli hastalara göre ve Sınıf IV hasta grubunda ağır seyirli hastada hafif seyirli hastalara göre ifadesi artan miR-145-5p saptanmıştır. miR-145-5p'nin hedef genlerine ait yolak analizleri sonucunda miRWalk ve miRNET programlarında ortak ErbB sinyal yolağı elde edilmiştir. Ön çalışmamızın çıktılarında yer alan aday genlerin miRNA hedefleri olma durumu da araştırılmıştır. KF patolojisi ile uyumlu ve p değeri en yüksek IL-17 sinyal yolağı miR-145-5p için tanımlanmıştır. Ayrıca hastalarda kontrol bireylere göre ifadesi artan miR-92a-3p tanımlanmıştır. miR-92a-3p'nin hedef genlerine ait yolak analizleri sonucunda miRWalk ve miRNET programlarında en çok hedef geni içeren endositoz yolağı elde edilmiştir. Bu çalışma ile KF hastalarının klinik seyrini ve KF'ye eşlik eden diğer hastalıkların erken dönemde saptanmasını kolaylaştıracak, prognostik bir miRNA imzası tanımlanabilecek ve hastalık patogenezi ile ilişkili yeni yolaklar aydınlatılabilecektir.
Kinoanın (chenopodium quinoa willd.) kafeterya diyetiyle beslenen ratlarda glikoz homeostazına etkisi
Geleneksel tahıllara kıyasla daha nitelikli bir besin ögesi kompozisyonu ve biyokimyasal içerik sunan psödo-tahılların, obezite ve ilişkili komorbiditelerde metabolik kontrolün sağlanmasında yararlı olabileceği vurgulanmaktadır. Bu çalışmada, kafeterya diyeti ile obezite, glikoz intoleransı, insülin direnci gibi metabolik bozuklukların tetiklendiği ratlarda kinoanın olası koruyucu rolünün aydınlatılması amaçlanmıştır. Üç haftalık 24 adet erkek Wistar rat, randomize olarak 15 hafta süresince; kontrol diyeti (KON) (n=6), kinoalı diyet (KİN) (n=6), kafeterya diyeti (KAF) (n=6) veya kinoalı kafeterya diyeti (KFK) (n=6) ile beslenmişlerdir. Besin tüketim miktarları ve vücut ağırlığı verileri günlük olarak kaydedilmiştir. Diyet müdahaleleri sonunda ratlara intraperitoneal glikoz tolerans testi (IPGTT) uygulanmıştır. Ratların plazma insülin, GLP-1 ve IGF-1 konsantrasyonları analiz edilmiştir. Gerçek zamanlı kantitatif PZR ile insülin sinyalizasyonu yolağında görevli hepatik IRS1, IRS2, INSR, AKT2 ve AMPK genlerinin rölatif mRNA ekspresyon düzeyleri belirlenmiştir. Toplam yem tüketim miktarı (g/gün), post hoc analizler sonrasında diyet grupları arasında KİN>KON>KAF>KFK şeklinde (sırasıyla 27,18±0,37 g/gün, 25,14±0,60 g/gün, 22,81±0,41 g/gün, 20,93±0,54 g/gün; p<0,0001) sıralanırken; günlük ortalama enerji alım miktarı (kkal/gün) KİN>KON=KAF>KFK (sırasıyla 106,8±1,18 kkal/gün, 99,57±1,37 kkal/gün, 96,31±1,28 kkal/gün, 88,20±1,17 kkal/gün; p<0,01) olarak belirlenmiştir. Son vücut ağırlığı ve haftalık ağırlık kazanımı ortalaması en yüksek olan grubun KAF grubu olduğu; KİN grubunun ise en düşük değerlere sahip olduğu belirlenmiştir (sırasıyla 416,17±18,61 g vs. 339,67±8,73 g, p<0,05; 18,24±1,03 g vs. 13,92±1,07 g, p<0,05). KON, KİN ve KFK grupları arasındaki ikili karşılaştırmalarda, ilgili değişkenlerin anlamlı derecede farklılık göstermediği bulunmuştur. IPGTT sürecinde glisemik yanıta ilişkin toplam AUC değeri, post hoc analizler sonrasında gruplar arasında glikoz toleransı en zayıf olandan en güçlü olana doğru KAF>KON>KFK>KİN şeklinde sıralanmıştır (p<0,0001). IPGTT'de elde edilen insülinemik yanıta ilişkin toplam AUC değeri ise post hoc analizler sonrasında KON>KFK=KAF>KİN şeklinde ifade edilmiştir (p<0,0001). Plazma GLP-1 konsantrasyonu, gruplar arasında benzerken (p>0,05); plazma IGF-1 düzeyi anlamlı derecede farklıdır (p<0,01). IRS1 geninin rölatif gen ekspresyon düzeyinin diyet grupları arasında anlamlı derecede farklı olduğu belirlenmiş; post hoc analizler sonrasında ilgili parametre KİN>KFK=KON>KAF düzeninde (sırasıyla 2,433±0,189, 1,342±0,083, 1,268±0,120, 0,664±0,070; p<0,0001) sıralanmıştır. AMPK geninin rölatif gen ekspresyon düzeyinin diyet grupları arasında anlamlı derecede farklı olduğu (KON:0,955±0,072, KİN:1,570±0,062, KAF:0,638±0,073, KFK: 0,880±0,095; p<0,0001) belirlenmiştir. IRS2, AKT2 ve INSR genlerinin rölatif gen ekspresyonu düzeyleri, diyet grupları arasında benzerdir (her biri için p>0,05). Günümüzde önemli bir fonksiyonel besin olarak nitelendirilen kinoanın, yeterli ve dengeli bir diyet örüntüsüne dahil edilmesiyle, obezojenik diyetle tetiklenen metabolik bozuklukları önleme potansiyeline sahip olabileceği düşünülmektedir.
Transkriptom veri seti üzerinde derin öğrenme yöntemi ile klasik veri madenciliği yöntemlerinin sınıflama performanslarının karşılaştırılması
Bu tez çalışmasında akciğer kanseri ve böbrek kanserine ait RNA dizileme verileri kullanılarak, kanser alt türlerinin sınıflandırılmasında klasik veri madenciliği yöntemleri ve Derin Öğrenme yöntemi kullanılmış, sınıflama performansları karşılaştırılmıştır. Çalışmada kullanılan klasik veri madenciliği yöntemleri Yapay Sinir Ağları, Rastgele Orman ve Destek Vektör Makineleri'dir. Akciğer kanseri veri seti iki sınıflı ve sınıf dağılımları dengeli bir veri seti iken böbrek kanseri veri setinde üç sınıf vardır, sınıflardaki gözlem sayıları dengesizdir. Sınıflamada kullanılan gen setleri, farklı filtreler uygulanarak elde edilmiştir. Böylece, farklı özellikte veri setlerinde ve farklı filtrelerde sınıflama yöntemlerinin performansları incelenmiştir. Her sınıflama yöntemi için, parametrelerin alabileceği değer aralıkları belirlenmiş ve eğitim setleri üzerinde denenerek en uygun parametreler seçilmiştir. Çalışmada kullanılan veri setlerinde, klasik veri madenciliği yöntemlerine göre daha derin bir yapıya sahip olan Derin Öğrenme yöntemi başarılı bir performans göstermiştir. Anahtar Kelimeler: RNA dizileme, kanser, veri madenciliği, sınıflama yöntemleri, Derin Öğrenme
LNCRNA'ların pankreas kanserinin tanı ve prognozundaki önemi
Pankreas kanseri malignitelere bağlı ölümler arasında dördüncü sırada yer alan bir kanser türüdür. Pankreas kanserli hastaların serumlarında belirli antijenler tanımlanmıştır. Bu antijenlerden en önemlisi müsinle ilişkili karbonhidrat antijeni CA 19-9'dur. Son yıllarda yeni belirteçlerin saptanması amacıyla moleküler çalışmalarda siRNA, miRNA ve lncRNA (uzun kodlanmayan RNA) gibi küçük kodlanmayan RNA'lar kullanılmaya başlanmıştır. Bu kodlanmayan RNA'lardan lncRNA'lar, insan genomunun intergenik ve intronik bölgelerinden transkribe edilen ve karsinogenez sürecinde etkili oldukları bilinen grubu oluşturmaktadırlar. Bu çalışmanın birincil amacı pankreas kanserinde belirli lncRNA'ların rollerinin araştırılmasıdır. İkincil amacı pankreas kanserli hastaların demografik, laboratuar ve klinik özelliklerinin gözden geçirilerek lncRNA' larla olan ilişkilerinin belirlenmesi ve yeni bir dolaşım belirteci olarak kullanılıp kullanılamayacaklarının irdelenmesidir. Çalışmamızda kontrol grubu olarak normal pankreas (HPDE) hücre serisi ve hasta grubu olarak da pankreas duktal adeno kanser (PANC-1) hücre serisi kültür şartları ortamında çoğaltılarak WST-1 testi ile hücre proliferasyon ve sitotoksisite analizleri yapılmıştır. Bu hücre serilerine ilaveten pankreas kanseri tanısı konulan 18 yaş ve üzeri 40 olgudan alınan plazma örnekleri hasta grubu olarak, 10 sağlıklı bireyden alınan plazma örnekleri ise kontrol grubu olarak değerlendirilmiştir. Olgular çalışmaya dahil edilmeden önce çalışma hakkında bilgilendirilerek "Bilgilendirilmiş onam formu" imzalatılmıştır. Literatür incelemesi yapılarak onkogenezle ilişkili olabilecek lncRNA' lar belirlenmiştir. Kültür hücrelerinden ve hasta ve sağlıklı olgulardan toplanan plazma örneklerinden standart yöntem ve literatüre uygun kitlerle elde edilen kalıp cDNA'lar kullanılarak literatür bilgilerine dayanarak seçilen belirli lncRNA'ların ekspresyon seviyeleri "All-in-OneTM qPCR Mix" (Genecopoeia) ile qPCR Array analizleri ile belirlenmiştir. Çalışmada hedef lncRNA'lara (ANRIL, H19, HOTAIR, MALAT1, PCA3, PTCSC3) ve housekeeeping genlerine (ACTB, B2M, GAPDH) özgül olarak dizayn edilen primer / problar kullanılmıştır. Çalışmamızda öncelikle pankreas kanserli hasta kanlarından ayrıştırılan plazma örneklerinden qPCR yöntemi ile ölçülen lncRNA'ların ekspresyon değerleri, kültür ortamında çoğaltılan hücre serisi örneklerinin ekspresyon değerleri ile kıyaslanarak elde edilen bulgulara göre bunların bir tanı testi ve prognoz göstergesi olup olamayacağı irdelenmiştir. Pankreas kanser hücre hattında yapılan analizlerde sağlıklı hücre hattına göre kıyaslandığında ANRIL, H19, HOTAIR, MALAT1, PCA3 ve PTCSC3 ekspresyon seviyelerinin sırasıyla 0.58 kat, 4.60 kat, 4.19 kat, 0.66 kat, 1.25 kat ve 0.38 kat arttığı saptanmıştır. Aynı lncRNA ların hasta plazma örneklerinde sağlıklı kontrollere göre değişimi incelendiğinde sırasıyla 5.85 kat, 3.91 kat, 4.22 kat, 1.70 kat, 1.81 kat ve 3,93 kat azaldığı görülmüştür. Pankreas kanser tanılı hastaların plazma lncRNA değişimlerinin alkol ve sigara kullanımı, diyabet varlığı gibi faktörlerden etkilendiği bulunmuştur. Ayrıca hastalık evresi arttıkça plazma lncRNA değişimleri artmaktadır. Sonuç olarak in vitro analizlerde PANC1 hücre hattında H19 ve HOTAIR lncRNA ekspresyonu artmaktadır. Ancak pankreas kanseri tanısı alan hastaların plazma örneklerinde ANRIL, H19, HOTAIR ve PTCSC3 lncRNA seviyeleri azalmaktadır. Bu değişim ileri evre hastalıkta, sigara, alkol kullanımında ve diyabet varlığında daha belirgin olduğu için pankreas kanserinin erken tanısında şu an için birer tanı yöntemi olarak kullanılması mümkün gözükmemektedir.
Kolorektal kanser hücrelerinde BIBR1532 ve resveratrol kombinasyonunun LncRNA ekspresyon değişimi üzerindeki etkisi
Kolorektal kanser en sık rastlanan üçüncü kanser tipi ve dördüncü ölüm nedeni olarak bilinmektedir ve hedefe yönelik yeni tedavi yöntemleri araştırılmaya devam etmektedir. Kanser hücrelerinde; belirli uzun kodlanmayan RNA'lar olarak bilinen lncRNA'ların ekspresyonunun yüksek olduğu; karsinomların gelişmesi ve progresyonundan sorumlu olduğu bilinmektedir. Dolayısıyla, lncRNA'ların kanser tedavisinde hedef olarak ele alınabileceği düşünülmektedir. BIBR1532 bir telomeraz inhibitörüdür ve tümörlerdeki aktif telomerazı inhibe etme amaçlı kanser araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Resveratrol ise doğal bir fitoaleksindir, proliferasyon ve apoptozda rol oynayan molekülleri hedeflediği bilinmektedir. Ayrıca spesifik olarak KRAS-aracılı sinyalleşmeyi inhibe ederek apoptozu indüklediği tespit edilmiştir. Çalışmamızda, HT-29 kolorektal kanser hücrelerine BIBR1532 ve resveratol maddeleri uygulanmasının ardından; maddelerin sitotoksisitesi,olası apoptotik etkileri ve lncRNA ekspresyonlarındaki değişimi incelemek hedeflenmektedir. Proliferasyon deneyi ile her kuyucuk için uygun HT-29 hücre miktarı belirlenmiştir. WST-1 analizi ile BIBR1532 ve resveratrol maddelerinin sitotoksik etkisi doza ve zamana bağlı olarak değerlendirilmiştir. Ardından, belirlenen IC50 dozlarında tekli ve kombine olarak ilaç uygulanmış ve ilaç uygulanmayan hücreler kontrol olarak ele alınarak apoptoz analizi Annexin V ile gerçekleştirilmiştir. LncRNA analizi için, apoptoz deneyinde uygulandığı şekilde dozlar hücrelere uygulanmış, ilaç eklenmeyen hücreler kontrol olarak ele alınmıştır. Tüm hücre gruplarından RNA izolasyonu gerçekleştirilerek cDNA sentezlenmiş ve lncRNA ekspresyonundaki değişiklikler RT-PCR ile değerlendirilmiştir. HT-29 hücreleri için uygun hücre konsantrasyonu 2 x 104 hücre / ml olarak belirlenmiş, ardından sitotoksisite testleri yapılmıştır. BIBR1532 ve resveratrol için IC50 dozları sırasıyla 50.81 μM (48. saat) ve 86.23 μM (72 saat) olarak belirlenmiştir. İki madde için CI 1.7 olarak belirlenmiştir. BIBR1532 ve resveratrol ajanlarının her ikisi de hücrelerin canlılık oranını düşürürken, apoptozu indükleyici bir etkileri tespit edilmemiştir. BIBR1532 ve resveratrol kombinasyonunun kolorektal kanser hücrelerinde uygulanmasına dair literatürde herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Çalışmamızda bu maddelerin uygulamasının kanser ilişkili lncRNA ekspresyonlarında yarattığı değişiklikler ekpsresyon analizleri ile araştırılmasının, daha önce incelenmemiş olan lncRNA'ların CRC ile ilişkilendirilerek tedavi stratejilerinin oluşturulmasında yeni bir bakış açısı kazandıracağını düşünmekteyiz.
Tirozin kinaz ınhibitörlerine duyarlı ve dirençli kronik myeloid lösemi hastalarında, uzun kodlamayan RNA ekspresyonlarının moleküler düzeyde araştırılması
Uzun kodlamayan RNA' lar (lncRNA), ortalama 200-100 kbp uzunluğunda, hücrelerde gen ifadesinin epigenetik düzeyde kontrolünden sorumlu olan RNA molekülleridir. LncRNA' ların ekspresyon düzensizliği çeşitli insan kanser tipleri ile ilişkilidir. Ancak, Kronik myeloid lösemi' de (KML) ve özellikle tirozin kinaz inhibitörlerine karşı oluşan dirençte lncRNA' ların fonksiyonları tam olarak bilinmemektedir. Uzun kodlamayan RNA NEAT1 çeşitli kanser türlerinde önemli role sahip olup, iki kısa izoforma sahiptir: kısa form NEAT1_1 ve uzun form NEAT1_2. NEAT1 aynı zamanda nukleusta sub bodies olan 'paraspeckles' ve microspeckles oluşumundan da sorumludur. Bu çalışmanın amacı KML'de ve tirozin kinaz inhibitörlerine karşı gelişen direnç mekanizmasında etki gösteren lncRNA ekspresyon profillerinin belirlenmesi ve belirlenen lncRNA'ların TKİ direnç mekanizmasında ve KML progresyonundaki rollerinin saptanmasıdır. Dolayısıyla KML'de gen ifadesini direkt veya dolaylı şekilde etkileyen lncRNA' ların profillenmesi, sağlıklı olgulardan ve tirozin kinaz inhibitörlerine duyarlı/dirençli kronik myeloid lösemi hastalarından elde edilen kan örneklerinden RNAeasy Mini kit (Qiagen) ile total RNA izolasyonu, 'Thermocycler' cihazında qRT-PCR (kantitatif revers transkriptaz-gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) yöntemi ile cDNA (komplemanter DNA) sentezi ve 'ABI 7500 Fast' cihazında qRT-PCR (gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu) array ile yapılmıştır. Farklı ekspresyon seviyeleri gösteren lncRNA'lar potansiyel terapötik hedefler olabileceğinden, lncRNA' ları hedefleyen tedavi stratejisinin tirozin kinaz inhibitörlerine karşı direnç gösteren KML hastalarının tedavisi için de, umut verici nitelikte olacağını düşünmekteyiz. Anahtar Kelimeler: KML, LncRNA , Tirozin kinaz inhibitörlerine direnç
Aktif tüberküloz hastalarında depresyonla ilişkilendirilmiş miRNA'ların ekspresyonlarının araştırılması
Tüberküloz (TB) kronik, bulaşıcı ve ölümcül bir hastalıktır. Mevcut tahminler dünya nüfusunun 1/4'ünün Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ile enfekte olduğunu göstermektedir. Hem fiziksel hem de zihinsel olarak zayıflatıcı bir hastalık olan Depresyon (DP) eş zamanlı olarak TB'ye yüksek oranlarda eşlik etmektedir ve aralarında sinerjik bir etkileşim görülmektedir. Küçük kodlayıcı olmayan bir RNA türü olan mikroRNA'lar (miRNA) ise işlevlerini yerine getirmek için hedef mRNA'larının ifadesini kontrol etmektedir. Bu çalışmada, TB ve DP arasındaki sinerjik etkiyi değerlendirmek amacıyla DP ile ilişkilendirilmiş miR-128-3p, miR-34a-5p, miR-223-3p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-107, miR-134-5p, miR-135a ve miR-1202'nin aktif TB hastalarında ekspresyon düzeyleri araştırılmıştır. TB Hasta grubuna, aktif TB tanısı almış ve tedavisi başlamamış bireyler (n=35), Kontrol grubuna ise sağlıklı bireyler (n=35) dahil edilmiştir. miRNA'ların ekspresyon düzeyleri Real-Time PCR yöntemi ile tespit edilmiştir. TB Hasta grubu, Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında miR-128-3p, miR-34a-5p, miR-223-3p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-107, miR-134-5p ve miR-135a ekspresyon düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı artış olduğu belirlenmiştir. miR-1202 düzeyleri değerlendirildiğinde ise gruplar arasında farklılık gözlenmemiştir. DP hastalarında artış gözlenen miR 34a-5p, miR-128-3p, miR-223-3p, miR-221-3p ve miR-24-3p'nin, bu çalışmadaki TB hastalarında da anlamlı artışı saptanmıştır. Bu sonuç TB ve DP'nin patogenezinde bu miRNA'ların ortak olarak yer aldığını ve bu iki hastalık arasındaki sinerjide etkili olabileceğini destekler niteliktedir. TB hastalarında miR-135a, miR-107, miR-24-3p ve miR-134-5p ekspresyon düzeylerinde anlamlı artış gözlenmiştir. DP'de düşük ekspresyona sahip miR-134-5p, miR-135a ve miR-107'nin ise TB'de anlamlı artış gösterdiği saptanmıştır. Sonuç olarak TB hastalarında artış gösteren miR-135a, miR-107, miR-24-3p ve miR-134-5p yeni biyobelirteç olarak değerlendirilebilir. Ayrıca TB ve DP hastalarında artış gösteren miR-34a-5p, miR-128-3p, miR-223-3p, miR-221-3p ve miR-24-3p'nin her iki hastalığın ortak yolizlerindeki mediyatörler ile ileri çalışmalarının yapılması TB ve DP arasındaki sinerjinin tanımlanmasına katkı sağlayacaktır.
Over kanserinin sisplatine direncinde uzun kodlanmayan RNA H19'un rolü
Epitelyal over kanserinin mortalitesi jinekolojik kanserlerde en yüksek sırada yer almaktadır. Epitelyal over kanserli hastaların çoğunda yüksek dereceli seröz kanser tipi gözlenir ve hastaların %75'i ileri 3.evredir. İleri evre over kanserlerinde cerrahiye ek olarak kemoterapi uygulamak standart bir yaklaşım haline gelmiştir. Platin bazlı kemoterapi (paklitaksel veya dosetaksel ile kombinasyon halinde) birinci seçenek kemoterapi arasında yer almaktadır. Platin'in (sisplatin veya karboplatin) klinik yararlılığının ana sınırlaması, yüksek kemorezistans insidansıdır. Bu kemoterapiye direncin nedenini belirlemek için kanser hücreleri ile ilgili çalışmaların yapılması gereklidir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kemoterapiye karşı direnç ve uzun kodlanmayan RNA'lar arasında bazı ilişkiler saptanmıştır. İnsan genomununda protein kodlama kapasitesine sahip olmayan transkriptler kodlanmayan RNA (ncRNA) olarak adlandırılmaktadır. Bu ncRNA'lar uzunluklarına göre küçük kodlanmayan RNA'lar (sncRNA) ve uzun kodlanmayan RNA'lar (lncRNA) olarak iki ana kategoriye ayrılır. LncRNA'lar birçok kanser türünde önemli rol oynar. LncRNA'lar tümör hücresinin hayatta kalması ve ölümünde önemli bir rol oynadığından, lncRNA'ların hücre büyümesini inhibe ederek ve hücre apoptozunu teşvik ederek tümör hücrelerini yok etmeyi amaçlayan kemoterapiye hücre duyarlılığını da değiştirebileceği düşünülebilir. Son yıllardaki çalışmalar, lncRNA H19'un çeşitli insan kanserlerinde tümörün başlaması, ilerlemesi ve nüksetmesinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir. Bu çalışmada lncRNA H19'un ekspresyonu ile over kanserinin sisplatine direnci arasındaki ilişkinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmaya over kanseri tanısı konulduktan sonra sisplatin ile tedavi edilmiş hastalar dahil edilmiştir. Hastalara ait formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü over doku örnekleri kullanılmıştır. Arşiv doku örnekleri iki gruba ayırılmıştır: 1.grup sisplatine duyarlı hastalar, 2.grup ise sisplatine dirençli hastalardır. Tüm dokulardan RNA izolasyon kiti ile RNA izolasyonu yapılmış, daha sonra cDNA sentez kiti ile cDNA elde edilmiştir. Elde edilen cDNA'lar kalıp olarak kullanılıp lncRNA H19 geninin ekspresyonu Real Time PCR kullanılarak kantitiatif olarak ölçülmüştür. Çalışmamızda Dirençli ve Duyarlı gruplar karşılaştırıldığında Dirençli grupta lncRNA H19'un ekspresyon düzeyinin istatistiksel olarak anlamlı olarak arttığı gözlenmiştir.
Identification of C17orf45 protein and the effects of its snorNAs on cell cycle
The Wnt / ß-catenin signaling has many important roles in cellular responses and dysregulation of this pathway are linked to tumor formation. Priorly, SAGE and microarray analyses were performed in our laboratory in order to detect differentially expressed genes in Wnt / ß-catenin pathway and c17orf45 gene was found to be upregulated in the presence of constitutively active ß-catenin. It was characterized as a novel Wnt / ß-catenin target. A bioinformatics tool designed by our former lab member was used to detect differentially expressed genes in different tumor samples from online data. This indicated that the expression level of c17orf45 gene was altered in distinct tumors. Besides, the upregulation of c17orf45 was experimentally observed in meningi-oma samples. Moreover, c17orf45 gene is accepted as the host gene for 3 snoRNAs in its introns. SnoRNAs are mainly involved in post-transcriptional modification of ribo-somal RNAs; however the roles of snoRNAs in cancer are currently identified. In this study, the putative protein product of c17orf45 gene and the effects of 2 snoRNAs residing in introns of c17orf45 on different cancer cells were analyzed. Bioinformatics and PAML analyses for c17orf45 ORF revealed that there might be a positive selection for putative protein of the gene. Western Blot analysis done to identify the putative protein resulted in that the antibody did not target the protein of c17orf45. Besides, to examine the possible effects of snoRNAs, snoRNAs were cloned into intronic region of HBB gene encompassed by exonic parts in order to splice intron out. This would lead to obtain functional, processed snoRNAs. Splicing were verified with RT-PCR, Real Time PCR and YFP fused HBB construct which depended on joining of exons and splicing out of intron. Then, snoRNA constructs were introduced to different cancer cell lines to determine the effects of snoRNAs on cell cycle. However, none of the cells with 2 dif-ferent time points indicated an alteration on cell cycle.
Endometrial kanserde PI3K/AKT/mTOR sinyal yolağını etkileyen miRNA'ların araştırılması
Endometrial kanser dünya genelinde kadınlar arasında oldukça yaygınlık gösteren bir kanser tipidir. PI3K/AKT/mTOR sinyal yolağının düzensizliği birçok kanser tipinin patogenezinde rol oynamaktadır. Bu çalışmada PI3K/AKT/mTOR yolağını etkileyen miR-7-5p, miR-17-5p, miR-21-5p, miR-145-5p, miR-155-5p, miR-206, miR-221-3p ve miR-222-3p' nin endometrial kanserde in siliko analizleri ve ekpresyon düzeyleri araştırılmıştır. Bu çalışmaya endometrioid adenokarsinom tanısı almış Grade 1 (n=16), Grade 2 (n=16) ve Grade 3 (n=16) arşiv dokuları ile endometrial kanser tanısı almamış Kontrol 1 (n=16) sekretuar faz ve Kontrol 2 (n=16) proliferatif faz sağlıklı endometrium arşiv dokuları dahil edilmiştir. İn siliko analizlerle miRNA'lar ile hedef genleri arasındaki moleküler etkileşimler incelendi. İn siliko analizlerle miR-7-5p'nin hedefleri PIK3CD, PIK3R3, PIK3CB ve AKT3, miR-17-5p'nin hedefleri PIK3R1 ve AKT3, miR-21-5p'nin hedefi PIK3R1, miR-125b-5p'nin hedefi PIK3C2B, miR-145-5p'nin hedefi AKT3, miR-155-5p'nin hedefleri PIK3CA ve PIK3R1, miR-206'nın hedefi PIK3C2A, miR-221-3p ve miR-222-3p'nin hedefi PIK3R1 ve miR-223-3p'nin hedefi PIK3C2A olarak belirlendi. miRNA ekspresyon analizleri RT-PCR yöntemi kullanılarak yapıldı. miR-7-5p ve miR-206'nın ekspresyonları Kontrol 1 ve Kontrol 2'ye göre Grade 1, Grade 2 ve Grade 3 'de (p<0,05). miR-145-5p ekspresyonu Grade-1'de Kontrol-1 ve Kontrol-2'ye göre Grade-2 ve Grade-3'te Kontrol-2'ye (p<0,05) göre azaldığı gözlendi. miR-17-5p ve miR-222-3p'nin ekspresyonlarının Kontrol-1 ve Kontrol-2'ye göre Grade 1, Grade 2 ve Grade 3 'de arttığı saptandı (p<0,05). miR-221-3p ekspresyonun Grade-1 ve Grade-3'te Kontrol-1 ve Kontrol-2'ye göre, Grade-2'de ise Kontrol-1'e göre arttığı tespit edildi (p<0,05). miR-21-5p ve miR-155-5p ekspresyon düzeylerinde gruplar arasında istatiksel olarak anlamlı farklılık gözlenmedi. Sonuç olarak; Endometrial Kanserde PI3K/AKT/mTOR sinyal yolağında etkinliği tespit edilen miRNA'lar moleküler hedefe yönelik tedavi ve tanı stratejilerinin geliştirilmesine katkı sağlayacaktır.
Maternal depresyonun sıçan yavrularında hipotalamik nöroinflamasyon gelişimine etkisi
Gebelik sırasında ve doğumdan sonra gelişen maternal depresyon önemli bir halk sağlığı problemi olarak tanımlanmaktadır. Maternal depresyon hem annenin hem de yavrunun sağlığı ve yaşam kalitesini olumsuz yönde etkilemektedir. Gebelik sürecinde gelişen depresyon ve tedavisinin epigenetik olarak yavruyu etkilediği bilinmektedir. Majör Depresif Bozukluğun etiyolojisi son derece karışıktır ve tam olarak aydınlatılamamıştır. Nöroinflamasyon, depresyon etiyolojisinde yaygın olarak kabul edilen bir hipotez olarak değerlendirilmektedir. Bu tez projesinde deneysel maternal depresyon modeli oluşturulan sıçanların birinci kuşak yavrularda nöroinflamasyonla ilişkili kinürenin yolağı metabolitlerinin hipotalamik gen ifadesi üzerine etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gebe sıçanlara kronik hafif stres modeli (KHS) ve antidepresan tedavisi kapsamında kontrol (K), sertralin (S), depresyon (D) ve depresyon+sertralin (D+S) grupları oluşturularak postnatal 1., 30. ve 150. günlerde yavrularının hipotalamus dokuları alınmıştır. Hipotalamus dokularında total RNA izolasyosyon sonrası, cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Kinürenin yolağı, pro- ve antiinflamatuar sitokin genlerinin (IDO1, HAAO, AADAT, KMO, IL1β, IL6, TNFα, TGFβ ve IL10) mRNA düzeyinde ifadeleri kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPZR) analizi ile belirlenmiştir. Yenidoğan (1. gün) sıçanlarda depresyon grubunda artmış olan HAAO ifadesi D+S grubunda anlamlı oranda baskılanmıştır. Sertralin uygulamasının IL6 ifadesini K ve D+S gruplarına göre artırdığı gözlenmiştir. Diğer genlerde ekspresyon düzeyleri değişmemiştir. Ergen (30. gün) sıçanlarda KMO ve TNFα genlerinin depresyonda ifadeleri artmıştır. Antiinflamatuar TGFβ geninin ifadesi depresyonda azalmıştır. Sertralin uygulaması ile TGFβ ve IL10 ekspresyon seviyesinde artış gözlenmiştir. Erişkin (150. gün) sıçanlarda depresyon grubunda artmış olan KMO, HAO ve IL6 ifadesi sertralin uygulaması ile baskılanmıştır. Bulgular, maternal depresyonun kinürenin ve sitokin genlerinin ekspreyonunu değiştirdiğini göstermiştir. Sonuçlar gebelikte yaşanan depresyonun inflamatuar mekanizmalar ile yeni nesil yavruları etkilediğini göstermiştir. Bu sonuçlar yavruların ileride yaşayabileceği psikopatolojik durumla ilişkisini desteklemektedir.
Anti-HCV bakılan olgularda HCV-RNA sonuçlarının değerlendirilmesi
Amaç: Bu çalışmada anti-HCV pozitif olan hastalarda HCV-RNA istenme oranı ve pozitifliğinin belirlenmesi, anti-HCV pozitifliği saptandıktan sonra HCV-RNA bakılmayan hastaların güncel HCV-RNA düzeylerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Bu prospektif kohort çalışmasına, 1 Ocak 2011–31 Aralık 2020 tarihleri arasında Necmettin Erbakan Üniversitesi (NEÜ) Meram Tıp Fakültesi Hastanesi'nde anti-HCV bakılan hastalar dahil edilmiştir. Bu olgular arasından HCV RNA bakılmayanlar tekrar kontrole çağrılmış, gerekli tetkik ve tedavileri yapılmıştır. Bulgular: Kayıtlarına ulaşılan 161.282 kişinin %6,3'ünün (n = 10.115) test sonucu pozitifti. En sık anti-HCV tetkiki isteyen bölümler %8,9 hepatoloji ve %7,8 kadın hastalıkları ve doğum idi. Anti-HCV pozitifliği saptanan olguların %53,3'ü erkekti ve yaş ortalaması 55,12 ± 16,83 yıldı. Yapılan tetkiklerin %60,7'si tarama amaçlıyken, %39,3'ü preoperatif tetkiklerdi. Anti-HCV pozitifliği saptanan olguların %74,0'ının (n = 7485) HCV RNA pozitif olduğu, %3,4'üne (n = 342) ise HCV RNA bakılmadığı görüldü. Pozitif anti-HCV saptadıktan sonra en sık HCV RNA tetkiki isteyen bölümler %40,1 enfeksiyon hastalıkları ve %33,4 hepatoloji iken, en sık HCV RNA istemeyen bölümler %9,9 genel cerrahi ve %8,8 göz hastalıklarıydı. HCV RNA bakılmayan tetkiklerin %58,8'i tarama amaçlı, %41,2'si preoperatif tetkik amacıyla istenmişti. HCV RNA bakılmayan 100 olguya yapılan HCV RNA tetkiki sonucunda, olguların %95'inin negatif, %5'inin ise pozitif olduğu belirlendi. Güncel başvurularında HCV RNA negatif olduğu saptananlarla karşılaştırıldığında, HCV RNA pozitif olanların ilk başvurularında değerlendirilen anti-HCV düzeyi istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha yüksekti (p<0,001). HCV RNA pozitifliği saptananların 4'ünde non-sirotik karaciğer saptanırken, 1 olguda karaciğer parankiminin kabalaşmış olduğu görüldü. Sonuç: Çalışmamız anti-HCV pozitifliği olan hastaların ilgili hekimlerce ileri tetkik ve tedavi için sevk edilmesinde önemli eksiklikler olduğunu vurgulamaktadır. Kronik hepatit C için yoğun tarama ve doğrudan etkili antivirallere daha fazla erişim gereklidir. Anahtar sözcükler: hepatit C virüsü, prevalans, tarama, tedavi, farkındalık
Antifosfolipid sendromunda aktivasyonla uyarılan sitidin deaminaz(AID) geninin transkripsiyon analizi
Antifosfolipid sendromu (AFS), arteriyel ve venöz tromboz eğilimi, tekrarlayan düşükler ve antifosfolipid antikorlarının varlığı ile karakterize bir hastalıktır. AFS'de tromboz gelişiminde; klinik tablodan negatif yüklü fosfolipidler ve fosfolipid-protein komplekslerine karşı oluşmuş olan antifosfolipid antikorlarının (lupus antikoagülanı, antikardiyolipin antikorları ve anti-ß2 glikoprotein-I antikorları) sorumlu olduğu düşünülmektedir. Immünglobulin (Ig) çesitliliğine sebep olan baslıca üç B lenfosit mekanizması vardır. Bunlar somatik hipermutasyon (SHM), gen dönüşümü (GC) ve sınıf çevrim rekombinasyonudur (CSR). Bu üç önemli mekanizmanın AID (aktivasyonla uyarılan sitidin deaminaz) denilen bir protein ile kontrol edildiği bildirilmiştir. AID'in Ig dışı genlerde de DNA hasarı oluşturduğu ve genom stabilitesini bozduğu gösterilmiştir.Çalışmamızda, immun çeşitliliğe sebep olan AID geninin anlatım düzeyini belirleyerek, AFS'deki otoimmuniteye katkısının varlığını araştırmayı amaçladık. 70 AFS tanısı konan hasta ile 70 sağlıklı erişkin kontrolden oluşan 2 grubun periferik kan örneklerinden total RNA izolasyonu gerçekleştirildi. Total RNA örnekleri cDNA'ya çevirildi. Hedef gen (AID) ve referans gene (HPRT1) ait tasarlanan primer ve problar kullanılarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Q PCR) yapıldı. Böylece referans ve hedef gene ait cDNA'lar çoğaltıldı. Genlerin ekspresyon düzeyleri ölçülerek, veriler kaydedildi. Elde edilen istatistiksel analizler sonucunda AID mRNA düzeyinin, AFS hastalarında sağlıklı erişkin gruba oranla 40 kat fazla bulunduğu hesaplandı.AID geninin fazla anlatımı somatik hipermutasyon oranında artış ve otoantikor oluşumunda etkili olabilir. Sonuç olarak, AID proteininin AFS'de otoantikor oluşumunda anahtar rol oynayabileceği gözlenmiştir. Daha fazla ve kontrol bireyi ile yapılacak çalışmalarla bu sonuçların desteklenmeye ihtiyacı vardır.
Linagliptin ve empagliflozin tedavilerinin STZ-diabetik sıçan kalbinde olası etkilerinin miRNA'lar üzerinden karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesi
DPP-4 ve SGLT2 inhibitörleri tip 2 diabet tedavisinde son yıllarda sıkça kullanılan ilaç gruplarındandır. Bugüne kadar yapılan preklinik ve klinik çalışmalar her iki grubun da kardiyovasküler yararına dikkat çekmektedir. Kodlama yapmayan küçük RNA'lardan miRNA'lar hedef mRNA'ları üzerinden birçok vücut fonksiyonunu düzenlemektedir. Yakın zamanlı birçok çalışmada, bazı ilaçların olumlu etkilerini belirli miRNA'ları modüle ederek ortaya koyduğu öne sürülmektedir. Bu bilgilerden yola çıkarak, çalışmamızda STZ diabetik sıçan modeli kullanılarak bir DPP-4 inhibitörü olan linagliptin ile bir SGLT2 inhibitörü olan empagliflozinin kardiyak etkilerinin miRNA'lar üzerinden incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, sıçanlar randomizasyonla kontrol, diabetik, linagliptin tedavili kontrol, linagliptin tedavili diabetik, empagliflozin tedavili kontrol, empagliflozin tedavili diabetik olmak üzere 6 gruba ayrılmıştır. STZ injeksiyonu (50 mg/kg) ile diabet oluşturulmuş, 12-15 haftanın ardından tedavi alacak gruplara 8-10 hafta süreyle linagliptin (4mg/kg/gün) veya empagliflozin (30mg/kg/gün) uygulanmıştır. Tedavi öncesinde ve tedavinin 8. haftasında ekokardiyografi ile in vivo kalp fonksiyonu değerlendirilmiştir. Sonrasında in vitro olarak papiller kasta β-adrenerjik yanıtverirlik değerlendirilmiş ve kardiyomiyositlerde Ca+2 ölçümü/görüntülemesi yapılmıştır. Dondurulan sol ventrikül dokularında ise miRNA'ların (miR-221, miR-212, miR-29b, miR-29a, miR-199a, miR-30a, miR-1, miR-133a, miR-125b, miR-21, miR-373) ifadeleri incelenmiştir. Değişimi anlamlı bulunan miRNA'ların fonksiyonel olarak çalışılan yolaklarla ilişkili olan hedef genleri veri tabanları yardımıyla belirlenmiş ve bu genlerin mRNA ve protein ifadeleri ölçülmüştür. Veriler ortalama ± standart sapma şeklinde ifade edilmiştir. İkili karşılaştırmalar için t test, çoklu karşılaştırmalarda ise tek-yönlü ANOVA ve Tukey post-hoc testi kullanılmış ve p<0,05 istatistiksel anlamlılık olarak kabul edilmiştir. Sonuç olarak, STZ ile indüklenen diabete bağlı hipertrofi kalp ağırlığı/beden ağırlığı oranındaki artış ve bazı ekokardiyografi parametreleri ile doğrulanmıştır. İzoprenalin ile uyarılan β-AR aracılı kasılma yanıtı ile β1- ve β2-AR mRNA ifadeleri gruplar arasında benzerdir. miR-1 ve miR-133a ifadeleri kontrole oranla tüm gruplarda azalmıştır. Bu miRNA'ların hedeflerinden PLN, NCX ve PRKACB mRNA ve protein ifadeleri gruplar arasında farklılık göstermemiştir. SERCA2a protein ifadesi ise diabetik ve tedavili diabetiklerde kontrole kıyasla azalmıştır. Tüm bu bulgular ışığında, linagliptin ya da empagliflozin tedavilerinin STZ diabetik sıçan kalbinde gözlenen fonksiyonel ve moleküler değişimlere herhangi bir olumlu etkisinin olmadığı görülmektedir. Her iki ilacın da diabetik kalpte olası olumlu etkilerini test etmek adına, farklı diabetik modellerin ya da "tedavi edici" yerine "önleyici" yaklaşımın tercih edildiği yeni çalışmaların planlanması yarar sağlayacaktır.