Alphaherpesvirinae alt ailesine mensup viruslarda CRISPR//CAS9 aracılı eş zamanlı virülens gen silinmesi ve heterolog gen eklenmesi

CRISPR aracılı hassas gen düzenleme, prokaryotik konakçı-virüs ilişkisi üzerine yapılan araştırmalar neticesinde keşfedilmiş, devrim niteliği taşıyan, önemli bir teknoloji olarak kabul edilmiştir. Biyoloji biliminin birçok alanında olduğu üzere günümüzde viroloji ve antiviral terapide sıklıkla başvurulan, güvenilir ve etkin bir araç haline gelmiş, özellikle viral gen knockout ve knock-in çalışmalarında kullanım alanı bulmasıyla öne çıkmıştır. Bu tez çalışmasında, Alphaherpesvirinae familyasına mensup Bovine alphaherpesvirus 1 (BHV-1) ve Gallid alphaherpesvirus 1 (GaHV-1) model olarak alınmış, bu virüsler için sırasıyla timidin kinaz (tk) ve dUTPaz genleri CRISPR hedef bölgesi olarak seçilmiştir. Sözkonusu bölgelere BHV-1 için bir kırmızı floresan protein geni (rfp) olan DsRed, GaHV-1 için ise DsRed ve Newcastle hastalığı virüsüne ait füzyon (F) geninin insersiyonu hedeflenmiş, bu amaçla insersiyon kasetleri donör plazmid üzerine yerleştirilen tuzak sekansları üzerinden aynı yöntem ile kesilerek serbest bırakılmıştır. Neticede GaHV-1 için DsRed ve F insersiyonu gerçekleştirilmiştir. Ardından Cre-Lox Rekombinasyon metotu kullanılarak reporter geni çıkarılmış, geriye kalan heterolog F gen kasedinin başarılı bir biçimde eksprese olduğu ispatlanmıştır. Ayrıca son ürün rekombinant virüsün, tk defektif ve çift heterolog gen taşıyan virüslere göre plak oluşturma ve zamana bağlı çoğalma kapasitesinde azalmanın olmadığı ortaya konulmuştur. Sonuç olarak çalışmada CRISPR-Cre-Lox metodolojisi birlikte kullanılarak, GaHV-1 üzerinde eşzamanlı gen delesyon ve insersiyon gerçekleştirilmiş, böylelikle virüsün virülens faktörü silinerek attenüe edilirken aynı zamanda heterolog gen (F geni) taşıyan bir multivalan viral vektör elde edilmiştir. Bununla beraber BHV-1'de CRISPR aracılı gen düzenlemenin gerçekleştirilebilmesi için yöntemin geliştirilerek uyarlanacağı yeni çalışmalara ihtiyaç olduğu ortaya çıkmıştır.