APOBEC1 enzimi ve yardımcı kofaktörleri için hücresel klonların üretilmesi

Bu çalışmada, RNA düzenleme enzimi APOBEC1 tarafından indüklenen RNA düzenlemesinin analizi için uygun bir hücresel model oluşturma amaçlanmıştır. "RNA düzenleme" terimi, DNA üzerinde bulunan nükleotidler tarafından belirlenen RNA nükleotid dizilerinden farklı olan dizilerin oluşmasına yol açan sayısız hücresel süreçleri tarif etmek için kullanılmıştır. RNA'ları etkileyen bu süreçler, değişikliğe uğramış transkriptlerin fonksiyonunu veya kodlama potansiyelini değiştirmekle beraber bu modifikasyonların elde edildiği hücresel mekanizmaların karakterize edilmesinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Genel olarak, bu çalışma araştırmanın iki yönünü ele almaktadır. Birincisi, apolipoprotein B'nin mRNA düzenlemesinin in vivo olarak gerçekleştiği ince bağırsak enterositlerine fenotipik olarak benzemelerini sağlamak amacıyla belirli kültür ortamında Transwell filtreleri üzerinde kültürlenen Caco-2 hücrelerinin hücre farklılaşmasına yönelik koşulların düzenlemesi ile ilgilidir. Bu nedenle, APOBEC1 ve onun kofaktörleri olan ACF (Apobec1 Complementation Factor) ve RBM47'nin (RNA Binding Molecule 47) eksik olduğu Caco-2 hücre klonları oluşturulmuştur. Diğer yönüyle, bu araştırma editozom elementleri olan APOBEC1, ACF ve RBM47'yi kodlayan genleri inaktif hale getirme çalışmasını kapsamaktadır. Bu süreçte, bakteriyel CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR-associated 9) sisteminden türetilen çok popüler bir genom düzenleme aracını kullanılmıştır. Son aşamada ise, APOBEC1, ACF ve RBM47 proteinlerinin eksik olduğu Caco-2 hücreleri, knock-out edilmiş ilgili genlerin dizi analizi için spesifik bir ortamda kültürlenmiştir.