Bakteriofaj T4 lizozim geninin (Gen e) plazmid vektörler ile klonlanması

ÖZET Bakteriofaj T4 Lizozim Geninin (Gen e) Plazmid Vektörler ile Klonlanması Lizozim (EC 3.2.1.17), prokaryotik hücre duvarlarının peptidoglikan heteropolimerlerinde bulunan N-asetil glukozamin (NAG) ve N-asetil muramik asit (NAM) arasındaki p-1,4 glikosidik bağlarının hidrolize olmasını katalizleyen bir enzimdir. Bu çalışmada, bakteriofaj T4 lizozim geninin (gen e) pUC18 ve pRS416 vektörlerini kullanarak Escherichia colFde klonlanması amaçlanmıştır. Gen e'nin T4 genomundan PCR ile amplifikasyonu için Bam HI tanıma dizisine sahip primerler dizayn edildi. Vektörlerin ve PCR ürününün Bam HI endonükleaz ile kesiminden sonra ligasyon reaksiyonu ile iki rekombinant plazmid oluşturuldu ve pUC18L ve pRS416L olarak isimlendirildi. Bu plazmidleri taşıyan rekombinant E. coli hücrelerinin gen e'yi eksprese ettiği ve lizozim E olarak adlandırılan aktif T4 lizozimini besi ortamına salgıladığı tespit edildi. Aynı zamanda lizozim E'yi üreten E. coli klonlarının L ve LB besi ortamlarında lize olmaksızın ürediği gözlendi. Fakat, kültüre alınan rekombinant bakteri hücrelerinin, non-iyonik su veya 10 mM'lık Tris pH 8.0 gibi osmatik dengeleyicilerin olmadığı hipotonik bir ortama alındıklarında ozmatik basınca dayanamayarak kolayca patladığı görüldü. Rekombinant E. co/fnin hücre duvarının, üretilen lizozim E'nin etkisi ile zayıflatılmış olabileceği fakat besi ortamındaki tuz konsantrasyonuyla oluşturulan ozmatik basıncın ise duvarı zarar görmüş hücreleri lize olmaktan korumuş olabileceği düşünülmektedir. Bu sonuçlar, gen e'yi taşıyan her hangi bir E. coli plazmid vektörü ile EDTA, lizozim ve SDS gibi hücre duvarı ve hücre zarını parçalayıcı ajanlar kullanmaksızın plazmid veya kromozomal DNA izolasyonunun kolaylaştırabileceğini göstermektedir. pRS416L bu amaca yönelik olarak geliştirilmiş bir prototip mekik vektördür. Anahtar Sözcükler: E. coli, T4 Lizozim geni, Klonlama, PCR, Plazmid vektörler IX