Oksalat dekarboksilaz enziminin rekombinant DNA teknolojisi ile üretimi ve karakterizasyonu

Oksalat taşları üriner sistemde biriken kalsiyum ve oksalik asidin oluşturduğu yapılardır. Oksalat taşları ileri zamanlarda böbrek taşı oluşturur ve erken tanısı için idrar oksalat seviyelerinin ölçülmesi önemlidir. Ülkemizde ve dünyada oksalat seviyeleri oksalat oksidaz ve oksalat dekarboksilaz olmak üzere iki farklı yöntem ile ölçülmektedir. Oksalat oksidaz yönteminde Oksalattan H2O2 ve CO2 açığa çıkarken, Oksalat dekarboksilaz yönteminde reaksiyon sonunda oluşan format'ın format dehidrogenaz enzimiyle parçalandığında açığa çıkan NADH+'nın spektrofotometrik yöntemle ölçülmesiyle oksalat miktarı tayin edilebilmektedir. Bu çalışmada, oksalat dekarboksilaz enziminin rekombinant DNA teknolojisi ile üretimi hedeflenmiştir. Böylece elde edilen rekombinant oksalat dekarboksilaz enzimi ticari olarak satılan format dehidrogenaz enzimi ile birlikte kullanılarak oksalat tayininde kullanılacak bir ölçüm metodunun geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bunun için Basillus subtilis M168 suşundan elde edilen yvrK geni pET SUMO TA Cloning® vektör sistemi ile One Shot® Mach1™-T1R Escherichia coli ve BL21(DE3) One Shot® Escherichia coli mikroorganizmalarına aktarılarak klonlama ve protein ifadesi işlemleri yapılmıştır. Böylelikle elde edilen 6xHis-SUMO-yvrK füzyon proteini başarılı bir şekilde üretilmiştir. Gerekli kofaktör, optimum pH ve sıcaklık sağlanıp karakterizasyonu ve enzim aktivitesi belirtilmiştir. Ayrıca ticari olarak temin edilen format dehidrogenaz enzimi de kullanılarak idrarda oksalat miktarını ölçmekde kullanılabilecek enzimatik aktivitesi yüksek bir oksalat ölçüm metodu geliştirilmiştir.