Rekombinant yöntemlerle sentetik parathormon üretimi

Biyoteknoloji alanında üretilen ürünler içerisinde proteinler oldukça önem taşımaktadır. Rekombinant yöntemler kullanılarak sentetik olarak üretilen proteinler terapötik, endüstriyel ve bilimsel araştırma amaçlı üretimleri gerçekleştirilmektedir. Çalışmamızdaki amaç, rekombinant teknoloji kullanılarak terapötik kullanımını amaçladığımız parathormonu üretmektir. Parathormon (PTH) polipeptid yapısında 84 aminoasitlik (aa) tek bir zincir olarak paratiroid bezlerinden salgılanır. PTH'nin başlıca sorumluluğu, kemiklerden kalsiyum (Ca+2) emilimi ile plazma Ca+2 değerlerini düzenlemektir. Böbrekler ve bağırsaktan Ca+2 emilimi ve aynı zamanda fosfat (PO4−3) atılımınını sağlayarak, Ca+2-PO4−3 metabolizmasındaki homeostaziyi sağlamakta önemli bir role sahiptir. D vitamininin aktif formunun üretimi üzerine olan etkisi ile kalsiyumun bağırsaklardan emilimini kolaylaştırır. Hormonun az ya da çok salgılanması çeşitli sağlık sorunlarına neden olabilir. PTH'nin az salgılanmasıyla görülen en önemli endokrin rahatsızlık hipoparatiroidizm olarak adlandırılır. Çalışmamızda hipoparatiroidizme alternatif tedavi yöntemi olması planlanan sentetik PTH üretimi hedeflenmiştir. Bu çalışmada, hiperplazi dokudan alınan örnekten mesajcı ribo nükleik asit (mRNA) izolasyonu ve daha sonrasında komplementer deoksiribo nükleik asit (cDNA) eldesinin spesifik primerler ile DNA fragmentleri oluşturan, DNA polimeraz enzimi kullanılarak gerçekleştirilen polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) çalışmaları sonucunda PTH geni elde edilmiştir. Rekombinant PTH (rPTH) N-Terminal (1-84) kodlayan gen, PEGFP-N1(ökaryotik plazmid vektör) klonlama vektörüne sekresyon sinyalinin ardına yerleştirilip, moleküler klonlama teknikleri kullanılarak klonlanmıştır. Konak organizma olarak One Shot® Mach1™ T1R Escherichia coli kompetent suşu kullanılmıştır. Vektör içerisine aktarılan rPTH geni, hücre kültüründe HeLa (Henrietta Lacks, serviks kanseri) ve AGS (ATCC®CRL-1739™, Gastrik Adenokarsinoma) hücre hatlarına transfeksiyon ajanı ile 24 sa., 37 santigrat (˚C) ve %5 CO2 içeren etüvde inkübasyona bırakılmıştır. 24 sa.lik kültür sıvısından aktivasyon ölçümü ile PTH seviyesi ölçülmüş ve ekspresyon düzeyi sodyumdodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) analizi ile değerlendirilmiştir. Bu çalışmada elde edilen sonuç ile medikal alanda çalışmaları sürdürülen sentetik PTH'nin elde edilmesi ile geliştirilen N- terminal (1-84) formülasyonu hipoparatiroidi tedavisi için umut verici olabilmesi ve rekombinant ilaç üretimi alanında bilimsel çalışmalara katkı sağlaması amaçlanmıştır.