688
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Yardımcı üreme teknikleri ve spontan gebe kalan hastalara ait plasenta örneklerinde mikroplastik varlığının çeşitli parametreler ile değerlendirilmesi
Plastikler hafif ve esnek olması, kolay işlenebilirliği, kullanım kolaylığı ve ekonomik olması gibi özellikleri ile hayatımızın birçok alanında karşımıza çıkmaktadır. Doğada kolay parçalanamayan bu ürünler zamanla daha küçük boyutlu plastik parçalara ayrılır. Mikroplastikler boyutları 0,001-5 mm arasında değişen plastik parçacıklar olup doğaya karışan plastiklerin kimyasal yapılarının zamanla bozulmasıyla meydana gelir. Günlük hayatta bilinçli ya da bilinçsiz olarak birçok mikroplastik kaynağı ile karşı karşıya kalmaktayız. Tüketim ve kozmetik ürünleri, tekstil ürünleri, endüstriyel hammaddeler gibi hayatın her alanından mikroplastik kaynaklarıyla besin zincirine karışan mikroplastikler toprak, hava ve su yoluyla ekosisteme karışmakta ve besin zinciri ile canlıların dokularında birikmektedir. Tüm canlılar üzerinde potansiyel risk oluşturan mikroplastikler insanlarda kan, akciğer, karaciğer, böbrek, dalak, balgam, feçes, plasenta ve anne sütü gibi biyolojik numunelerde tespit edilmiştir. Bu doktora tez çalışmasında, infertilite tanısı nedeniyle yardımcı üreme teknikleri tedavisi alarak gebe kalan anneler ile herhangi bir tedavi almadan spontan gebe kalan annelerden alınan plasenta numuneleri üzerinde mikroplastik varlığının araştırılması ve karşılaştırılması amaçlanmıştır. Dünyada olduğu gibi ülkemizde de önemli halk sağlığı patolojilerinden biri haline gelen infertilite, en az 12 ay süreyle korunmasız düzenli cinsel ilişkiye rağmen, gebeliğin sağlanamaması durumudur. Yapılan literatür incelemeleri kapsamında insanlara ait dokular üzerinde mikroplastik maruziyetinin infertiliteye olan etkisi ile ilgili henüz bir çalışma yapılmadığı saptanmıştır. Bu çalışmada, fertil gruplar ile infertil gruplardan elde edilen plasenta numunelerindeki mikroplastik varlığı Fourier Dönüşümlü Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi, Raman Spektroskopisi ile Taramalı Elektron Mikroskobisi (SEM) ve Enerji Dağılım Spektroskopisi (EDS) gibi ayırıcı yöntemler ile araştırılmıştır. Plasenta numunelerinde mikroplastik türevlerinden PE, PP, PS, PET ve PU tespit edilmiş olup, infertil grupta eser düzeyde daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu çalışma, insan plasenta numuneleri kullanılarak fertil ve infertil gruplarda mikroplastik varlığının karşılaştırıldığı ilk çalışmadır. Ancak etik kurallar ve klinik uygulamalardaki güçlükler ve çalışmaya dahil olan gönüllü anne adaylarının yaşam standartları, beslenme alışkanlıkları ve plastik kullanımına yatkınlıkları gibi etkenler araştırmanın kısıtlılığını oluşturmaktadır. İleriki süreçlerde kapsamlı ve daha fazla sayıda örneklem ile araştırmaların yapılması, mikroplastiklerin üreme sağlığı, infertilite ve gebelik süreçleri üzerindeki etkilerinin netleştirilmesine olanak sağlayacağı düşünülmektedir
Düşük molekül ağırlıklı heparin (DMAH)'in kompleman sistem inhibisyonu yolu ile lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı akut akciğer hasarına koruyucu etkisinin incelenmesi: alveolo-kapiller membran üzerine etkisi
Enoksaparin sodyum (ENX), malignite cerrahileri sonrası, ciddi enfeksiyonlarda, organ yetmezliklerine bağlı oluşabilecek venöz tromboemboli profilaksisinde sık kullanılan bir DMAH'dır. Bu etkinliğinin yanı sıra kompleman protein kaskadını proksimal basamaklar üzerinden inhibe etmektedir. Bu nedenle bu ajanı, çalışmamızda klasik ve lektin yolağı inhibitörü olarak kullanmayı tercih ettik. Lipopolisakkarit (LPS) ile indüklenmiş akut akciğer hasarı (ALI) modelinde bazı sitokinlerin ve komplemanların lokal ve sistemik düzeylerindeki değişim dinamiği ve dokudaki histopatolojik değişiklikler ile korelasyonu incelenerek kompleman blokajının patogenez tablosundaki rolünü ortaya koymayı amaçladık. Deneyde, 46 adet erkek Wistar Albino cinsi rat kullanıldı. Sham (SHM), ENX, ENX+LPS ve LPS grubu olmak üzere randomize 4 gruba ayrıldı. Ratlara 5 mg/kg LPS intratrakeal yolla hemen ardından 2mg/kg DMAH subkutan yolla verildi. LPS uygulanmasından 6 saat sonra BALF örneği alınıp sakrifikasyon gerçekleştirilerek serum ve doku örnekleri alındı. BALF ve serumdan elde edilen örneklerde, ELISA yöntemi ile TNF-α, IL-8, C3 ve C2 düzeyleri analiz edildi. Doku örneklerinde ise histokimyasal (H-E, Masson Trikrom, PAS) ve immunohistokimyasal (TNF-α ve CC-16) boyamalar yapılarak histopatolojik değişiklikler değerlendirildi. Lokal parametrelerde (BALF, histopatoloji) gruplar arası anlamlı farklılıklar tespit edildi. Sistemik parametrelerde (serum) ise anlamlı fark gözlenmezken parametreler arası anlamlı korelasyonlar görüldü. LPS grubunda histopatolojik hasar skoru SHM, ENX ve ENX+LPS gruplarına göre anlamlı düzeyde yüksek gözlendi. Bununla birlikte, ENX'in alveolo-kapiller membran hasarını önlemesi ile birlikte inflamasyon interstisiyel alan ile sınırlı kalmıştır. C3'ün hasar ile anlamlı korelasyonu bulunurken C2'nin korelasyonu gözlenmedi. ENX grubunda, TNF-α ve IL-8, hasar ile daha belirgin bir korelasyon gösterirken; LPS grubunda, C3 ile daha anlamlı bir korelasyon gözlendi. Bu durum, ENX uygulanması sonucu kompleman sistemi kısmen bloke edilse de elde edilen bulgular inflamasyonun alternatif yolaklar ve TNF-α/IL-8 üzerinden devam ettiğini bize gösterir. Buna göre, kompleman sistem ürünleri hücresel sitokinlere göre daha baskın rol oynamıştır. Bu bağlamda; ALI'nin kötü prognozuna yol açan sitokin fırtınasının kompleman sistem üzerinden engellenebileceği düşünülmektedir. Sonuç olarak, ENX'in alveolo-kapiller membranda koruyucu rolü olduğu görünse de; uygulanan LPS prosedürünün daha uzun sürelerde tutulmasının, sitokin fırtınası ve kompleman sistemi ile ilişkisini ve patogenezi daha net bir şekilde ortaya koyacağı kanaatindeyiz.
Ratlarda lipopolisakkarit (LPS) ile indüklenen testis hasarında Riociguat (BAY 63-2521)'ın etkisinin değerlendirilmesi
Riociguat, kronik tromboembolik pulmoner hipertansiyon ve pulmoner arteriyel hipertansiyon tedavisinde kullanılan çözünür guanilat siklaz stimülatörüdür. LPS, gram negatif bakterilerin önemli bir bileşeni olup, testislerdeki çeşitli proinflamatuar sitokinlerin salgılanmasını destekleyerek inflamatuar yanıtı tetikler. Bu çalışmada, riociguat ve LPS uygulamasının testis dokusu üzerinde oluşturabileceği histolojik değişiklikler ile testiküler hasar, oksidatif stres ve apoptozis gibi süreçlerin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Wistar albino sıçanlar; Kontrol, LPS, Düşük Doz Riociguat (DDR), Yüksek Doz Riociguat (YDR), LPS+DDR ve LPS+YDR olmak üzere 6 gruba ayrıldı (n=8). Riociguat (1 ve 10 mg/kg/gün), 3 gün boyunca, LPS (5 mg/kg/gün) ise 3. günde tek doz uygulandı. Sıçanlara ait testis dokuları; histokimyasal (HE), immünohistokimyasal (Cas-3 ve TNF-α), biyokimyasal (TAS, TOS, OSI ve GPx), genetik (Bax, Bcl-2 ve HIF-1α) ve spermiogram analizleri yapılarak değerlendirildi. Sonuçlarımız, riociguat'ın; antioksidan sistemleri güçlendirerek oksidatif strese karşı koruyucu olabileceğini, ancak TOS seviyelerindeki değişikliklerin riociguat uygulamalarının oksidanları doğrudan düşürmek yerine antioksidan mekanizmalar aracılığıyla etki edebileceğini düşündürmektedir. Riociguat'ın, sperm konsantrasyonu açısından olumlu etkiler gösterebileceğini, sperm motilitesi açısından belirgin bir etkisinin olmadığını, spermlerin ileri hareketini artırdığını, ancak yerinde hareketli sperm sayısını değiştirmediğini, DDR'nin ise sperm hareketliliği üzerindeki etkisinin ileri hareketli sperm oranını artırmada belirgin, ancak hareketsiz spermleri azaltmada sınırlı olduğunu göstermiştir. Ayrıca, LPS ile oluşan histopatolojik değişiklikleri azaltarak iyileşme sağlamıştır. Bu sonuçlar, RİO'nun testis fonksiyonlarını destekleyerek üreme sağlığını olumlu yönde etkileyebileceğini düşündürmektedir. Riociguat, HIF-1α aktivitesini yüksek dozda baskılayarak testiste inflamasyon sonucu oluşan hipoksik durumu azaltabileceğini ve apoptozis süreci değerlendirildiğinde, TNF-α boyanmasıyla dışsal yolu, Bax artışı ve Bcl-2 azalması ile içsel yolu tercih ettiği ve Cas-3 boyanmasıyla iki yol arasında bağlantının olabileceğini düşündürmektedir. Bu çalışma sonucunda, LPS tarafından üretilen ve önemli patojenik aracılar olan proinflamatuar sitokinlerin, artan ROS üretimi yoluyla steroidogenezde engelleyici bir rolü olduğu ve LPS ile oluşturulan inflamasyon, testiküler hasar ve oksidatif stres gibi durumlarda riociguat tedavisinin, testislerde intrinsik ve ekstrinsik apoptoz yollarında etkin olabileceği kanısına varılmıştır. Anahtar Kelimeler: Riociguat, Lipopolisakkarit (LPS), Toksisite, Testis, Rat
Escherichia coli (E. Coli) lipopolisakkaridi (LPS) tarafından deneysel olarak indüklenen endotokseminin neden olduğu akciğer, karaciğer ve böbrek doku hasarına karşı TLR4-etkileşimli SPA4 peptidinin etkisinin araştırılması
Yakın tarihli çalışmalar sürfaktan protein A'dan derive SPA4 peptidinin hem bakteriyel enfeksiyon hem de lipopolisakkarit (LPS) modellerinde akciğer inflamasyonu ve doku hasarını azalttığını, bakteriyel yükü düşürdüğünü ve bakteri fagositozunu artırdığını göstermiştir. Bu araştırmanın amacı, SPA4'ün akciğer dışında karaciğer ve böbrekte de doku koruyucu etkinliğini değerlendirmektir. Bu amaç doğrultusunda, ratlarda intraperitoneal tek doz LPS ile oluşturulan sistemik inflamatuar yanıt sonrası, düşük (2,5 µg/g) ve yüksek (10 µg/g) dozlarda SPA4 uygulamasının akciğer, karaciğer ve böbrek dokularındaki etkileri histopatolojik olarak incelenmiştir. Çalışmada 72 adet erkek Wistar-Albino rat kullanılarak kontrol, LPS, LPS+düşük doz SPA4 ve LPS+yüksek doz SPA4 grupları ile sadece düşük ve sadece yüksek doz SPA4 grupları oluşturulmuştur. LPS uygulamasından 1 saat sonra SPA4 uygulamaları yapılmış ve 6 saat sonra ratlar sakrifiye edilerek doku örnekleri alınmıştır. Doku hasarı değerlendirmeleri için Hematoksilen-Eozin (H-E), PAS, Masson-Goldner Trikrom ve immünohistokimyasal (NF-κB p65) boyamalar uygulanmıştır. Ayrıca deney süresince ratların genel durumları "Kemirgen Sepsis Skorlaması" ile takip edilmiştir. Sonuçlar, LPS uygulamasının oluşturduğu semptomların düşük doz SPA4 ile anlamlı olmayan, yüksek doz ile ise anlamlı derecede düzeldiğini gösterdi. LPS ile oluşan akciğer dokusu inflamasyonu ve hasarı yüksek doz SPA4 ile belirgin şekilde, düşük doz ile orta seviyede azalmıştır. Yüksek doz SPA4, akciğerde atelektazi, inflamasyon ve kanamayı azaltarak kontrol grubuna yakın düzeylere getirmiştir. Karaciğerde ise düşük doz SPA4 anlamlı olmayan, yüksek doz ise anlamlı derecede hasar azaltıcı etki gözlenmiştir. Böbrek dokusunda da benzer şekilde yüksek doz SPA4, LPS'nin oluşturduğu tübüler hasarı ve konjesyonu belirgin biçimde azaltmış, düşük doz ise sadece orta düzeyde iyileşme sağlamıştır. Ayrıca, yüksek doz SPA4 uygulaması tüm dokularda LPS ile artan NF-κB aktivasyonunu belirgin ve anlamlı şekilde düşürürken, düşük dozda bu düşme orta derecede ve anlamsız düzeyde kalmıştır. Yalnızca SPA4 uygulanan gruplarda ise kontrole göre bir farklılık görülmemiştir. Sonuç olarak, SPA4 peptidi özellikle yüksek dozda, akciğerin yanı sıra karaciğer ve böbrek dokularında da LPS kaynaklı hasarı azaltarak organ koruyucu etkiler göstermiştir. Ayrıca sadece SPA4 uygulanan gruplarda herhangi bir toksisiteye rastlanmamıştır. Çalışmamız ile SPA4'ün tedavi edici etkinliği ilk defa akciğer dışı organlarda da (karaciğer ve böbrek) incelenmiştir. Bununla birlikte, SPA4'ün etkisinin moleküler düzeyde proinflamatuar sitokinlerin değişimleri açısından akciğer dışı organlarda da incelenmesi gerekmektedir.
Ferula Elaeochytris Korovin (çakşır) kökü ekstresinin insan sperm parametrelerine etkisinin in vitro olarak araştırılması
Bu çalışmanın amacı, Ferula elaeochytris Korovin (çakşır) kökü ekstresinin insan sperm parametreleri üzerindeki etkilerini in vitro ortamda değerlendirmektir. Çalışma dizaynı Prospektif kesitsel olarak tanımlanmıştır. Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi Tüp Bebek Ünitesi Androloji Laboratuvarına rutin semen analizi için başvuran, yaşları 20 ile 42 arasında değişen ve Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 2010 kriterlerine göre semen parametreleri normal olan 36 erkek hastadan semen örnekleri toplanmıştır. Çalışmada, normospermik bireylerden elde edilen 36 semen örneği, altı gruba ayrılmıştır: Kontrol (G1), vehicle kontrol (PBS, G2), Silymarin uygulanan grup (G3) ve Ferula elaeochytris Korovin ekstresinin sırasıyla düşük (20 μL, G4), orta (50 μL, G5) ve yüksek dozlarının (100 μL, G6) uygulandığı gruplar. Tüm gruplar 30 dakika süreyle inkübasyona tabi tutulmuş, ardından sperm fonksiyonları, apoptoz, DNA bütünlüğü, mitokondriyal aktivite ve biyokimyasal parametreler değerlendirilmiştir. Hastaların yaş ortalamaları 30,674,85 yıl olarak saptanmıştır. Gruplar sperm özellikleri yönünden arasında ileri motilite (p=0,019), ileri hızlı motilite (p=0,003), yerinde hareketli (p=0,019) yönünden anlamlı farklar saptanmıştır. Apoptoz sürecinde gruplar arasında DNA bütünlüğü (p=0,969) ve apoptoz (p=0,062) yönünden anlamlı farklılık saptanmamıştır. Canlılık belirteçleri yönünden vitalite (p=0,220) ve mitokondriyal aktivite (p=0,728) yönünden anlamlı farklılık saptanmamıştır. Biyokimyasal parametreler yönünden TAS (p=0,001) ve TOS (p=0,001) yönünden anlamlı farklılık saptanmıştır. Çalışmamızda, Ferula elaeochytris Korovin ekstresinin in vitro koşullarda normospermik bireylere ait semen örneklerinde sperm hareketliliği, canlılığı, apoptoz oranı, DNA bütünlüğü ve biyokimyasal parametreler üzerindeki etkileri doz düzeylerine bağlı olarak değerlendirilmiştir. Elde edilen bulgular, düşük ve orta doz uygulamalarının sperm parametreleri üzerinde belirgin bir toksik etki göstermediğini, ancak yüksek dozun ileri hareketlilik gibi bazı fonksiyonel parametrelerde olumsuz sonuçlara yol açabileceğini ortaya koymuştur. Ayrıca silymarin uygulamasının antioksidan kapasiteyi artırarak hücresel savunmayı desteklediği görülmüştür. Sonuçlar, Ferula elaeochytris'in kontrollü dozlarda potansiyel faydalar sağlayabileceğini, ancak yüksek dozlarda spermatotoksik risk taşıyabileceğini göstermektedir.
N-methyl-4-phenylpyridinium ıodide (MPP+) aracılıparkinson hücre modelinde otofaji aktivatörüfluspirilenin endoplazma retikulumu stresindeki ıre1yolağına etkisinin araştırılması
Dünya genelinde ikinci en sık görülen nörodejeneratif hastalık olan Parkinson hastalığının altında yatan birçok moleküler mekanizma bulunmaktadır. Bu mekanizmalardan biri de endoplazma retikulumu stresidir. Endoplazma retikulumu stresi üç adet sensör görevi yapan protein tarafından algılanarak endoplazma retikulumunda yapım veya yıkım ile ilişkili yolakları aktifleştirmektedir. Parkinson hastalığındaki bozukluk görülen bir başka moleküler mekanizma ise bozulmuş olan otofajidir. Otofaji bir hücre ölümü olmasının yanı sıra hasarlı organel, yanlış katlanmış protein gibi yapıları temizleyerek hücrede kurtarıcı bir görev üstlenmektedir. Tüm bu bilgilerden yola çıkarak MPP+ toksini ile H4 insan nöroglioma hücreleri ile oluşturulmuş Parkinson hastalığı modelinde ATG5 aracılı otofajiyi indükleyen Fluspirilenin, hücrelerdeki endoplazma retikulumu stresi sensörlerinden biri olan IRE1 üzerine etkisinin araştırılması için gözlemsel tanımlayıcı bir çalışma planlandı. Oluşturulan Parkinson hastalığı modelinde otofajinin hücre canlılığına olan etkisi MTT testi ile belirlendi. Hastalıkta bozulan otofajinin ATG5 aracılı otofaji aktivasyonu ile geri döndürüldüğü LC3B immünositokimyası ile gösterildi. Endoplazma retikulumu stresini belirlemek için yapılan pIRE1 immünişaretlemesinde, pIRE1 immünoreaktivitesi ELİSA yöntemi ile ölçülen total IRE1 seviyesi ile standardize edildiğinde ER stresinin arttığı saptandı. ER-Tracker boyaması ile endoplazma retikulumunun yapısının Parkinson hastalığı modelinde bozulduğu ve otofaji ile geri döndürüldüğü saptandı. Bu çalışma ile MPP+ toksin aracılı Parkinson hastalığı modelinde ATG5 aracılı otofaji ile IRE1 bağımlı endoplazma retikulumu stresi arasındaki ilişki ilk defa gösterildi.
Enerji stresinde granüloza hücrelerinin ace2ifadelenmesinin sırt1 ile ilişkisinindeğerlendirilmesi
Hücrede enerji stresi artan enerji ihtiyacı ve azalan enerji kaynağı ile ortaya çıkar, bu nedenle enerji stresi hücredeki metabolizmayı etkileyen bir durumdur. Hücresel enerji homeostazisinin temel düzenleyicisi olan adenozin monofosfat ile aktifleşen protein kinaz (AMPK), çeşitli fizyolojik süreçlerin düzenlenmesi için sınırlı enerji durumunda aktive olur. AMPK artışına yanıt olarak SIRT1, enerji metabolizması ve stres yanıtı gibi hücresel süreçleri modüle eder. İnsan granüloza hücresinde eksprese olan ACE2 steroidogenez, foliküler gelişim, granuloza-lutein hücre apoptozu, foliküler atrezi, oosit maturasyonu ve ovulasyonda etkin rol oynar. ACE2 seviyeleri, hücrede enerji stresi ile bağlantılıdır. Hücreler, yaşamlarını devam ettirebilmek için enerji kaynağı olan ATP üretimini %88 mitokondriyal oksidasyondan sağlar. Granüloza hücreleri; ovaryal siklusta foliküler gelişimde rol alan kritik öneme sahip hücrelerdir ve bu hücrelerin metabolizmasındaki değişim fertilite için önemlidir. Tüm bu bilgilerden yola çıkarak AICAR uygulaması ile AMPK aktivasyonu üzerinden enerji stresi oluşturarak granüloza hücrelerinde ACE2 ifadesinin SIRT1 ile ilişkisinin araştırılması için gözlemsel tanımlayıcı bir çalışma planlandı. HGL5 insan granüloza hücre hattında, hücre enerji stresinde mitokondriyal membran potansiyelinin azaldığı, SIRT1 inhibisyonu sonrasında da bu hasarın daha da şiddetlendiği bulundu. Enerji stresi modeli oluşturulduktan sonra HGL5 granüloza hücrelerinde, primer hücre kültürü yapılan sağlıklı ve PKOS grubu granüloza hücrelerinde SIRT1'in immünfloresan işaretleme ile istatistiksel olarak arttığı bulundu. AOR grubunda ise stres ile SIRT1'in kontrol grubuna göre azaldığı saptandı. SIRT1 inhibisyonu sonrası ACE2 ifadelenmesinin AOR grubu dışında bütün gruplarda arttığı saptandı. Çalışmamızda ilk defa granüloza hücresinde SIRT1 ve ACE2 arasında AMPK yolağı üzerinden ilişki olabileceği gösterildi
Endometrial stromal hücrelerde ovaryan hormonlar ile CKAP4 ilişkisinin incelenmesi
Endometrial stromal hücreler menstrüel siklus ve desidualizasyonda ovaryan hormonların etkisi ile değişikliklere uğramaktadır. Bu süreçlerdeki aksaklıklar; infertilite, tekrarlayan gebelik kayıpları, preeklampsi gibi klinik sonuçlarla karşımıza çıkabilmektedir. CKAP4'ün endometrial stromal hücrelerde varlığı bilinmekle birlikte; ovaryan hormon değişikliklerine verilen CKAP4 ekspresyon yanıtı ve desidualizasyon ile ilişkisi bilinmemektedir. Bu amaçla steroid hormonlar (Medroksiprogesteron asetat (MPA) ve 17-β-östradiol (E2)) ve/veya cAMP ile uyarılan ve uyarılmayan stromal hücreler 6 grup (kontrol, E2, MPA, cAMP, E2+MPA, E2+MPA+cAMP) oluşturularak 3, 6 ve 9 gün sonunda PRL düzeyi ELISA, CKAP4 immün reaktivitesi akım sitometri, sito-ELISA ve immünofloresan yöntemleri ile gösterilmiş; CKAP4 ve PCNA ekspresyonu western blot yöntemi ile kantitatif olarak belirlenmiştir. CKAP4'ün endometrial stromal hücrelerde hücre membranı, sitoplazma ve çekirdekte varlığı gösterilmiştir. E2 uygulaması CKAP4'ü sitoplazmada artırırken; MPA ve E2+MPA gruplarında sitoplazmada 6. günde pik 9. günde gerileme gözlenmiştir. Desidualizasyon oluşturulan gruplarda (cAMP, E2+MPA+cAMP) hem sitoplazmada hem de hücre membranında arttığı saptanan CKAP4 ekspresyonu, desidualizasyon ile sitoplazmada CKAP4 sentezinin ve hücre membranına transferinin arttığını göstermiştir. Sonuç olarak, CKAP4 ekspresyonunun steroid hormonlardan etkilendiği, desidualizasyonda CKAP4'ün arttığı gösterilmiştir.
Psöriasis, kutanöz lupus eritematozus ve liken skleroz histopatolojilerinde kannabinoid 1 reseptörü (CB1) ve N-arachidonoylethanolamine (AEA)'nın yapım ve yıkım enzimlerinin varlığının araştırılması
Enzimleri, ligandları ve reseptörleri ile birçok görevi olan endokannabinoid sistemine ait ilk keşfedilen reseptör CB1r, en çok çalışılan ligand ise N- arakidonoiletanolamin (AEA)'dir. N-açil-fosfatidiletanolamin-hidrolize fosfolipaz D (PLD) AEA'nın yapımında, yağ asidi amid hidrolaz (FAAH) ise yıkımında görev alan enzimlerden birisidir. Endokannabinoid sistemi deride inflamatuvar süreçleri yönetir; epidermiste keratinosit farklanmasını, apoptozunu, proliferasyonunu düzenler. Bu görevlerinden dolayı hiperkeratoz ile giden inflamatuvar deri hastalıklarında potansiyel bir hedef olduğu düşünülerek çalışmamızda; psöriasis, kutanöz lupus eritematozus (KLE) ve liken sklerozda (LS) endokannabinoid sisteminin etkisinin araştırılması ve endokannabinoid sistemi reseptörü CB1 ve ligandı AEA'nın yapım ve yıkım enzimleri olan fosfolipaz D ve FAAH'ın sağlıklı deri ile karşılaştırılması amaçlandı. Prospektif, basit randomize, kontrol grubu içeren gözlemsel bir çalışma gerçekleştirildi. CB1r, FAAH ve PLD reaktiviteleri ve epidermisteki lokalizasyonları immünhistokimyasal olarak incelenerek kontrol grubu ile karşılaştırıldı. İnflamasyon belirteci olarak TNF-α düzeyleri ELISA ile ölçüldü. Hastalık gruplarındaki CB1r, FAAH ve PLD dağılımının ve immün reaktivitesinin kontrol grubuna göre farklılık gösterdiği saptandı. Bu çalışma ile psöriasisin tipik bulgusu olan rete kenarlarının uzamasında CB1r'nin kaybının etkisi olduğu ve KLE ile LS patofizyolojilerinde endokannabinoid sistemi bozukluğu olduğu ilk defa gösterildi.
Ekstrakorporeal dolaşım (ECD) ile kan hücrelerindeki morfolojik değişikliklerin periferik yayma ile ışık mikroskobunda değerlendirilmesi
Çalışmamıza Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Dursun Odabaş Tıp Merkezi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu'nun 13/02/2019 tarihli ve Karar No: 07 onayı (bkz. Ek 1) alındıktan sonra başlanmıştır. Çalışmamıza katılan her hasta için Bilgilendirilmiş Gönüllü Onam Formu imzalatıldıktan sonra başlanmıştır. Bu çalışmada ekstrakorporeal dolaşım ile kan hücrelerindeki morfolojik değişikliklerin periferik yayma ile ışık mikroskobunda incelenmesi amaçlandı. Bunun için Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Dursun Odabaş Tıp Merkezi Kalp Damar Cerrahisi Polikliniğinde tanı alan ve takibi Kalp Damar Cerrahisi Servisinde yapılan olgularda yaş sınırı olmayan kardiyopulmoner baypas hastaları üzerinde yapıldı. Koroner damar hastalığı, koroner damar tıkanıklığı ve hasarı, kalp kapağı replesmanı, aort diseksiyonu tanısı almış, cerrahi müdahele gereken hastalar çalışmaya dahil edildi. Kronik böbrek yetmezliği, gebelik, hematolojik kan hastalığı olan ve hematolojik reaksiyon gösterebilen hasta grubu araştırmaya dahil edilmedi. Kardiyopulmoner baypas cerrahisi kararı alınan hastaların her birinden servise yatışı olduktan hemen sonra, Extrakorporeal Dolaşıma girip yoğun bakıma alındığı ilk saatte ve taburcu edileceği günde olmak üzere üç kez periferik yayma yapıldı ve kan hücrelerinin bütünündeki iyileşme süreci değerlendirildi. Ameliyat süresinin, kros klemp süresinin, eritrosit süspansiyonu miktarının, taze donmuş plazma miktarının, vaka çeşidinin, hemofiltrasyonun, ejeksiyon fraksiyon değerinin kanın şekilli elemanlarındaki etkileri incelendi. Periferik yayma değerleri ışık mikroskobunda, hemogramda ise Hb, Hct, Wbc değerleri karşılaştırıldı. Dünya Sağlık Örgütü kriterlerine uygun olarak analizleri yapıldı. İstatistiksel olarak belirgin farklılıklar gözlendi ve sonuçlar literatür ışığında tartışıldı.
Resveratrolün sıçan hipokampus sinaptik plastisitesi üzerindeki etkilerinin immunohistokimyasal ve stereolojik yöntemlerle değerlendirilmesi
Çalışmamıza Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu'nun onayı alındıktan sonra başlandı. Bu amaç için nöroprotektif madde olan resveratrol'un sinaps ve nöron sayısal yoğunluğuna ait etkileri stereolojik ve immunohistokimyasal olarak incelendi. Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Deneysel Tıp Uygulama ve Araştırma Merkezinde yapılan çalışmada Wistar-Albino türü, her grupta altı adet olmak üzere iki grupta on iki erkek sıçan kullanıldı. Birinci gruba günde bir kez serum fizyolojik içinde çözünen resveratrol (20mg/kg/gün) oral yolla gavaj ile verildi, ikinci grup ise kontrol grubu olarak tek başına SF gavaj ile verildi. Bir haftanın sonunda sıçanlar anestezi altında kafatasları açılarak çıkarılan beyin dokular %30'lik sükroz solusyonu içerisinde bir gün boyunca ve %20'luk sükroz içerisinde dokular dibe çökene kadar beklendi. Ardından dokular kriyomatriks içerisine gömülerek çalısma ısısı -20 0C ayarlanmış frozende ortalama 4µm kalınlıkta ardışık kesitleri lamlara alındı. Sıçanlardan her 400 µm aralıkta sistematik rastgele örnekleme ile iki seri ve her biri ortalama beş çift kesit içeren preparatlar hazırlandı. Hematoksilen eozin ile boyama işlemi yapıldı. Disektör sayım işlemine uygun tarafsız sayım çerçevesi kullanıldı. Fiziksel disektor yöntemi ile nöron sayımında sayısal yoğunluk hesaplandı. İmmunohistokimyasal olarak sinaptofizin ile sinaps işaretleyici kullanıldı. Preparatlar fotoğraflandı ve şık mikroskopik olarak değerlendirildi. Gruplar arası karşılaştırılmalarında istatistik programı olarak Mann-Whitney U testi kullanıldı. Sinaptofizin immunohistokimyasal reaksiyon kontrol grubuna göre göreceli olarak koyu boyandığı gözlendi. Granüler nöron sayısı bakımından gruplararası istatistiksel bir fark gözlenmedi (P>0.05). Elde edilen sonuçlar literatür ışığında tartışıldı.
Epigallokateşin gallatın diyabetik nöropatik ağrı modelinde siyatik sinir üzerine etkisi: TRPV1 kanalının rolü
Diyabetik nöropatik ağrı (DNP), diyabet hastalığının önemli bir komplikasyondur. Epigallokateşin Gallat (EGCG) anti-oksidan, anti-inflamatuar, anti-kanserojen, nörodejenerasyonu önleyici, diyabet riskini azaltma özelliği olduğu çalışmalarda bildirilmiştir. Yaptığımız literatür araştırmasında, streptozotosin (STZ) kaynaklı DNP modelinde siyatik sinir hasarı oluşum sürecinde TRPV1 kanalının rolü üzerine EGCG'nin etkisi hakkında bir çalışmaya rastlanılmamıştır. DNP modelinde EGCG'nin tedavi edici özeliğinin olup olmadığını araştırmak amacıyla sıçanlar 4 gruba ayrıldı (n=7); Kontrol, EGCG, DNP, DNP+EGCG. Çalışmanın ilk gün (0.gün) DNP ve DNP+EGCG gruplarına STZ (45 mg/kg intraperitoneal) uygulandı. Araştırmanın 3. gününde tüm grupların kan şekeri düzeyleri ölçüldü. DNP ve DNP+EGCG gruplarındaki sıçanlarda diyabet oluştuğu kanıtlandı. Sonrasında EGCG, DNP+EGCG gruplarına 14 gün boyunca günde 20/mg/kg/gün intragastrik olarak EGCG verildi. Araştırma boyunca (0., 3., 8., 14., 17. günler) grupların ortalama ağırlık değişimi, ortalama kan şeker düzeyleri ölçümü, sıcak plaka ve kuyruk daldırma testleri yapıldı. Çalışma sonunda siyatik sinir örnekleri, Stereolojik, histopatolojik ve immünohistokimya (İHK) yöntemleri ile analiz edildi. Elde edilen verilere dayanarak; kontrol ve EGCG grupları ile kıyaslandığında DNP grubunda, sıcak plaka, kuyruk daldırma test sürelerinin anlamlı şekilde kısaldığı gözlemlendi. DNP+EGCG sıcak plaka, kuyruk daldırma test sürelerinin grubuna göre daha uzun sürdüğü tespit edildi. Hematoksilen-Eozin ve Toluidin Mavisi boyaları kullanılarak yapılan analizler sonucunda, kontrol, EGCG gruplarındaki siyatik sinirler normal histolojik yapıda gözlenirken, DNP grubunda aksonal dejenerasyon tespit edildi. DNP+EGCG, DNP kıyasla aksonlarda daha az bozulma, olduğu tespit edildi. İHK bulgular değerlendirildiğinde, DNP grubunda yoğun TRPV1 ve İNOS ekspresyonu görülürken, Kontrol, EGCG, DNP+EGCG gruplarında düşük TRPV1 ve İNOS ekspresyonu gözlendi. Stereolojik analiz sonucunda gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı. Çalışma sonuçları, EGCG tedavisi streptozotosin ile oluşturulan DNP modelinde hasara neden olan mekanizmaları inhibe ederek ağrı toleransını modüle edebileceği, kan glukoz düzeyini dengeleyebileceği, siyatik sinirdeki bozulmayı hafifletebileceği, artan TRPV1 ve İNOS ifadelerini düşürebileceğini gösterdi. Bu da EGCG'nin DNP'ye karşı potansiyel bir tedavi ajanı olabileceğini ortaya koydu.
Deneysel psöriazis modelinde bergenin ve mezenkimal kök hücrelerin kombine terapötik etkinliklerinin araştırılması
Psöriazis, keratinosit ve immün hücre etkileşimleri sonucu epidermal hiperplazi ve inflamasyona neden olan kronik inflamatuvar bir otoimmün hastalıktır. Mevcut tedaviler semptomları hafifletse de uzun süreli kullanımda ciddi yan etkilere yol açabilmektedir. NLRP3 inflamazom aktivasyonu ve Nrf2/KEAP1/SIRT1 sinyal bozukluklarının psöriazis şiddetini artırması, yeni anti-inflamatuvar ve immunsüpresör tedavilere olan ihtiyacı doğurmuştur. Sunulan çalışmada, anti-inflamatuvar etkili bergenin (BER) ve immünosüpresif özellikteki mezenkimal kök hücrelerin (MZKH) kombinasyonuyla translasyonel bir tedavi stratejisi hedeflenmiştir. Çalışmada imiquimod (IMQ) ile indüklenen psöriazis fare modelinde, BER ve MZKH'lerin kombine uygulamasının, NLRP3 inflamazomu ile Nrf2/Keap1/SIRT1 ekseni üzerindeki terapötik potansiyelinin aydınlatılması amaçlandı. 48 adet BALB/c fare: Kontrol, Serum Fizyolojik+Vazelin (SF+VAZ), BER, MZKH, IMQ, IMQ+BER, IMQ+MZKH ve Kombine olmak üzere sekiz gruba ayrıldı. Farelerin sırt ve kulak derilerine yedi gün boyunca IMQ uygulamasıyla psöriazis modeli oluşturulduktan sonra psöriazis şiddeti ve yaygınlığı PAŞİ skoruyla, deri ve dalak dokularındaki değişiklikler histopatolojik analizlerle, epidermis/dermisteki hacim yoğunlukları ise stereolojik yöntemlerle belirlendi. İmmünohistokimya ile Ki-67, NLRP3 inflamazom bileşenleri, Nrf2, Keap1 ve SIRT1'in immünoreaktif yoğunlukları ImageJ ile değerlendirildi. Serum örneklerinde TNF-a, IL-1β, IL-17A, IL-6, IL-22 ve IL-23 seviyeleri ELISA ile ölçüldü. Veriler, IMQ grubuna kıyasla BER, MZKH ve kombine tedavilerin; i) PAŞİ skoru ve epidermal kalınlığı azalttığını, ii) hiper/parakeratozis ve Munro mikroapse oluşumlarını hafiflettiğini, iii) dermal immün hücre infiltrasyonunu ve vaskülarizasyonu azalttığını, iv) epidermal/dermal hacim yoğunluğunu düşürdüğünü ve v) dalaktaki splenomegali, ektstrameduller hematopezi ve beyaz pulpa artışını önemli ölçüde azalttığını göstermiştir. BER, MZKH ve kombine uygulamaların Ki-67, NLRP3, ASC, Kaspaz-1, IL-1β ve Nrf2, Keap1'in immünreaktivite yoğunluğu ile psöriazis ile ilişkili sitokin seviyeleri anlamlı derecede azalttığı ve SIRT1 ifade seviyelerini IMQ grubuna kıyasla önemli ölçüde arttırdığı tespit edildi. Sonuçlarımız, BER, MZKH ve kombine tedavilerin; NLRP3 inflamazom aktivasyonunu baskıladığını, KEAP1/NRF2 sinyal yolunu modüle ettiğini ve SIRT1 aktivasyonunu artırarak psöriazis patogenezini hafiflettiğini göstermektedir. Bulgular, BER'in anti-psöriatik etkilerinin, MZKH'lerin immünmodülatör özellikleriyle birleşerek psöriazis tedavisinde potansiyel bir terapötik ajan olabileceğini ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Bergenin, Mezenkimal Kök Hücre, NLRP3 inflamazomu, Nrf2/Keap1/SIRT1 aksı,Psöriazis
Allojenik mezenkimal kök hücre eksozomlarının üç boyutlu mikroakışkan proksimal tübül platformundaki iskemik akut böbrek hasarında terapötik etkilerinin değerlendirilmesi
Sefa Burak Çam, Allojenik Mezenkimal Kök Hücre Eksozomlarının Üç Boyutlu Mikroakışkan Proksimal Tübül Platformundaki İskemik Akut Böbrek Hasarında Terapötik Etkilerinin Değerlendirilmesi, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Tıpta Uzmanlık Tezi, Ankara, 2022. Yüksek kronikleşme riski ve mortaliteli iskemik akut böbrek hasarında (ABH) hücresel tedavilerin kliniğe aktarılabilmesi için gerçek zamanlı kişiselleştirilmiş modeller gerekmektedir. İnsan kemik iliği mezenkimal kök hücre (Kİ-MKH) eksozomlarının hipoksik proksimal tübül epiteli (PTE) hasarındaki terapötik etkinliği üç boyutlu (3B) dinamik mikroakışkan platformunda ortaya konabilir. Akut hipoksik mikroakışkan düzeneğindeki insan PTE hücrelerinde, ZO-1 ve asetillenmiş α-tübülin immünreaktivitesi, dekstran geçirgenliği, proliferasyon hızı, BNIP3, HO-1, HIF1α, GLUT1 ve GLUT2 gen ifadesi ölçülmüş; proliferatif tedavi penceresi belirlenen insan Kİ-MKH eksozomlarının ED50'de hipoksik hasardaki etkinliği 3B mikroakışkan platformuna uygulanarak değerlendirilmiştir. Mikroakışkan yongası akut hipoksiye bağlı PTE hasarı için optimize edilmiş; karakterize allojenik Kİ-MKH eksozomlarının gerçek zamanlı tedavi penceresi 172.582 µg/ml ve 0-26 saat olarak belirlenmiş; eksozomlar ED50'de mikroakışkan yongasında 24. saatte akut hipokside bozulan bariyer bütünlüğünü düzeltmiş, ZO-1 işaretlenmesini arttırmış, PTE hücrelerini çoğaltmış, BNIP3 ifadesini azaltmış; HO-1, HIF1α, GLUT1 ve GLUT2 ifadelerini artırmıştır. Tez kapsamında optimize edilen hipoksik 3B mikroakışkan PTE platformunda allojenik Kİ-MKH eksozomlarının tedavi penceresindeki etkinliği yapı ve işlev açısından ortaya konmuştur. Yeni ex vivo sistem, nefroloji kliniğinde uygulanacak kişiselleştirilmiş teragnostik adayları doğruladığı için önemlidir.
Primer siliyer diskinezi (PCD) hastalarında dış dynein kolu (ODA) defektleri ile silyum ön yapım proteinlerinin ilişkisinin histolojik olarak araştırılması
Primer siliyer diskinezi (PCD) hastalarında dış dynein kolu (ODA) defektleri ile silyum ön yapım proteinlerinin ilişkisinin histolojik olarak araştırılması, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Uzmanlık Tezi, Ankara, 2022. Primer siliyer diskinezi (PCD), nadir ve otozomal resesif geçişli, sinopulmoner enfeksiyonlar ile karakterize ve motil silyum/flagellumun defektine bağlı oluşan bir hastalıktır. Aksonem yapısında mikrotübül düzenlenmesine sahip olan silyumun içerdiği yapısal proteinlerin PCD'li bireylerin genetik heterojenitesine bağlı olarak defektleri gözlenmektedir. Zinc finger MYND domain-containing protein 10 (ZMYND10); dış dynein kolu (ODA) ve siliyer yapı elementlerinin ön yapımında görevli olan proteindir. GRP78 moleküler bir şaperon olarak çalışmaktır. Bu araştırmaya, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Göğüs Hastalıkları Bölümü'nde klinik ve genetik olarak PCD ön tanısı (ODA defekti) almış yaşları 14-23 olan 8 adet hasta birey dahil edilmiştir. Hastaların nazal sürüntü örnekleri DNAH5-asetile beta tübülin, RSPH9-ZMYND10 ve RSPH9-GRP78 antikorları ile çift işaretleme yapılmıştır ve floresan mikroskopta değerlendirmeler yapılmıştır. İmmünofloresan işaretlemelerinde DNAH5 mutasyonlu hastaların %75'inde; DNAH5 ve ZMYND10 floresan işaretlenmesi gözlenmemiştir. Kontrol ve hastaların DNAH5 ve ZMYND10 düzeltilmiş toplam hücre floresan (CTCF) ölçümlerinin ortalama değerleri arasında anlamlı fark bulunmuştur. Hastaların %63'ünde GRP78 floresan işaretlenmesi gözlenmemiştir ve kontrole göre anlamlı fark bulunmuştur. Bu bulgular sonucunda aynı DNAH5 geninde farklı mutasyona sahip ODA defekti olan hastaların; silyum ön yapımında görevli ZMYND10 ve şaperon proteini olan GRP78 proteinleri ile ilişkisinin olduğu kalitatif olarak gösterilmiştir.
İnsan over stromasında telosit hücre varlığının araştırılması
Telositler, oldukça yeni ve etkileyici bir interstisyel hücre türü olarak tanımlanmıştır. Önceden interstisyel Cajal benzeri hücreler (ICLC'ler) olarak bilinen bu hücreler artık literatürde son derece uzun ve ince telopodları sayesinde ayırt edilebilmektedirler. Bu hücreler bugüne kadar insan ve birçok farklı canlı türüne ait organda tanımlanmıştır. Telositler, dişi üreme sistemi organlarında da bulunmaktadır, ancak literatürde bugüne kadar telositlerin insan overlerindeki varlığını, lokalizasyonunu, rollerini veya morfolojik karakterizasyonunu açıklayan bir veriye rastlanmamıştır. Telositler hücreden hücreye sinyal gönderme, bağışıklık gözetimi, doku morfogenezi ve homeostazinin düzenlenmesinde, ayrıca çeşitli patolojilerde hatta tümörojenezde önemli roller oynadıkları gösterilmiştir. Telositler farklı belirteçler eksprese veya ko-eksprese edebilirler fakat, genel olarak CD34, vimentin ve PDGRF-β, c-kit ve α-SMA güvenilir telosit belirteçleri olarak kabul edilmişlerdir. Çalışmalar, insan overinde birden fazla stromal hücre kümesinin varlığı doğrulanmıştır, ancak stromal hücre tür ve karakterlerini kapsamlı ve eksiksiz olarak gösteren çalışmalar yetersizdir. Bu sebeple, telositlerin insan over stromasında mevcut olup olmadığını değerlendirmenin, overlerindeki henüz tam olarak tanımlanamamış stromal hücrelerin anlaşılması için kritiktir. Bu çalışmada, Total Histerektomi ve Bilateral Salpingo-Ooferektomi (THBSO) ameliyatı geçirmiş, 18-65 yaş arası, çeşitli rahim hastalıkları nedeniyle hastaneye başvuran ve kemoterapi almamış kadınlardan alınan dokular incelenmiştir. Over dokuları immünhistokimyasal ve immünfloresan analizleri ileCD34/c-kit, CD34/vimentin, CD34/PDGFR-β ve CD34/α-SMA ile işaretlendi ve telositler, fibroblast ve perisitlerden ayrılarak tamamen farklı hücreler olarak tanımlandı. Ayrıca geçirimli elektron mikroskobu ve immünogold yöntemi ile CD34 ile şaretlenen bu hücrelerin ultra yapıları incelendi ve tipik morfolojileri göz önüne alındığında insan overindeki varlıkları doğrulandı. Bu bağlamda çalışmamızın sonuçlarının, gelecekte over morfolojisine dair olan çalışmalara ışık tutacağı ve over patolojilerinin mekanizmalarının daha iyi anlaşılması için yol gösterici olacağı kanaatindeyiz.
Metforminin osteosarkom hücreleri üzerindeki anti-tümöral etkilerinin In-Vitro olarak incelenmesi
Tip 2 diabetes mellitus (DM-II) tedavisinde kullanılan metformin, son yıllarda adjuvan ve neoadjuvan kemoterapi protokollerinin etkinliğini artırıcı anti-tümöral özelliğiyle öne çıkmıştır. Metforminin bu etkilerinin farklı mekanizmalar üzerinden gerçekleştiğini bildiren çalışmalar bulunmaktadır, bunlardan biri de mTORC1 sinyal yoludur. Genelde agresif seyir izleyen osteosarkom vakalarının tedavisinde çoklu kemoterapi protokolleri uygulanmaktadır. Çalışmamızda doksorubisin ve sisplatin kullanımına eklenen metforminin MG-63 osteosarkom hücrelerindeki anti-tümöral etkileri incelenmiştir. Metformin, doksorubisin ve sisplatin ile tekli, ikili ve üçlü kombinasyonlarda doz ve zaman tayini için hücre sayımı ve MTT analizleri gerçekleştirildi. Deney gruplarındaki MG-63 osteosarkom hücrelerinin anti-tümöral tedaviye yanıt olarak değişen alkalen fosfotaz (ALP) aktiviteleri ölçüldü, migrasyon yetenekleri yara iyileşme (migrasyon) analizi ile, mTORC1 seviyeleri immünositokimyasal boyama ile, ultrastrüktürel yapılardaki değişimler ise geçirimli elektron mikroskobu ile incelendi. Doz ve zaman belirleme deneyleri sonucunda, etkin dozlar metformin 10 mM, sisplatin 2.5 µM, doksorubisin 1.5 µM olarak, etkin süre ise 48 saat olarak belirlendi. Metforminin tek başına ve üçlü kombinasyonda MG-63 hücre migrasyonunu anlamlı düzeyde inhibe ettiği tespit edildi. Metforminin, doksorubisin ve sisplatinle üçlü uygulandığı deney grubunda ise hem ALP seviyelerinde, hem de mTORC1 seviyelerinde azalma saptandı. Ultrastrüktürel incelemede deney gruplarında aşırı genişlemiş GER yapıları, mitokondriyal hasar ve lipit vakuolleri gözlemlendi. Çalışmamız, metforminin, doksorubisin ve sisplatin ile kombine uygulanmasının MG-63 hücrelerinde in-vitro olarak anti-tümöral etkinliği artırdığını ve osteosarkom tedavisinde özellikle metastazın önlenmesi açısından klinik önemi olabileceği sonucuna varmıştır.
İnsan infrapatellar yağ yastıkçığındaki telosit hücrelerininvarlığının histolojik yöntemler kullanılarak araştırılması
Telositler, mezenkimal kök hücreler gibi davranabilen ve şimdiye kadar tanımlanan projenitör hücreler ile yakın komşulukta olan ve hatta benzer hücre yüzey belirteçleri ekspresse eden yeni bir hücre türü olarak tanımlanmıştır. Telositler önceleri interstisyel Cajal benzeri hücreler (ICLʼler) olarak bilinseler de artık moniliform görünümleri, uzun ve ince telopodları sayesinde onlardan ayırt edilebilmektedirler. Telositler yaygın olarak kemiklerde, iskelet kaslarında, fasyada ve eklem sinoviyumlarında bulunmakla birlikte birçok farklı canlı türüne ait doku ve organlarda da tanımlanmıştır. Bu yeni hücreler, infrapatellar yağ yastıkçığında (İPYY) da bulunmaktadır, ancak literatürde bugüne kadar telositlerin İPYYʼdaki varlığını, lokalizasyonunu, rollerini veya morfolojik karakterizasyonunu açıklayan bir veriye rastlanmamıştır. Telositlerin hücreler arası sinyalleşme, morfogenez ve hemoztazın düzenlenmesinde, ayrıca çeşitli patolojilerde önemli roller oynadıkları gösterilmiştir. Genel olarak CD34, vimentin, PDGRF-α ve -β, c-kit ve α-SMA güvenilir telosit belirteçleri olarak kabul edilmişlerdir. Bu çalışmada, insan diz bölgesinde yer alan İPYYʼdan elde edilecek olan doku örnekleri, travma veya osteoartrit tanısı gibi çeşitli sebeplerle diz protezi ameliyatı olan 10 hastadan operasyon sırasında alındı. İPYY dokuları immünhistokimyasal analizler ile CD34/c-kit, CD34/PDGFR-α ve CD34/PDGFR-ß ikili boyama yöntemleri ile işaretlendi. Bu şekilde telositler, fibroblast ve perisitlerden ayrılarak tamamen farklı hücreler olarak tanımlandı. Eş zamanlı olarak bu hücrelerin ultra yapıları geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile inceledi. Bu tez çalışmasında, insan İPYYʼnda telosit hücre varlığının ilk defa gösterilmesi, İPYYʼın iyi bir telosit hücre kaynağı olabileceğini de ortaya koymaktadır. Bu nedenle çalışmamızın, telosit hücre izolasyonu, karekterizasyonu ve terapötik etkinliklerini araştıran ileri çalışmalara önemli bir rehber olabileceğini ve çeşitli eklem hastalıklarına hücresel tedavi temelli yeni yaklaşımlara ışık tutabileceğini düşünmekteyiz..
Hedeflendirilmiş ilaç yüklü nanopartiküllerin glioblastoma üzerine olan etkilerinin incelenmesi
Oldukça agresif bir primer beyin kanseri olan glioblastomanın güncel tedavisi radyoterapi ve temozolomid (TMZ) ile yapılmaktadır. Ancak TMZ'ye direnç gelişmesi, kanserin tekrarlaması ve mortalite oranının yüksek olmasından dolayı yeni tedavilere ihtiyaç vardır. Bu kapsamda nanopartiküller (NP'ler) yeni tedavi seçenekleri sunabilir. Bu çalışmada TMZ yüklü insan serum albumin (HSA) NP'leri (TMZ&NP) sentezlendi. Glioblastomaya hedeflendirilmek için NP'ler, folik asit (FA), transferin (Tf) ya da aterosklerotik plak (AP) ligandları ile konjuge edildi. NP'lerin etkinliği in vitro ve in vivo olarak glioblastomada araştırıldı. TMZ&NP'ler liganda bağlı olarak C6 glioma hücrelerinde yüksek sitotoksisiteye sebep oldu. TMZ, TMZ&NP ve TMZ&NP-FA C6 sfereoid çaplarının büyümesini engelledi. TMZ, TMZ&NP ve TMZ&NP-AP sfereoidlerde aktif kaspaz-3+ hücrelerini arttırdı. Ortotopik sıçan glioblastoma modelinde TMZ&NP formülasyonlarının Glioma gruplarında vücut artış hızına olumlu etkisi görüldü. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) analizlerine göre TMZ, TMZ&NP, TMZ&NP-FA, TMZ&NP-Tf ve kombine tedavileri tümör boyutunu azalttı. Relatif serebral kan akımı (rCBF); TMZ&NP, TMZ&NP-Tf ve TMZ&NP-AP uygulamaları ile azaldı. Tümördeki hücresel hasar TMZ&NP-FA, TMZ&NP-AP ve kombine NP tedavileri ile arttı. Peritümöral alandaki damar sayısı TMZ&NP-FA ve TMZ&NP-Tf uygulamaları ile azaldı. TMZ&NP, TMZ&NP-FA ve TMZ&NP-Tf tümörün merkezindeki VEGF+ hücreleri azalttı. Ultrastrüktürel analizler NP'lerin neokorteks, hipokampüs, korpus kallozum ve tümör dokularında nöronlar, glia hücreleri, aksonlar, tümör hücreleri ve kan beyin bariyeri (KBB) ile ilişkili yapılara internalize olduklarını kanıtladı. Sonuç olarak bu çalışma aktif hedefleme sistemlerinin önemini vurgulamakta ve NP formülasyonlarının glioblastoma tedavisinde işlevsel bir araç olabileceğini göstermektedir. Bu sistemler insan glioblastoma modellerinde araştırılarak güvenirlikleri ve etkinlikleri ileri düzeyde araştırılmalıdır.
Preeklampsi modeli oluşturulmuş trofoblastlarda GRP75 inhibisyonunun hücre stresi üzerine etkisi
Preeklampsi (PE), ekstravilloz trofoblastlarin (EVT'nin) uterus spiral arterlerine doğru yetersiz invazyonu ile sonuçlanan uteroplasental vasküler disfonksiyon ile karakterize bir hastalıktır. Bu durumda meydana gelen aralıklı arteriyel kan akışı, tekrarlanan iskemi/reperfüzyon ataklarına yol açar. Bunun sonucunda meydana gelen hipoksiye bağlı oksidatif stres gelişir. Hipoksiye bağlı oksidatif stres, plasenta dokusunda ve trofoblast hücre hatlarında mitokondriyal reaktif oksijen türevlerini (mtROS'u) arttırdığı ve mitokondriyal disfonksiyona sebep olduğu bilinmektedir. Ca2+, mitokondri ile ilişkili endoplazmik retikulum (ER) membranları (MAM) aracılığıyla ER'den mitokondriye aktarılır. Ca2+, normalde mitokondriyal oksidatif fosforilasyon için gerekli olsa da aşırı yüklenmesi bu süreci bozar ve daha fazla ROS üretimini tetikleyerek hem mitokondri de hem de ER'de disfonksiyona sebep olur: hücre ölümü tetiklenir. Bu tez çalışmasında, PE modelini taklit etmek için oluşturulacak hipoksiye bağlı oksidatif stres ortamında, trofoblastlardaki Ca2+ transferinin engellenmesi ile hücre canlılığını ve trofoblast invazyonunu arttırarak PE'ye olası bir terapötik yaklaşım geliştirilmesi amaçlandı. Bu doğrultuda, MAM'da bir 'moleküler köprü' olarak görev yapan Glikoz Düzenlenmiş Protein 75 (GRP75) protein ekspresyonun azaltılması yoluyla aşırı Ca2+ transferinin engellenmesi hedeflendi. Projemizde JAR trofoblast hücre hattı kullanıldı. Hücrelere, PE benzeri in vitro hipoksiye bağlı oksidatif stres ortamı oluşturmak için hidrojen peroksit (H2O2), GRP75 ekspresyonun azaltılması için de kimyasal ajan (MKT077) uygulandı. Böylece çalışmamızda 4 grubumuz yer almaktadır: (1) sham, (2) H2O2, (3) H2O2 + MKT077 ve (4) MKT077 grupları. Gruplarda uygulanacak en uygun H2O2 ve MKT077 dozlarının belirlenmesi için EC50 analizi yapılmışdı. MKT077'nin JAR trofoblast hücrelerine olan azaltıcı etkisini değerlendirmek için GRP75 protein ekspresyon seviyeleri, ER stresi belirteci olarak Glikoz düzenleyici protein 78 (GRP78) ve PE biyobelirteçi olarak da çözünür Fms-benzeri tirozin kinaz-1 (sFLT1) ekspresyon seviyeleri tmmünosttoktmyasal olarak analtz edtldt. Ayrıca bu kimyasalın JAR trofoblast hücrelerine olan etkisinin hücre canlılılıkları, hücre göçü ve hücre ölümü açısından analizleri yapıldı. Projemiz, GRP75'in trofoblast üzerindeki etkisini araştıran ilk çalışmadır. Bu çalışmadan elde edilen verilerin, PE'nin altında yatan mekanizmanın aydınlatılmasında ve olası terapötik yaklaşımların geliştirilmesinde etkili olacağı düşünülmektedir.
Oligoastenoterarozoaspermik kişilerde resveratrolün sperm mitokondri stresi üzerine etkileri
Oligostenoteratozoospermi, erkeklerde üreme sorunlarına yol açan, sperm sayısının (oligozoospermi), hareketliliğinin (astenozoospermi) ve morfolojik yapısının (teratozoospermi) bozulması ile karakterize bir durumdur. Bu hastalığın patogenezinde mitokondriyal disfonksiyon ve buna bağlı oksidatif stress önemli rol oynar. Mitokondriler, sperm hücrelerinin enerji merkezleridir ve hareketlilikleri ve dölleme yetenekleri açısından hayati öneme sahiptirler. Oksidatif stres spermdeki lipidlere, proteinlere ve DNA'ya zarar vererek doğurganlığın azalmasına neden olabilir. Son zamanlarda bu tip moleküler hasara karşı doğal maddelerin, özellikle antioksidan özelliğe sahip polifenollerin koruyucu etkileri üzerine yoğun araştırmalar yapılmaktadır. Bunlardan biri olan resveratrol, üzüm kabuklarında, ahudududa, yer fıstığında ve bazı bitkilerde bulunan doğal bir polifenol olup, güçlü antioksidan, antiinflamatuar, antiapoptotik ve hücre koruyucu etkileriyle biliniyor. Yapılan çalışmalar resveratrolün mitokondriyal fonksiyonu desteklediğini, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu azalttığını ve hücresel enerji dengesinin korunmasında önemli rol oynadığını göstermektedir. Bu tezin amacı oligostenoteratozoospermik bireylerde resveratrolün sperm mitokondriyal stres ve apoptosis üzerine etkisini araştırmaktır. Çalışma kapsamında oligostenoteratozoospermi tanısı konulan erkeklerden alınan sperm örnekleri laboratuvar koşullarında resveratrol eklenmiş solüsyon ile yıkandıktan sonra, mitokondriyal membran potansiyeli ve DNA hasarı, apoptosis ile sperm motilite ve morfoloji parametreleri çeşitli histolojik analiz yöntemleri kullanılarak değerlendirildi. Bu tez, resveratrolün erkek kısırlığının tedavisinde alternatif ve yardımcı bir ajan olarak kullanımının bilimsel temellerini inceleyerek, klinik pratikte doğal müdahale stratejilerinin geliştirilmesi için yeni yönler sunmaktadır. Bu araştırmanın sonuçları, yıkama solüsyonlarına resveratrol ilavesiyle spermlerde mitokondriyal aktiviteyi stabilize etmede ve enerji metabolizmasını normalleştirmede bir rol almadığı ortaya çıkarmıştır. Aynı zamanda Resveratrolün sperm yıkama solüsyonlarına ilave uygulamalarının doz bağımlı olarak değişebileceğinide ortaya koymuştur.
Improvement of germ stem cell pool by leptin supplementation and gene editing for male infertility
Infertility affects up to 12-15% of sexually active couples, and male factors contribute about 30-55% of these cases. Infertility can be caused by injuries, genetic factors, exposure to toxicants, immune-suppressive and anti-cancer treatments, but a large number are unexplained (idiopathic). Impairment of fertility is a major concern for the pediatric cancer survivors (PCSs). Freezing of testicular tissue containing spermatogonial stem cell (SSCs) is the only option to preserve the fertility. Sperm collection or culture of SSCs are not available in azoospermic patients with MCM8 gene disorders. For these infertile men, somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and differentiated into germ cells after correction of mutation via gene editing. Culture is critical to expand the number SSCs from small biopsies obtained from the testes of prepubertal patients prior to transplantation and to enable gene editing if SSCs or iPSCs for patients with genetic infertility. We tested the hypothesis that leptin supplementation may induce proliferation of neonatal mouse SSCs in vitro via ERK and/or STAT3 pathways. We also hypothesized that Mcm8 mutation may be corrected by CRISPR/Cas9 to produce gene edited primordial germ cells like cells (PGCLCs) that could be transplanted to restore fertility in Mcm8-/- infertile mouse. C57BL/6 neonatal SSCs were cultured and treated with leptin (0-200 ng/ml). 100 ng/ml leptin supplementation enhances proliferation SSC cultures via ERK and STAT3 pathways. Two novel Mcm8-/- mouse iPSC lines (591 and 574) were generated from Mcm8-/- mice fibroblasts. A validated Mcm8-/- iPSC (591-14) clone was gene-edited via CRISPR/Cas9 and identified with one Mcm8 allele corrected back to the wild type by DNA sequencing. Gene-corrected (Mcm8gc/-) clone 14 was differentiated to PGCLCs that exhibited a SSEA1+/CD61+ phenotype. These studies may allow the expansion of SSC pool, in vitro, prior to auto-transplantation to regenerate spermatogenesis in cancer survivors and correction of single gene mutation causing infertility by CRISPR/Cas9 tool in infertile male.
Parkinson hastalığı hücresel modelinde inflamasyonun ve inflamasyon sonrası uygulanan N-asetilsisteinin H4 hücrelerindeki LAG3 ve TLR2 reseptörleri üzerine etkisi
Parkinson hastalığı, bir çok sistemin etkilendiği nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın prevalansı genel popülasyonda binde 2-3, 55 yaş üzerinde ise %1 oranındadır. Parkinson hastalığındaki patolojik değişiklikler substantia nigra pars compacta'daki dopaminerjik nöronların kaybı ve hücrelerin içinde Lewy cisimciği olarak adlandırılan, ağırlıklı olarak alfa-sinüklein (α-syn) ve ubikutinlenmiş proteinler içeren küresel inklüzyon cisimciklerinin saptanması şeklindedir. α-syn proteinin nöronlarda hatalı katlanmalar sonucu hücre içinde çeşitli yerlerde birikebildiği gibi hücre dışı alana da geçebildiği bilinmektedir. Hücre dışı alana geçen α-syn proteini özellikle nöronlar ve glia hücreleri tarafından hücre içine endositoz yolu ile alınır. Endositozda TLR2 ve LAG3 reseptörlerinin rolünün açıklanabilmesi için çeşitli çalışmalar yapılmaktadır. α-syn proteininin endositozu, TNF-α, IL-1β, IL-2 ve IL-6 başta olmak üzere çeşitli inflamatuar sitokinlerin üretimine ve salınmasına sebep olmanın yanı sıra; hücre içinde mitokondriyal yolak üzerinden apoptoz ve mitofajiyi tetikleyerek hücre ölümünü yol açmaktadır. N-Asetilsistein (NAC), anti-oksidan, anti-inflamatuar ve anti-kanserojen etkilere sahip bir ilaçtır. Bu tez çalışmasında, inflamasyonun tetiklenmesi sonrası, LAG3 ve TLR2 reseptörlerinin ekspresyonunda artış görülebileceği ve inflamasyon NAC ile kontrol altına alındığında, inflamasyonun sebep olduğu hasarın azalması ve hücre canlılığında artış görülebileceği hipotezlerinde bulunuldu. Bu varsayımları test etmek amacı ile; in vitro koşullarda deney ve kontrol grupları içeren bir çalışma planlandı. α-syn proteinini aşırı eksprese eden insan nöroglioma (H4) hücre hattı kullanılarak inflamatuar bir Parkinson hastalığı modeli oluşturuldu. İnflamasyon, TNF-α ile tetiklendi ve NAC uygulanarak inflamasyon kontrol altına alındı. Çalışmada α-syn protein ekspresyonu ve transkripsiyonu, Western Blot ve q-PCR metotları ile ölçüldü. Hücre canlılığı Toxilight testi ile, apoptoz Western Blot tekniği ile apoptoz belirteçlerinin ölçülmesi ve TUNEL immunofloresan işaretleme metodu ile değerlendirildi. TLR2 ve LAG3 reseptörlerinin transkripsiyonları q-PCR metodu ile ölçüldü. Reseptörlerin protein düzeyleri immunofloresan işaretleme ve Western Blot tekniği ile saptandı. Elde edilen veriler ışığında, NAC tedavisinin, TLR2 ve LAG3 reseptörlerinin transkripsiyonunu ve ekspresyonunu değiştirerek inflamasyon aracılı toksisiteyi ve hücre ölümünü azalttığı belirlendi. Bu çalışma ile, NAC'nin Parkinson Hastalığında ortaya çıkan nöroinflamasyon süreci için umut vaat eden bir aday olduğu düşünüldü. Anahtar kelimeler: Parkinson Hastalığı, İnflamasyon, Alfa-sinüklein (α-syn), N-Asetilsistein (NAC), Apoptoz
FF-MAS oksisterolünün folikülogenezdeki rolünün ve hedgehog sinyal yolağıyla ilişkisinin incelenmesi
Folikül sıvısında bulunan ve oosit maturasyonunda etkili bir steroid türevi olan FF-MAS oksisterolünün etki mekanizmasıyla ilgili bilgiler sınırlıdır. Hedgehog yolağı (Hh); folikülogenezde kritik öneme sahip granüloza hücre proliferasyonunda etkili bir sinyal yolağıdır ve oosit matürasyonuna katkı sağlar. Hh yolağının hücrede etkisi, transkripsiyon faktörü Gli1'in aktifleşmesini ve hedef genlerin aktivasyonuyla gerçekleşir. Granüloza hücre proliferasyonundaki yetersizlik sebebiyle foliküler gelişimin ilerleyemediği, sonuçta kistik foliküllerin gözlendiği polikistik over sendromu (PKOS) en yaygın endokrin hastalıktır. Çalışmamızda folikülogenezde etkili FF-MAS Hedgehog yolağı aracılığıyla granüloza hücre proliferasyonunu uyarabileceği varsayılmıştır. Bu araştırmanın amacı insan folikülogenezinde, FF-MAS'in granüloza hücre proliferasyonuna etkisini Hedgehog yolağı molekülleri SMO ve Gli1 üzerinden araştırmaktır. Bunun için; sağlıklı ve PKOS hastalarına ait granüloza hücre kültürlerinde, FF-MAS ve yolak inhibitörü siklopaminin SMO ve Gli1 ifadelerine etkisi değerlendirilmiştir. SMO ve Gli1 immünohistokimya ifadeleri ve kantitatif sitoELİZA değerlendirmeleri ile FF-MAS'in bu ifadeleri artırdığı, yolak inhibitörü olan siklopamin uygulanan koşullarda da ifadelerin istatistiksel olarak anlamlı azaldığı saptanmıştır. Sağlıklı kadınlara ait granüloza hücrelerinin SMO ifade değişimi, yolağın son ürünü olan Gli1 ekspresyon değişiminden daha düşük oranda bulunmuştur. Bu sonuçlar, FF-MAS oksisterolünün Hedgehog yolağını kontrole oranla daha fazla aktive ettiğini göstermektedir. Ayrıca PKOS hastalarının hücreleri FF-MAS'e daha iyi cevap vererek Gli1 ve SMO ifadelerini artırmıştır. Bu veriler daha sonraki çalışmalarda FF-MAS - Hedgehog ilişkisinin in vivo olarak ele alınıp, diğer hücre yolaklarıyla da ilişkisinin değerlendirilmesi gerekmektedir.
İnsan granüloza hücresi mitokondriyon fonksiyonu ile AMH ve östrojen ilişkisi
Anti-Müllerian Hormon (AMH) ve östrojen, insan ovaryan folikülogenezinde esansiyel hormonlardır. AMH ve östrojeni, granüloza hücreleri üretmektedir. İnsan granüloza hücrelerindeki mitokondriyonların oosit kalitesi için önemli olduğu bilinmektedir. Çalışmamızın amacı granüloza hücresi mitokondriyon fonksiyonunun AMH ve östrojen üretimi ile ilişkisini ortaya koymaktır. Çalışmaya dahil edilen infertilite tedavisi gören yirmi kadının folikül sıvılarından granüloza hücreleri izole edilmiştir. Çalışmada insan granüloza hücre hattı HGL5, AMH ve östrojen düzeyleri normal olan hastalara ait granüloza hücreleri ve AMH ve östrojen düzeyleri düşük olan hastalara ait granüloza hücreleri kullanılmıştır. İmmunfloresan işaretleme (JC-1 katyonik boyası) ile granüloza hücresi mitokondriyonlarının membran potansiyeli ölçülmüştür ve mitokondriyonların morfolojik özellikleri elektron mikroskobu ile gösterilmiştir. İstatistiksel analiz için Kruskal Wallis ve Mann-Whitney U testi kullanılmıştır. İstatistiksel anlamlılık için toplam tip-1 hata düzeyi %5 olarak belirlenmiştir. İmmünfloresan işaretlemelerinde AMH ve östrojen değerleri normal olan kadınların granüloza hücrelerinin mitokondriyonlarının JC-1 değeri, AMH ve östrojen değerleri düşük olan kadınların granüloza hücrelerinin mitokondriyonlarının JC-1 değerinden istatistiksel olarak anlamlı şekilde yüksek bulunmuştur (p<0.016). AMH ve östrojen düzeyi düşük olan grubun sitoplazmasında C şeklinde, yüzük şeklinde, şapkalı ve şişmiş mitokondriyonlar izlenmiştir. Çalışmamızda mitokondriyon aktivitesi ile serum AMH ve östrojen düzeyi arasında korelasyon bulunmuştur. AMH ve östrojen düzeyi düşük olan grupta mitokondriyal membran potansiyeli düşük ve mitokondriyon morfolojisi bozuk olarak gözlenmiştir.
Polikistik over sendromunda ekzositoz ilişkili SNARE moleküllerinin granüloza hücrelerinde in-vitro değerlendirilmesi
Polikistik over sendromu üreme çağındaki kadınlarda kronik anovulasyonun en sık nedeni olması ve üremeye yardımcı tedavi ihtiyacı doğurması nedeniyle önemli bir sağlık sorunudur. Membrana granülozayı oluşturan granüloza hücrelerinin sentez yeteneğindeki bozulma veya ekzositoz yeteneğindeki bozulma folikül içi sinyal molekülü miktarındaki disregülasyondan sorumlu olabilir. Bu amaçla ÜYTE kliniğine başvuran çiftlerin erkek faktörü (n=10) ve PKOS (n=10) kadınlarından oosit toplama işlemi sonrası atılan granüloza hücrelerinde "vezikül füzyon proteinleri"nden olan Stx6, SNAP25 ve StxBP1 proteinleri immunofloresan işaretleme yöntemi ile araştırılmış ve elektron mikroskobik inceleme yapılmıştır. Polikistik over sendromunda Stx6, SNAP25 ile StxBP1 düzeyinin azaldığı ve in-vitro ortamda FSH-hCG uyarısı ile bozulmanın düzelmediği görülmüştür. Granüloza hücrelerinin salgıladığı KITL faktörünün de hücre içinde azalmıştır. Elektron mikroskobik incelemede PKOS'ta granüloza hücrelerinin veziküllerinde elektron yoğunluğunun sağlıklı bireylerine göre azalmıştır. Bu çalışmanın sonucunda PKOS'ta, sağlıklı granüloza hücrelerine göre; vezikül miktarının azaldığı, FSH-hCG uyarısına verilen veziküler yanıt bozulmuş ve Stx6, SNAP25, StxBP1 düzeyleri azalmıştır. Sonuç olarak PKOS'ta bozulmuş olan granüloza hücresi kökenli faktörlerin sentezindeki aksaklığın yanında salgılanmasında da bozulma olduğu ortaya konmuştur.
Kanser kök hücre lizatı ile yüklenmiş dendritik hücrelerin antitümör immün yanıtlarının incelenmesi
Kanserin kökü olarak ifade edilen "kanser kök hücre"lerini ortadan kaldırmaya yönelik vücudun kendi savunma hücrelerinin kullanılması, kanser immünterapisinin en önemli devrimlerin birisidir. Kanser kök hücreleri (KKH), kendini yenileme ve tümörü başlatma kapasitelerine sahip eşsiz bir küçük alt popülasyonu temsil etmektedir. Kanser immünoterapisinin temel amacı, KKH'lere karşı güçlü bir bağışıklık tepkisinin uyarılmasıdır. Güçlü ve aynı zamanda karmaşık olan bağışıklık sistemi hücre, doku ve organların birlikteliğini yansıtan bir ordudan oluşmaktadır. Ordunun en önemli üyelerinden biri olan dendritik hücreler (DH), doğal ve adaptif bağışıklık arasında önemli bir köprü gören profesyonel hücrelerdir. Matürasyon sürecini takiben, DH'ler anti-tümör yanıtlarının indüksiyonu ve sürdürülmesinde merkezi rol oynamaktadır. Bununla birlikte, kanser hastalarında DH-bazlı tedavinin terapötik etkinliği yeterince tatmin edici değildir ve yeni stratejilerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. DH'lerin yüzeyinde bulunan sialik asitler antijenlerin alınması, işlenmesi, T-hücrelerine sunulması ve immünolojik sinapsların oluşturulmasında oldukça kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada, i)sialik asitleri uzaklaştırıldıktan sonra KKH antijenleri ile muamele edilerek matüre edilen DH'lerdeki değişikliklerin çeşitli yönlerle incelenmesi, ii) KKH'lerine karşı immün yanıtın değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Meme kanser kök hücreleri (CD44+/ CD24-/low) floresanla aktive hücre ayırma (FACS) cihazı ile izole edildikten sonra KKH antijenleri içeren lizat elde edilmiştir. Kemik-iliğinden izole edilen DH'ler CD11c kullanılarak karakterize edilmiştir. DH'lerin yüzeyindeki sialik asitler nöraminidaz yardımıyla uzaklaştırıldıktan sonra KKH lizatı ile muamele edilmiştir. KKH lizatının dendritik hücreler üzerine olan etkileri canlılık, apoptoz ve hücre döngüsü analizleri yapılarak değerlendirilmiştir. İmmatür (imDH) ve matür (mDH) hücrelerdeki CD40, CD80 ve CD86 gibi kostimülatör moleküllerdeki değişimler akım sitometrisi kullanılarak analiz edilmiştir. Çeşitli sinyal yolakları ile ilişkili genler PCR ile incelenmiştir. Dendritik hücrelerde meydana gelen biyokimyasal değişimler (glikojen, lipid, protein, nükleik asit) ATR-FTIR yardımıyla analiz edilmiştir. Hücrelerde meydana gelen morfolojik değişimler SPM ve histokimyasal boyamalar ile incelenmiştir. Hücrelerdeki IL-12 üretimindeki değişimler ELISA yöntemi ile analiz edilmiştir. In vivo çalışmalarında, meme kanser modeli oluşturularak imDH ve mDH'lerin immün yanıt etkileri çeşitli parametreler ile değerlendirilmiştir. Çalışmadan elde edilen veriler, imDH'lere ile kıyaslandığında mDH'lerin daha etkili immün yanıt oluşturduğunu göstermiştir. KKH antijenleri ile muamele edilen DH'lerin podozom yapılar oluşturduğu ve aktin, gelsolin, talin, Arp/2, WASp gibi hücre iskelet elemanlarının antijen alınımında etkin rollerinin olduğu gösterilmiştir. Matürasyon aşamasından sonra, CD86, CD80 ve CD40 kostimülatör moleküllerde artış tespit edilmiştir. DH'lerin farklılaşma ve fonksiyonu ile ilişkili Notch, MAPK ve interlökin sinyalizasyonunda önemli değişimler meydana gelmiştir. Nükleik asit, lipid, karbonhidrat ve protein yapılarında önemli farklılıkların olduğu ve matürasyonda lipit dropletlerinde azalış glikojen miktarında artışın olduğu tespit edilmiştir. Morfolojik analizler hücre büyüklüğü, yüzey alanı, pürüzlülük özelliklerin değiştiğini göstermiştir. Matürasyondan sonra, IL-12 üretiminde artış meydana gelmiştir. Anti-tümör immün yanıtlarının incelenmesi için yapılan kanser modelinde, mDH ile aşılanan farelerde tümör hacmi ve ağırlığında önemli bir azalmanın olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, proliferasyon ile ilişkili belirteçlerde azalma, apoptotik indekste ise artış belirlenmiştir. imDH ile kıyaslandığında, mDH'lerde CD4 ve CD8 oranlarında önemli artışların olduğu belirlenmiştir. mDH ile aşılamanın metastazı engellediği gösterilmiştir. Epitelial mezenkimal geçişle ilişkili Snail, Slug ve Twist gibi belirteçlerin ifadelerinde azalma tespit edilmiştir. Çalışmadan elde edilen veriler, sialik asit uzaklaştırma ve KKH antijenleri ile etkileşimin DH'lerde önemli moleküler, biyokimyasal, morfolojik ve fonksiyonel değişimler yarattığını göstermiştir. Bu değişimler, DH'lerin anti-kanser immün yanıtlarının artırılmasına katkı sağlamıştır. Anahtar Kelimeler; kanser kök hücre; dendritik hücre aşısı; immünterapi; sialik asit; matürasyon; immün yanıt
Siklofosfamid ile oluşturulan deneysel sıçan testis hasarı modelinde resveratrolün etkilerinin çinko ile karşılaştırmalı olarak incelenmesi
Amaç; CP ile oluşturulan deneysel testis hasarı modelinde Resveratrol (RES)'ün olası koruyucu etkisinin Çinko (Zn) ile karşılaştırmalı olarak incelenmesidir. Çalışma kapsamında RES, Zn ve RES-Zn birlikte uygulamaları ile CP'nin hasar oranının azaltılması hedeflendi. CP ile oluşturulan toksik testis hasarı modelinde, Zn etkileri gösterilmiş bir kontrol model olarak yer alırken, RES'in Zn ile birlikte kullanılması sonucunda ortaya çıkan etkilerin taramalarında bakılmamış olduğunu saptadık. Çalışmamızda sıçanlar (n=64) rastgele 9 gruba ayrıldı. Deney gruplarına 3 haftalık uygulamaların sonunda tüm gruplar; biyokimyasal, histokimyasal ve immünohistokimyasal yöntemlerle incelendi. Sperm parametreleri olarak Johnsen testiküler skorlaması ve sperm yayma preparatlarındaki morfolojileri değerlendirildi. CP ile oluşturulan deneysel sıçan testis hasarı modelinde histokimyasal olarak H-E, PAS ve MT, immünohistokimyasal olarak iNOS, eNOS ve CD34 boyamaları yapıldı. Biyokimyasal analiz olarak da MDA ve Katalaz değerlerine bakıldı. RES ve Zn'nin karşılaştırmalı etkileri literatürde ilk kez tarafımızdan ortaya konulmaya çalışıldı. Sonuç olarak; Zn ve RES'in birlikte kullanımının testis hasarı üzerine koruyucu etkileri mevcut olsa da kontrol ve salin grupları kadar iyileşme gözlemlenmedi. Yeni bir hücre türü olan telositlerin ise interstisyel alandaki varlıkları ve seminifer tübül çevresini bir kılıf gibi sardığı saptanmıştır. Projemizde optimum dozlarda vücutta yararlı etkilerini ortaya çıkartabilen RES ve Zn'nin birlikte ve/veya ayrı kullanımlarının oluşturduğu etkileşimler değerlidir. Kurgulanan in vivo modelin kliniğe uyarlamaları, tanımlanacak hücresel sinyal yolakları üzerinden tedavi amaçlı pek çok uygulamada infertilitenin sağaltımı konusunda yeni klinik fikirler ortaya çıkarabilir. Anahtar Kelimeler: Siklofosfamid, Resveratrol, Çinko, Testis
Glioblastoma multiforme ve glioblastoma multiforme kanser kök hücreleri ile astrosit ko-kültürlerinde, siklopamin inhibisyonu ile sonıc hedgehog sinyal yolağı ve ilişkili mekanizmalarda karşılıklı bağlantıların moleküler yöntemlerle araştırılması
Kanser, bir grup hücrenin kontrolsüz bölünme, invazyon ve metastaz gibi özellikler sergileyerek oluşturduğu bir hastalıktır. Embriyogenez sırasında da kontrollü hücre bölünmesi, hücre farklılaşması, hücre göçü ve programlanmış hücre ölümü görülür. Embriyo gelişimi ve tümör oluşumu, hücre göçü, invazyon, hücre farklılaşması ve immün cevaptan kaçabilme gibi benzer hücre davranışları sergileyebildikleri gibi bu iki tip hücrenin gen ekspresyonu, protein profilleri, sinyal yolakları da benzerdir. Hedgehog gen ailesi üyelerinden Sonic Hedgehog (Shh) sinyal yolağı, hem embriyogenez hem de karsinogenezde aktif olabilen önemli sinyal yolaklarından biridir. Bu yolaktaki aktivasyon artışları ile medulloblastoma, rabdomyosarkoma, kolorektal karsinoma gibi birçok kanser tipi ortaya çıkabilir. Glioblastoma multiforme (GBM), erişkin insanlarda en sık görülen primer kötü huylu beyin tümörü olup uzak organ yayılımı olmasa da oldukça hızlı büyüyen infiltratif bir tümördür. Tümörler heterojen hücrelerden oluşmakta olup; tümör kitlesi içinde kök hücreler gibi kendini yenileme ve farklılaşma özellikleri bulunan, radyoterapi, kemoterapiye dirençli olan, uzak organ yayılımları yapabilen ve kanser rekürrensinde etkisi olduğu düşünülen kanser kök hücreleri (KaKH) de bulunmaktadır. GBM'li olguların tümör kitleleri içinde de kanser kök hücreleri tanımlanmıştır ve bu hücreler prognozun kötüleşmesine neden olabilirler. Son yıllarda GBM tedavisi için Hedgehog sinyal yolağı önemli bir hedef haline gelmeye başlamıştır. Siklopamin, Smoothened (Smo) reseptörüne bağlanarak Shh sinyal yolağının inhibe edilmesinde kullanılan ve hayvan deneyi çalışmalarında gliomalar, pankreatik ve kolon karsinomlarında tümör büyümesini de inhibe ettiği gösterilen önemli bir ajandır. GBM ile ilgili çeşitli ko-kültür ve mikro-çevre araştırmaları ise henüz yeterli değildir. Literatür bilgilerine dayanarak, Sonic Hedgehog sinyal yolağının embriyonik dönemde önemli bir rol oynadığı bilinmekte, kanser ve kanser kök hücrelerinde de aktif olduğu ve tedavi direncinde de etkili olabileceği düşünülmektedir. Literatür bilgileri ışığında, çalışmamız ile GBM ve GBM kanser kök hücrelerinin astrositler ile ko-kültüre edilmesi ve bu ortamda Shh sinyal yolağının etkisi ve bu yolağın inhibe edilerek sonuçların değerlendirilmesi planlanmıştır. Ko-kültür ortamında hücre-hücre etkileşimleri değerlendirilip GBM ve GBM kanser kök hücrelerinde aktive olan Shh sinyal yolağını astrosit varlığında siklopaminin inhibisyon etkisinde bir değişim olup olmadığı aynı zamanda hücrelerin parakrin olarah Shh protein salgılayabilme özellikleri araştırılarak hücre-hücre etkileşimlerinin de Shh sinyal yolağının siklopamin ile inhibisyonu üzerine olumlu ya da olumsuz etkisi olup olmadığı sorusuna cevap aranmıştır. Sonuç olarak GBM ve GBM kanser kök hücrelerinde Shh sinyal yolağı inhibe edildiğinde beraberinde etkilenebilecek apoptoz ve hücre siklusu gibi hücre içi mekanizmalarındaki değişimler PCR, immünofloresan, ELISA, TUNEL, hücre siklusu analizi gibi yöntemlerle araştırılmıştır. Siklopamin, Shh yolağını baskılamada etkili bir ajandır; tek başına yeterli derecede hücre ölümüne neden olamasa da; GBM ve GBM KaKH'lerinde Shh yolağı aktivasyonunun görülmesi, kombine kanser terapilerinde Shh yolağının baskılanması gerekliliği ortaya koymuştur. GBM ve GBM KaKH kontrol gruplarının sonuçları ve siklopaminden etkilenmeleri RNA ve protein düzeyinde birbirlerinden farklıdır. Bu hücreler ile ko-kültür uygulandığında çoğu zaman farklı sonuçlar elde edilmiştir. Yapılan çalışma sonucunda özellikle tekli hücre kültürü ve ko-kültür sonuçlarının farklılığı ele alındığında, hastalıklarda ve tedavilerinde mikro-çevre etkisinin önemi ortaya koyulmuştur.
Doksorubisin ile indüklenen sıçan testis hasarı modelinde fluvastatinin olası koruyucu ve tedavi edici etkilerinin histokimyasal ve immünohistokimyasal olarak değerlendirilmesi
Klinikte ilk kez 1967 yılında kullanılmaya başlanan doksorubisin, günümüzde hala solid tümörlerin ve hematolojik malignetilerin tedavisinde sıklıkla kullanılan antrasiklin bir antibiyotiktir. Anti-neoplastik özelliğinin yanı sıra mutajenik, karsinojenik ve teratojenik etkilere de sahip olan doksorubisinin kullanımı, kalp, böbrek, karaciğer, beyin ve testis gibi organlarda ortaya çıkan akut ve kronik yan etkiler nedeniyle kısıtlanmaktadır. Yapılan çalışmalardan elde edilen bulgular, doksorubisin kullanımı nedeniyle germ hücrelerinde meydana gelen oksidatif stres ve lipid peroksidasyonunun bu ilaca bağlı ortaya çıkan testiküler hasarlanmada başlıca etkenler olduğununa işaret etmektedir fakat doksorubisin kaynaklı testis hasarlanmasından sorumlu mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Statinler, kolesterol biyosentezi için kilit enzim olan hidroksil-metil glutaril koenzim A (HMG-CoA) redüktazı, yarışmalı bir şekilde inhibe ederek etki gösteren en etkili kolesterolü düşürücü ajanlardır. Tamamen sentetik bir statin olan fluvastatin HMG-CoA redüktazı inhibe ederek, HMG-CoA'nın, kolesterol dahil çok sayıda sterolün öncül molekülü olan mevalonata dönüşümünü engellemektedir. Kolesterol düşürücü etkisinin yanı sıra, hidroksil ve superoksit radikallerini temizleyemek suretiyle antioksidan etki gösterdiği saptanan fluvastatinin, obezite kaynaklı testiküler hasarda mTOR sinyal yolağı üzerinden etki ederek koruyucu bir rol oynayabileceği ortaya konmuştur. Bu çalışmadaki amacımız, doksorubisin uygulaması ile indüklenen testiküler hasar modelinde fluvastatinin, olası koruyucu ve tedavi edici etkilerinin histokimyasal, immünohistokimyasal, biyokimyasal ve Real-Time PCR analizleri ile değerlendirilerek ortaya konulmasıydı. Yaptığımız analizlerden elde ettiğimiz veriler, doksorubisin ile indüklenen testis hasarında fluvastatinin özellikle, kan testis bariyerinin düzenlenmesinde önemli roller üstlenen mTOR, Cx43 ve MMP-9 protein ve mRNA ekspresyonlarını düzenlemek sureti ile hem koruyucu hem de tedavi edici etki olabileceğini ortaya koymuştur. Öte yandan bu ilacın profilaktik olarak kullanılmasının, tedavi amaçlı kullanılmasına oranla daha olumlu sonuçlar verdiği gözlemlenmiştir.
Sıçan over dokusu vitrifikasyonunda plateletten zengin plazma (PRP) eklenmiş dondurma solüsyonunun etkilerinin histolojik olarak incelenmesi
Kanser veya kanser dışı nedenlerle gonadotoksik tedavi alacak özellikle prepubertal çağdaki hastalar ve fertilite arzusunu ertelemek isteyenlerde doğurganlığın korunabilmesi günümüz şartlarında mümkündür. Gelişen tedavi protokolleri ile bazı kanserlerde kür sağlanmakta ancak alınan kemoterapötik ilaçlar ve/veya radyoterapi sonrası ovaryan disfonksiyon kaçınılmaz olmaktadır. Fertilitenin korunması için oosit ve embriyo kriyoprezervasyonu gibi yöntemler seçenekler arasında bulunmaktadır ancak bu işlemlerde önceden stimülasyon protokollerine ihtiyaç duyulmaktadır. Hızlıca kemoradyoterapi başlanması gereken hastalarda ovaryan stimülasyon işlemlerine vakit kalmamaktadır. Söz konusu durumlarda ovaryan kriyoprezervasyon alternatif bir tedavi seçeneği sunmaktadır. Günümüzde over doku kriyoprezervasyonu sonucu sağlıklı gebelikler bildirilmiştir. Over doku kriyoprezervasyonu işleminin başarılı örnekleri literatürde mevcut olmakla birlikte hala deneysel çalışma olarak nitelendirilmekte ve prosedürlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Kriyoprezervasyon ve kriyoprotektan ajanlardan kaynaklanan hücresel hasarın azaltılmasında çeşitli maddeler denenmiş ve olumlu sonuçlar elde edilmiştir. Kriyohasarı azaltmak amacıyla plateletten zengin plazmanın kullanılabilirliği çalışmamıza konu olmuştur. Plateletten zengin plazma (PRP), plateletlerin yoğunlaştırılmasıyla elde edilen bir kan ürünüdür. İçeriğindeki zengin büyüme faktörleri sayesinde rejeneratif tıpta oldukça fazla kullanım alanı bulmuştur. Besiyerlerine eklenen hücresel fonksiyonlarda destekleyici görev gören fetal sığır serumunun (FBS) alternatifi olarak PRP kullanılması ile hayvansal maddelerin veya enfeksiyöz patojenlerin geçişi elimine edilmektedir. Ayrıca PRP'nin otolog kullanılması nedeniyle immün reaksiyon ihtimali azalmaktadır. Kriyoprezervasyon tekniklerinin geliştirilmesi adına literatürde ilk defa sıçan bütün over doku kriyoprezervasyon işleminde vitrifikasyon solüsyonuna PRP eklenerek dokular dondurulmuştur. Dokular kontrol (Grup 1), vitrifikasyon solüsyonuna PRP eklenerek dondurulan PRP eklenmiş (Grup 2) ve vitrifikasyon solüsyonuna FBS eklenerek dondurulan PRP eklenmemiş (Grup3) olarak gruplandırıldı. Çözme sonrası dokular histokimyasal, immünhistokimyasal ve immünfloresan boyama yöntemleri ile boyanarak incelendi. Histokimyasal boyama yöntemi ile HE, PAS ve Mallory Trikrom boyamaları yapıldı. İmmünfloresan boyama yötemiyle kaspaz 3 ekspresyonuna ve TUNEL analizine bakıldı. İmmünhistokimyasal boyama yöntemiyle konneksin 43, Bax, Bcl-2 ve kaspaz 3 ekspresyonu incelendi ve TUNEL analizi yapıldı. Sonuçta kontrol grubu ile karşılaştırıldığında gerek Grup 2'de gerekse Grup 3'te vitrifikasyona bağlı dejenerasyonların olduğu görülmüştür. Ancak Grup 2'de PRP'yi aktive etmek için kullanılan CaCl2'ün vitrifikasyonun zararlı etkilerini agreve ederek over dokusunda görülen dejenerasyonu arttırdığı ve PRP'nin muhtemel olumlu etkilerini önlediği tespit edilmiştir. Her iki deney grubunda da primordiyal foliküllerin korunmuş olduğu ancak foliküler gelişimin ileri aşamasındaki foliküllerde dejenerasyonun artmış olduğu dikkati çekti. Elde edilen bulgular ışığında sıçan over dokusu kriyoprezervasyonunun bütün over dokusu yerine kortikal parçalar halinde yapılması, PRP aktivasyonu için CaCl2 yerine başka metodların uygulanması, vitrifikasyon solusyonlarına CaCl2 eklenmemesi, PRP'nin kriyoprezervasyondaki muhtemel yararlı etkilerinin gösterilmesi ve standardizasyonunun sağlanması için CaCl2 ile aktive edilmemiş PRP'nin hem vitrifikasyon hem de yavaş dondurma yönteminde uygulanarak sonuçlarının analiz edilmesi gerektiği kanaatine vardık.
Yardımlı üreme teknikleri ile elde edilen bos taurus embriyoları üzerine, yavaş dondurma ve melatoninin etkilerinin histolojik yöntemler ile incelenmesi
Büyükbaş hayvancılıkta yardımlı üreme teknikleri (YÜT) in vitro'da embriyo üretimiyle, yüksek verim kabiliyetine sahip hayvan ırklarının devamlılığı sağlanabilmektedir. Mezbaha kaynaklı oositlerin YÜT kullanılarak, değişik hayvan türlerinde farklı kriyoprezervasyon yöntemleri ile yapılan çalışmalarda, embriyoların uzun süreler saklanabilmesi ve yüksek bir fertilite oranı hedeflenmektedir. Ancak kriyoprotektanlara maruz kalma süreleri ve onların toksisite düzeylerindeki farklılıkları sebebiyle, embriyo yapılarında, donma-çözme sırasında oluşabilen buz kristallerine bağlı olarak embriyoların zona pellucida'sında kırılma, hücre membranları ve iskeletinde hasar meydana gelebilmektedir. Hasarları az miktarlara çekebilmek adına bu çalışmada YÜT ile elde edilen Bos taurus embriyoları üzerine, yavaş dondurma sonrası melatoninin etkileri histolojik yöntemlerle incelenmiştir. Mezbahadan elde edilen Holstein (Bos taurus) cinsi 4-8 yaş aralığındaki sağlıklı sığırlardan alınmış overlerden folikül aspirasyon yöntemi ile elde edilmiş olan oositler in vitro maturasyon işlemine alınmıştır. Ticari olarak satın alınmış olan dondurulmuş boğa spermleri ile IVF (İn vitro Fertilizasyon) işlemi uygulanan oositler, melatonin katkısı ve slow freezing işleminin ardından, -196 °C'deki sıvı azot içinde 1 gün süreyle saklanmıştır. Kriyoprezervasyonun olası etkilerini histolojik yöntemler ile incelenmek amacıyla 1 gün sonra çözdürülen embriyolar, histolojik takip prosedürlerinden sonra lipit tespiti amacıyla Azur II-Metilen Blue-Basic Fuksin Boyama, nükleus ve organel dağılımlarının gözlenmesi amacıyla da Toluidine Blue boyanarak ışık mikroskop altında incelenmiştir. Embriyo canlılığı ve total hücre sayımı tespitleri de ek olarak hoescht boyaması yapılarak floresan mikroskop ile incelenmiştir. Kontrol grubu embriyolarının sınırları belirgin, Benzer büyüklüklerde blastomer yapıları içerdiği, blastomerler arasında geniş subzonal alanların varlığı, blastomerleri çevreleyen zona pellucida sınırlarının belirgin olduğu ve fragmantasyon içermedikleri saptanmıştır. Slow freezing grubu embriyolarda; blastomer sınırlarında düzensizleşme, fragmantasyon benzeri oluşumlar ve/veya dejenerasyonlar gözlenmiştir. Slow freezing grubuna ait embriyolarda sitoplazma içinde yer yer vakuoalizasyonlar, interblastomer ve subzonal aralıklarda hücresel atıklar belirlenmiş ve blastomer yapıları içerisinde dağınık şekilde yer alan farklı büyüklük ve sayıda lipit damlacıkları görülmüştür. Melatonin uygulaması yapılmış ve yapılmamış gruplar kıyaslanarak; embriyolarda yarıklanma ve slow freezing sonrası blastosiste gitme oranları incelenmiş ve sayısal verilerle gösterilmiştir. Floresan mikroskop ile canlılık oranları saptanmıştır. IVF ve slow freezing işlemi sırasında ortaya çıkan ROS (Reaktif Oksijen Türleri)'un lipit ve proteinlerde meydana getirdikleri hasara bağlı olarak zar geçirgenliği geri dönüşümsüz olarak bozulmasının azaltılması için kültür ortamına uygun doz ve miktarda antioksidan melatonin eklenmesinin embriyo gelişimi açısından yararlı olabileceği düşünülmüştür. Daha fazla veri üretmek ve daha da güvenilir sonuçlar elde etmek için daha fazla araştırmalar gerekmektedir.
Fare embriyonik kök hücrelerinin hücreler arası madde yoğunluğunun değiştirilerek farklılaştırılma süreçlerinin araştırılması
Doku formunu oluşturan hücresel bileşenlerin sürekliliği ve özelleşmesi hem yetişkin hem de gelişmekte olan organizmalarda önemli işlemlerdir. Pluripotent embriyonik kök hücreler, primitif organizmanın iç hücre kütlesinden elde edilir. Bu hücrelerin farklılaşması kademeli olarak gerçekleşir ve hücrelerin pluripotent özellikleri giderek azalır. Hücreler, hem hücre içi hem de hücre dışı sinyalleri sürekli olarak alırlar, böylelikle iç metabolik aktivitelerini düzenlerler. Niş, kök hücrelerin farklılaşmanın en önemli belirleyicilerinden biri olarak bilinir ve in vitro koşullarda in vivo ekstra selüler matriks (ESM) modelini taklit etmek için kullanılan birçok hidrojel vardır. En yaygın olarak kullanılan hidrojellerden biri matrijeldir. Bununla birlikte, kök hücrenin farklılaşma kapasitesi için matrijelin katkısı ve bu hidrojelin protein konsantrasyonu hakkında literatürde sınırlı bilgi vardır. Farklılaşmayı moleküler seviyede tespit etmek ve ayırt etmek için, evre-spesifik embriyonik antijen 1 (stage specific embryonic antigen 1=SSEA-1) ve Octamer-Binding Transcription Factor ¾ (Oct3/4) olarak adlandırılan embriyonik kök hücre belirteçleri kullanılır. SSEA-1 belirteci, diferansiye olmamış fare embriyonik kök hücre (fEKH) tanımlamasında kullanılır. Osteopontin (OPN = SPP1), farklılaşmada osteojenik belirteçlerden biridir ve osteoblastik hücrelerde eksprese edildiği bilinmektedir. Çalışmamızda, hücre döngüsü ve immünofloresan (IF) boyamalar aracılığıyla fEKH kapasitesi ve farklılaşma kabiliyeti manipüle edilerek sürecin geliştirmesi amaçlandı. Üç farklı konsantrasyon (2, 4, 6 mg/ml) ve üç zaman noktasına odaklanıldı (gün 1, 3, 6). Kök hücre kimliğini ve osteoblastik farklılaşmayı gözlemlemek için sırayla SSEA-1 ve OPN proteinlerine özel boyamalar yapıldı. fEKH'lerin kök hücre özelliklerinin, hücre döngüsü ve IF ile gösterilen ekstraselüler matriks protein konsantrasyonuna bağlı olarak değiştiği sonucuna varıldı. Gelecekteki çalışmalarda, in vitro olarak kök hücre farklılaşmasındaki ilerlemeler ile rejeneratif tıp alanında hücre-doku bazında replasman altyapısı sağlanacaktır. Dahası, ekstraselüler matriks ile fEKH etkileşimleri, ortak sinyal yolları kullandıkları için karsinogenez, epitelyal mezenkimal geçiş (EMT) ve fibrotik bağ doku kökenli mekanizmaları da aydınlatabilir.
Gebelik ve laktasyon döneminde aflatoksin b1 uygulanan sıçanların yeni doğanlarında karaciğer üzerine genotoksik etkilerin histolojik olarak araştırılması
Aflatoksinler, gıda ürünlerinin hatalı ve/veya yanlış ortamlarda kurutulmaları sonucunda Aspergillus sp. tarafından sentezlenen ve ortama salınan bir çeşit mantar toksini olup gıda güvenliğinde önemli rol oynamaktadır. Aflatoksin B1 (AFB1)'in son yıllarda transplasentasyonel ve laktasyonel geçişi ile genotoksik etkileri çeşitli araştırmalarda bildirilmekle beraber; karaciğer gelişimsel etkileri ile ilgili karşılaştırmalı çalışma yeterli değildir. Çalışmamızda, deneysel olarak maternal sıçanlara AFB1 (50 μg/kg i.p.) uygulamasının plasental geçiş ile yenidoğanlara ve laktasyon sürecinde maternal AFB1 uygulaması ile 21 günlük postnatal sıçanların karaciğerleri üzerine genotoksik potansiyel olası etkilerin dört ayrı grup halinde planlanarak. (Kontrol grupları: Yenidoğan, Laktasyon grubu; Deney grupları: AFB1 Yenidoğan ve Laktasyon grubu) histolojik olarak araştırılması amaçlanmıştır. Karaciğer histolojik değişikliklerin incelenmesi için hematoksilen-eozin, Mallory-azan, periyodik asit-Schiff (PAS) boyamaları, immunohistokimyasal olarak proliferasyonu belirlemek PCNA, apopitoz için immunofloresan TUNEL boyamaları ile proliferasyon ve apopitotik indeksleri oluşturulmuştur. Ayrıca progenitor hücreler için CK19 ve erken dönem hepatokarsinom (HCC) için AFP immuno boyanma yoğunluğu değerlendirmeleri Hscore'ları elde edilmiş ve biyokimyasal olarak karaciğerlerde malondialdehit ve katalaz analizleri yapılmıştır. Bulgularda, vücut ağırlıkları ve karaciğer ağırlıkları karşılaştırıldığında sadece yenidoğan deney gruplarında anlamlı azalma (p<0,001), saptanmıştır. Işık mikroskobik değerlendirmelerde AFB1 yenidoğan deney grubunda sinüzoidal yapılarda yer yer genişleme şeklinde dilatasyon, endotel bütünlüğünün kaybolduğu, kordon yapılarında bozulma ile birlikte hematopoetik hücre toplulukları saptandı. Vena santralis endotel yapısının bazı alanlarda yer yer bütünlüğünün bozulduğu, hepatositlerde vakuolizasyon yapısının arttığı, sitoplazmada daha yoğun lipit yapılarının bulunduğu, piknotik nukleuslu hepatositler ile çok nukleuslu soluk hücre toplulukları saptanmıştır. Portal alanlarda bağ dokusunda yer yer lenfosit infiltrasyonu ile birlikte Vena santralis periferindeki bağ dokususunda hafif artış, daha az yoğun PAS pozitif alanlar saptandı. Laktasyon AFB1 deney gruplarında sinüzoidal yapıda genişleme, Vena santralis bütünlüğünün bozulduğu santral alanlar, hepatositler soluk renkli yoğun vakuoler yapı ayırt edildi. Ayrıca, perivasküler bağ dokusu alanlarında kollajen lifleri daha belirgindi. Yenidoğan AFB1 deney grubunda vena santralis çevresinde özellikle II endotele komşu alanlarda daha yoğun olmak üzere TUNEL pozitif boyanma görülürken apoptotik indekslerde yenidoğan deney grubunda istatistiksel olarak önemli düzeyde anlamlı bir artış (p<0,001) saptanmıştır. PCNA, Proliferatif indeks sonuçlarında ise tüm deney gruplarında anlamlı azalma ile birlikte, yenidoğan ve laktasyon grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı bulunmuştur. CK19 immunoreaktivitesinin her iki deney grubunda da kontrole göre anlamlı azaldığı, AFP immunoreaktivitesinde ise yenidoğan ve laktasyonda AFB1 grubunda istatistiksel olarak anlamlı arttığı (p<0,001) bulunmuştur. Deney grupları birbiriyle karşılaştırıldığında yenidoğan deney grubu anlamlı olarak artış saptanmıştır. Yenidoğan AFB1 grubunda kontrole göre MDA düzeyinde istatiksel olarak anlamlı düşme ile birlikte CAT düzeyinde anlamlı yükselme; laktasyon deney gruplarında MDA ve CAT'da anlamlı yükselme saptandı. Sonuç olarak; maternal uygulanan AFB1'in anne sütünden daha fazla etkili olarak transplasental geçişle yenidoğanlarda intrauterinal gelişim geriliği ile birlikte histopatolojik değişikliklere yol açtığı ayrıca genotoksik etkilerle apoptotik hücre ölümünü, erken dönem karaciğer hepatoselüler karsinoma yol açabileceği ve hepatik kök hücrelere etkisi ile proliferasyonu azalttığı düşünülmektedir.
Deneysel polikistik over sendromu (pkos) modelinde tamoksifen ve klomifenin ovaryum dokusu üzerine etkilerinin otofajik açıdan değerlendirilmesi
Polikistik over sendromu (PKOS), menstrüel disfonksiyon, hiperandrojenizm, hirsutizm, infertilite ve polikistik overlerle karakterize endokrin bir bozukluktur. Üreme çağındaki kadınların %5 ila %10'unu etkileyen bu hastalık anovulasyon nedeniyle ortaya çıkan infertilitenin en önemli sebeplerinden biridir. PKOS'un neden olduğu infertilinin tedavisinde en sık kullanılan ilaç olan klomifen, hipotalamusta bulunan östrojen reseptörlerine bağlanarak östrojenin negatif feed-back mekanizmasını engeller. Bu durum FSH hormonunun artmasına neden olarak ovulasyonun gerçekleşmesini sağlar. Tamoksifen, Klomifen gibi nonsteroid selektif östrojen modülatörüdür ve yapısal olarak klomifene benzerdir. Esas olarak meme kanseri tedavisinde kullanılsa da ovulasyon indüksiyonu için yapılan çalışmalarda Klomifenle benzer ovulasyon ve gebelik oranlarına ulaşılmıştır. Çalışmamızda, 21 gün boyunca gavaj yöntemiyle 1mg/ kg Letrozol verilerek oluşturulan PKOS modelinde, grup ismine bağlı kalınarak dişi sıçanlara 5 gün boyunca Tamoksifen ve Klomifenin uygulaması yapılmıştır. Uygulama süresinin sonunda sakrifiye edilen hayvanlardan alınan ovaryum dokuları, histokimyasal, immünohistokimyasal boyamalar ve Real time-PCR (RT-PCR) tekniği ile analiz edilmiştir ve bu ilaçların ovaryum dokusu üzerine etkinliklerinin, otofaji yolağıyla ilişkisi araştırılmıştır. Yaptığımız çalışmada immünohistokimyasal boyamalar ve RT-PCR analizlerinde, tamoksifen ve klomifen gruplarında LC3 ekspresyonunun arttığı, mTOR ekspresyonunun azaldığı gözlemlenmiştir. Bu bulgulara dayanarak, tamoksifen ve klomifenin PKOS'lu ovaryumlarda, otofajiyi indükleyabileceği sonucuna vardık.
Diyabetin neden olduğu testis hasarı üzerine losartan'ın olası anti-apoptotik etkisinin araştırılması
Diyabet kan glukoz seviyesindeki aşırı yükselmeyle sonuçlanan, birçok doku ve organ yapısını olumsuz etkileyen metabolik bir hastalıktır. Mortalite ve morbitide oranındaki yükseklik ve artan prevalans değerleri ile günümüz önemli problemlerinden biridir. Diyabet birçok doku ve organ yapısında gösterdiği bozukluğun yanısıra testis yapısını ve spermatogenez sürecinide olumsuz etkileyen bir hastalıktır. Yapılan birçok çalışmada Streptozotosin (STZ) ile indüklenmiş diyabetik sıçan modellerinde diyabetin testis dokusu üzerine olumsuz etkilerinin olduğu gösterilmiştir. Losartan'ın antihipertansif etkilerinin yanında yapılan çeşitli çalışmalarda, farklı hastalık modellerinde testis dokusu üzerine olumlu etkilerinin olduğu gösterilmiştir. Losartan bir Angiotensin II tip 1 reseptör blokörüdür. Özellikle diyabet ve hipertansiyon birlikteliği olan hastalarda diyabetik nefropatiyi geciktirici etkiye sahip özelliğinden dolayı oldukça sık tercih edilmektedir. Biz yaptığımız çalışmada STZ (50mg/kg) ile indüklenmiş diyabetik sıçanlarda testiste oluşabilecek olası hasarın farklı dozlarda losartan kullanılarak düzeltilebilme olasılığını araştırdık. Bu amaçla 5 farklı deney grubu oluşturulmuştur bu gruplarda kontrol, diyabetik kontrol, düşük doz losartan uygulanan diyabetik grup, orta doz losartan uygulanan rup ve yüksek doz losartan uygulanan diyabetik grup yer almaktadır. Oluşturduğumuz deney guruplarından testis dokuları alınarak meydana gelmiş olan değişiklikler apoptotik yolaklar üzerinden immünohistokimyasal, Real Time-PCR analizi yapılarak incelenmiştir bunun yanı sıra gruplardan alınan epididimlerden sperm elde edilerek sperm parametreleri değerlendirilmiştir. Çalışmamızın sonucunda artan losartan dozuyla bağlantılı olarak testiste gözlemlenen apoptoz oranlarında azalma tespit edilmiştir. Artan losartan dozuyla birlikte pro-apoptotik protein mRNA'sında azalma ve anti-apoptotik protein mRNA'sında ise artış tespit edilmiştir. Ayrıca yapılan sperm değerlendirmeleri sonucu sperm anamoli ve apoptoz oranlarında düşüş, sperm sayısında ise artış tespit edilmiştir. Losartanın doz artışının diyabetin neden olduğu testis hasarı üzerine olumlu etki gösterdiği ve apoptoz oranlarını azalttığı tespit edilmiştir.
Fotoduyarlılaştırıcı olarak schiff baz ligand kompleksleri kullanılan fotodinamik terapinin insan meme kanseri hücre hattı MCF-7 üzerinde anti-kanser etkisinin incelenmesi
Günümüzde meme kanseri kadınlarda görülen en sık ölüm nedenlerinden birisidir. Meme kanseri tedavisinde kullanılan sisplatinin ciddi yan etkileri olması nedeniyle son zamanlarda fotoaktif ajanlar ile Fotodinamik Terapi (FDT) önemli hale gelmiştir. FDT; ışık, fotoduyarlılaştırıcı ve oksijen ile etkisini gösterebilen alternatif tedavidir. Çalışmamızın amacı, MCF-7 hücrelerine 3 farklı ajan uygulandıktan sonra LED ışık kaynağı ile 15 J/cm2'de ışınlanarak 72 saat inkübasyon sonunda olası antitümör aktivitesini ve etki mekanizmasını sisplatin ile kıyaslayarak ortaya koyabilmektir. Çalışmada sisplatinin ile yeni sentezlenen 2 farklı yapıda Paladyum konjuge schiff baz ligandı kullanıldı. Çalışmamızda MCF-7 hücrelerine uygulanan ajanların hücre içindeki birikimi zamana göre test edildi. MTT analizi ile ajanların uygulanacak dozları belirlendi. Daha sonra ışık gören (kontrol, 25 μM sisplatin, 12,5 μM sisplatin, 25 μM kompleks-1, 12,5 μM kompleks-1, 50 μM kompleks-2 ve 25 μM kompleks-2 grubu) ve ışık görmeyen (kontrol, 25 μM sisplatin, 12,5 μM sisplatin, 25 μM kompleks-1, 12,5 μM kompleks-1, 50 μM kompleks-2 ve 25 μM kompleks-2 grubu) gruplar oluşturuldu. MCF-7 hücrelerine uygulanan ajanların en yüksek seviyedeki hücresel alımın 12. saatte olduğu izlendi ve inkübasyon süresi 12 saat olarak belirlendi. Tüm gruplarda hücre ölümü için Anneksin V ile boyama, apoptoz için kaspaz-8 ve kaspaz-9 ile immünfloresan işaretleme yapıldı. Ayrıca DCFDA kiti ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyesi değerlendirildi. MTT bulgularımız ile sisplatin, kompleks-1 ve kompleks-2 aracılı FDT'nin sitotoksiteyi önemli ölçüde arttırdığı saptandı. Işık görmeyen ve ışık gören gruplar arasında ROS seviyesi önemli derecede farklılık gösterdi. Sisplatin ve kompleks-1 aracılı FDT uygulaması sonrası kaspaz-8 ve kaspaz-9 immünfloresan işaretlenme ile apoptotik ve nekrotik hücre ölümü saptandı. Kompleks-2 aracılı FDT uygulaması sonrası ise kaspaz-8 ile immünfloresan işaretlenme ve hücre ölümü görülmedi. Ayrıca kompleks-2 aracılı FDT'de düşük düzeyde kaspaz-9 floresan işaretlenme saptandı. Sonuç olarak, MCF-7 hücrelerinde kompleks-1 aracılı FDT'nin, potansiyel bir antikanser etkiye sahip olduğu görüldü. Ancak kompleks-2 aracılı FDT'nin tek başına küratif bir etkiye sahip olmadığı görüldü.
İyonize edici radyasyonun neden olduğu nöral hücre hasarının bağışıklık yanıtı ile onarılması
Radyoterapi (RT) birçok kanser tipinin tedavisinde kullanılmakla beraber, kanser odağı dışındaki sağlıklı dokular üzerinde de etkisini göstermektedir. Öğrenme, hafıza gibi çeşitli bilişsel fonksiyonlar ile yakından ilişkili olan hipokampus (HP), radyasyondan olumsuz yönde etkilenmektedir. HP'te bulunan kök hücrelerin ve farklılaşmış hücrelerin radyasyon maruziyetine bağlı oluşan hasara nasıl cevaplar meydana getirdiği ve bu cevapların hangi faktörlerle işlediği araştırılmaya açık bir konudur. Bu çalışmanın amacı, fare HP'sinden elde edilmiş HT22 hücrelerini kullanarak RT'nin etkisini in-vitro ortamda farklı açılardan göstermek ve ardından radyasyonun olumsuz etkilerini immün yanıt yaklaşımı ile (makrofaj hücre hattı olan RAW264.7 medyumunda bulunan parakrin etkilerle) onarmaktır. Bu çalışmayla, iyonize edici radyasyonun 2 Gy ve 8 Gy uygulanan gruplarda hücre kaybına, kalıcı morfolojik değişikliklere, antiinflamatuar yanıtta etkili olan genlerden Nrf2 ve Grn ekspresyonlarında artışa neden olduğu gösterilmiştir. Canlı kalan hücre koloni sayısı, gerçek zamanlı hücre analizi ve apoptoz sonuçlarına göre, fare makrofaj-koşullandırılmış medyumu ile bu etkiyi in-vitro ortamda onarabilme potansiyeli olan en etkili grup (tedavi grubu), radyasyondan önce 24 saat koşullandırılmış medyum uygulanıp radyasyondan 24 saat sonra koşullandırılmış medyum uygulanan grup olarak tayin edilmiştir. Bu grup seçildikten sonra immunoterapi yaklaşımı içeren tedavi grubunun radyasyona karşı 48. ve 72. saatlerde oluşturduğu biyolojik yanıtlar değerlendirilmiştir. Tedavi grubunun 8 Gy'lik radyasyon hasarına bağlı olarak canlı kalan hücre koloni sayısında ve apoptoz oranında azalmaya yol açtığı tespit edilmiştir. Bu tez kapsamında, radyasyonun HT22 hücreleri üzerindeki etkisi ayrıntılı bir şekilde değerlendirilmiş, immünoterapi yaklaşımlarının radyasyon hasarına karşı koruyucu olabileceği yönünde umut vaat edici ön sonuçlar elde edilmiştir. Daha sonraki çalışmalarda, nöral hücreler üzerindeki bu etki, in-vivo ortamlarda test edilerek koşullandırılmış medyumun potansiyel koruyucu ve/veya onarıcı etkisi biyolojik sistemler üzerinde de test edilebilir.
Endometriozis dokusundaki DNA metilasyon dinamikleriyle ten-eleven translokasyon genleri ve enzimlerinin olası ilişkisinin araştırılması
Endometriozis, endometriyum dokusunun uterus kavitesi dışında gelişmesidir. Hastalığın etiyolojisi halen bilinmemektedir. Yakın zamanda yapılan pek çok çalışmada epigenetik modifikasyonların hastalıklarla olan ilişkisi gösterilmiştir. Epigenetik değişiklik mekanizmalarından DNA metilasyonu ve demetilasyonu en çok araştırılan konu olmuştur. Fakat TET enzimlerinin endometrioziste immünohistokimyasal ekspresyonları daha önce incelenmemiştir. Yaptığımız çalışmanın amacı DNA demetilasyonunu katalize eden Ten-Eleven Translokasyon Genleri ve Enzimlerinin (TET) over dokusuna implante olmuş endometriotik dokudaki ekspresyonunu değerlendirmektir. Proje kapsamında 15 sağlıklı bireyden alınan endometriyum dokusu ve 15 endometriozisli hastadan alınan endometrioma dokusu karşılaştırılmıştır. Orta-foliküler fazda alınan doku örnekleri TET1, TET2 ve TET3 primer antikorları kullanılarak kontrol ve deney grubu arasındaki ekspresyon düzeyleri immünohistokimyasal işaretleme ve RT-PCR yapılarak incelendi. Elde ettiğimiz tüm sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi. Orta proliferatif evrede alınan örneklerin TET1 ve TET3 immünreaktiviteleri arasında anlamlı bir fark gözlenmezken, TET2 immün işaretlemesi, endometriozis grubunda endometriyal stromada anlamlı olarak azalmıştı. Gruplar arasında mRNA ekspresyon düzeyleri arasında anlamlı bir fark yoktu. Elde ettiğimiz sonuçlar ışığında TET enzim ailesinin endometriyumda eksprese olduğu görüldü ve endometrioziste düşük TET2 ekspresyonunun progesteron direnci ile ilişkili olabileceği düşünüldü.
Resveratrolün ıshikawa endometriyal kanser hücrelerindeki apoptozis ve otofaji üzerine etkileri
Endometriyum kanseri, kadınlarda jinekolojik kanserler içinde birinci sırada yer alan bir kanser tipidir. Tanı ve tedavi aşaması üzerine olan çalışmalar son zamanlarda önem kazanmıştır. Mevcut tedavi seçeneklerine ek olarak geleneksel ilaçlar geliştirilmeye çalışılmaktadır. Resveratrol, antiinflamatuvar, antikanser etki gibi birçok biyolojik etkisi olan bir fitoaleksindir. Resveratrol'ün kanserdeki terapötik etkisini hücre ölüm mekanizmaları yoluyla gösterdiği düşünülmektedir. Ancak bu etkilerinin mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmada Resveratrol'ün endometriyal kanser hücre hattı olan Ishikawa hücreleri üzerindeki doz bağımlı etkilerini araştırmak amaçlanmıştır. Resveratrol' ün Ishikawa hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi MTT testi ile belirlendi. IC50 dozu ile RT-qPCR ile Apoptoz ve Otofaji İlişkili Genlerin mRNA Ekspresyon Analizi gerçekleştirildi. IC50 dozu uygulandıktan sonra immunoflorasan boyama yapıldı. Resveratrol'ün, Ishikawa hücrelerinin proliferasyonunu doza bağlı bir şekilde inhibe ettiği görüldü. IC50 doz grubu, kontrol grubu hücreleri ile mRNA ekspresyon düzeylerine göre karşılaştırıldığında Beclin-1, LC3-I, LC3-II, Casp-7, Casp-8, Casp-9, CycS ve FADD düzeylerinde anlamlı bir artış gözlendi. Çalışmamızda, Resveratrol'ün apoptozisi ve otofajiyi indüklemesi kanser tedavisinde kullanılabilecek bir ajan olabileceğini düşündürmüştür. Resveratrol'ün anti kanser özelliklerinin klinik çalışmalarla da değerlendirilmesi; yeni tedavi stratejileri geliştirmek için önem arz etmektedir. Anahtar kelimeler: Ishikawa hücreleri, hücre ölüm mekanizmaları, Resveratrol
Toluidin mavisi, anilin mavisi ve sperm kromatin dispersiyon testleri ile sperm dna hasar oranlarının kıyaslanması
İnfertil çiftlerin yaklaşık %20'sinde sadece erkek faktörü temel nedendir. İnfertil ve fertil erkekleri birbirinden ayırmak için sperm DNA bütünlüğü üzerine yapılan çalışmalar artmıştır. Sperm kromatininin bütünlüğü, özellikle intrastoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) uygulamalarında, fertilizasyon başarısında önemli rol oynar. İnfertil erkeklerde sperm DNA hasarı yüksek olarak saptanmaktadır ve yardımla üreme tekniklerinin başarı oranları ile ters ilişkilidir. Yardımla üreme tekniklerinde sperm DNA hasarı varlığını tespit etmek için uygulanan testler bulunmaktadır. Sperm DNA hasar oranı anilin mavisi, toludin mavisi ve sperm kromatin dağılım testi ile değerlendirilebilir. Toluidine mavisi; sperm kromatin bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılan temel boyadır. Zayıf paketlenmiş kromatine veya hasarlı DNA'ya sahip nükleustaki sperm DNA'sının fosfat rezidüleri toluidin mavisi gibi baz boyalara bağlanmaya daha eğilimlidir. Bu nedenle, ışık mikroskobunda hasarlı sperm mavi ile boyanırken normal sperm renksiz kalacaktır. Bu testin DNA yapısı ve paketleme için hassas bir test olduğu bildirilmiştir. Anilin mavisi; sperm kromatin bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılan asidik bir boyadır. Hasarlı DNA'ya sahip sperm sıklıkla rezidüel histonları açığa çıkarmaktadır. Bu rezidüel histonlar zayıf kromatin paketlenmesine, ana nükleoproteinlere kolay ulaşılmasına ve de anilin mavisi gibi asidik boyalara bağlanmaya yatkınlığa yol açmaktadırlar. Anilin mavisi, spermde kondansasyon anomalisi ile birlikte morfolojisini de değerlendiren bir boyadır. Anilin ile boyama sonucunda olgun sperm başları (matur sperm) açık mavi, olgunlaşmamış sperm başları (immatur sperm) koyu mavi boyanır. Sperm kromatin dağılım testi; sperm DNA fragmantasyonu ile direkt ilişkili uyarılmış kondensasyon (yoğunlaştırma) prensibine dayanmaktadır. Çok küçük halo veren ya da hiç halo oluşturmayan spermler fragmante DNA içeren spermlerdir. Bu test spermdeki DNA'nın parçalanma oranını göstermektedir. Bu çalışmamızda semen alınan hasta örneklerine toludin mavisi, anilin mavisi ve sperm kromatin dağılım testi kullanılarak infertil erkeklerin sperm DNA hasar oranlarını karşılaştırmayı amaçlamaktayız.
Pentoksifilin ve platelet aktive edici faktör uygulama sonrası spermatozoada meydana gelen ultrastrüktürel değişikliklerin kıyaslanması
Günümüzde evli çiftlerde yaklaşık olarak % 10-15 oranında infertilite görülmekte olup etiyolojik nedenler göz önüne alındığında % 40-50 kadarında erkek faktörüne rastlanmaktadır. Erkeğe bağlı infertilite problemi, düşük sayıda spermatozoon üretimi, spermatozoon motilitesinde azalma veya spermatozoon morfolojisinin yetersiz oluşu gibi özelliklerin tek başına veya bir kaçının birlikte görüldüğü durumlarda ortaya çıkar. İlk in vitro fertilizasyon (IVF) bebeğinin 1978'de doğumundan beri yardımla üreme teknikleri (YÜT)'nin uygulanma endikasyonları ve başarı oranları giderek artmıştır. Tüp bebek uygulamalarında bilim adamlarının üzerinde durduğu yegane durumlardan biri döllenme oranını arttırabilmektir. Bu yüzden in vitro fertilizasyon (IVF) uygulamalarında canlı spermatozoon seçimi önemlidir. Bunun için birçok yöntem ve farklı ajanlar kullanılmaktadır. Bu ajanlar içinde yaygın kullanım alanı bulanlar pentoksifilin (PF) ve platelet aktive edici faktör (PAF)'dür. Yapmış olduğumuz bu çalışma ile in vitro fertilizasyon (IVF) uygulamalarında kullanılan bu alternatif ajanların spermatozoon motilitesi ve ince yapısı üzerindeki etkilerini incelemeyi amaçladık. Bu nedenle çalışmamızda normozoospermik semen örneklerinden elde edilen spermatozoonlara pentoksifilin (PF) ve platelet aktive edici faktör (PAF) ile muamele edildi. Spermatozoonların membran yapısındaki glikokaliks, rutenyum red boyası ile belirginleştirilip örnekler geçirimli elektron mikroskobunda (TEM) kıyaslanarak incelendi. Ayrıca herhangi bir ajanla muamele olmamış kontrol grubu oluşturularak, pentoksifilin (PF) ve platelet aktive edici faktör (PAF) uygulanmış gruplarla karşılaştırıldı. Sonuç olarak çalışmamızda spermatozoonların pentoksifilin (PF) ve platelet aktive edici faktör (PAF)'e maruz kalmasının spermatozoon baş ve kuyruk yapısındaki olumsuz etkileri gösterilmiştir.
Piezoelektrik ve stronsiyum metodlarının oosit aktivasyonu üzerine etkilerinin ultrastrüktürel incelenmesi
Üreme; dünyadaki tüm canlı türlerinin genetik özelliklerini bir sonraki nesillerle aktarmaları ve kendi devamlılıklarını sağlamaları için gerekli vazgeçilmez bir olgudur. İnfertilite giderek yaygınlaşan önemli bir problem olarak pek çok çiftin karşısına çıkmaktadır. İnfertilitenin %50 oranında kadına bağlı problemlerden kaynaklandığı bilinmektedir. Başarılı tedavi olasılığını ve üreme üzerindeki temel çalışma olanaklarını arttıran in vitro fertilizasyon ve yardımcı üreme tekniklerinin gelişmesi ile infertilite alanında önemli yenilikler meydana gelmiştir. Oosit aktivasyonu problemi olan olgularda oosit aktivasyonunu sağlamaya yönelik çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Oosit aktivasyonunda en önemli olay hücre içi Ca^(+2) konsantrasyonundaki geçici artıştır. Ca^(+2) artışı olmaması aktivasyonu önlediği için infertiliteye sebep olabilmektedir. Bu yöntemler ile yapılan çalışmalar da oosit aktivasyonunun uyarılması ile elde edilen gebelikler rapor edilmiştir. Piezoelektrik ve stronsiyum muamelesi bu yöntemler arasında yer almakta olup çalışmamızda da bu iki yöntemin hücre üzerindeki etkilerini ortaya koymak adına ele aldık. Stronsiyum, fertilizasyon sonucu sperm ile uyarımı taklit ederek uzun süreli kalsiyum dalgalanmaları meydana getirmektedir. Çalışmalarda; sperm kaynaklı fosfolipaz C aktive edildiğinde, fosfotidilinositol 4,5-bifosfatı, ikinci mesajcı olan inositol 1, 4,5-trifosfata (InsP3) hidrolize ettiği görülmüştür. InsP3, endoplazmik retikulum üzerindeki, kalsiyum kanalı ihtiva eden InsP3 reseptörleri (InsP3R) ile etkileşime girerek oositin hücre içi depolarından kalsiyum salınımını uyarır ve oosit aktivasyonunu sağlar. Piezoelektrik metodunda, mikroenjeksiyondan sonra "Elektro Hücre Manipulatör" cihazı ile hücrelere belirli düzeyde elektrik verilir. Bu işlem ile oosit aktivasyonu sağlanır. Çalışmamızda oosit aktivasyonunda kullanılan stronsiyum ve piezoelektrik yöntemleri uygulanmış oositler ile herhangi bir uygulanma olmamış kontrol grubu oositlerin geçirimli elektron mikroskobu (TEM) düzeyinde morfolojik yapılarını karşılaştırmayı amaçladık.
Pentoksifilin uygulama sonrası maruziyet süresi dikkate alınarak spermatozoada meydana gelen ultrastrüktürel değişiklikler
Spermatozoon motilite sorunu olan erkeklerde spermatozoon motilitesini arttırmaya yönelik çeşitli farmakolojik ajanlar tanımlanmıştır. Yardımcı üreme tekniklerinde bu ajanlar içerisinde en çok kullanılanı ise pentoksifilindir. Pentoksifilinin erkek infertilisinde en yaygın kullanım alanı in vitro spermatozoon motilitesinin stimülasyonudur. Üremeye yardımcı tekniklerde, in vitro döllenme (IVF) ve intra-sitoplazmik sperm enjeksiyonunda (ICSI) canlı spermatozoon seçimi önemlidir. Bu seçim de spermatozoon motilitesi ile doğru orantılıdır. Yardımcı üreme tekniklerinde, motilitenin in vitro fertilizasyon kapasitesinde önemin anlaşılması ile pentoksifilinin rutinde kullanımının artması, bu konu üzerine birçok çalışma yapılmasına neden olmuştur. Çalışmamızda farklı maruziyet sürelerinde pentoksifilin uygulanmış normospermi örneklerinin ince yapılarını (ultrastrüktürel) geçirimli elektron mikroskobu (TEM) düzeyinde incelemeyi amaçladık. Belirlemiş olduğumuz normospermi örnekleri farklı sürelerde pentoksifilinle inkübe edildi. Belirlenmiş olan örnekler rutenyum kırmızı boyası uygulanarak spermatozoona ait membran yapısında glikokaliksi belirginleştirdikten sonra geçirimli elektron mikroskobunda spermatozoon ince yapısı karşılaştırılarak incelendi ve bu örnekler kontrol grubu ile de karşılaştırılarak değerlendirildi. Sonuç olarak çalışmamızda, 5 dakika (dk) pentoksifiline maruz kalan spermatozoon örneklerinin morfolojik yapısında fazla bozulma olmamasına karşın, 60 dakika pentoksifiline maruz kalan spermatozoon örneklerinde ise belirgin morfolojik bozukluklar görüldü. Buna bağlı olarak pentoksifilin süresinin spermatozoon morfolojisi üzerine etkisi gösterilmiştir.
Pentoksifilin ve platelet aktive eden faktör uygulama sonrası sperm kromatin dağılımı metodu ile DNA hasarının incelenmesi
Evli çiftlerin yaklaşık %15'inde infertilite problemi ortaya çıkmaktadır. İnfertilite (kısırlık) vakaları % 30-50 oranında erkeğe bağlı nedenlerden etkilenmektedirler. Erkek infertilitesinin başlıca nedenlerinden biri sperm motilitesindeki bozukluklardır. Sperm motilitesorunu olan erkeklerde sperm hareketliliğini arttırmaya yönelik çeşitli ajanlar tanımlanmıştır. Motilitenin başlatılmasında ve devam ettirilmesinde bu faktörler temel gereksinimdir. cAMP sperm fonksiyonlarının düzenlenmesinde anahtar role sahiptir. Sperm motilitesinin invitro şartlarda uyarılmasının esası da hücre içi cAMP seviyesini arttırarak sperm fonksiyonlarının uyarılmasına dayanmaktadır. Pentoksifilin gibi fosfodiesteraz inhibitörleri laboratuvarda semene eklendiklerinde, hücre içi cAMP düzeyini, glikozisi ve ATP yapımını arttırdığı görülmüştür. Bu maddeler motil sperm oranını yükseltmekte ve aynı zamanda canlı ama motil spermatozoalarda motiliteyi de tetiklemektedir. Dondurulup-çözünmüş örneklerde sperm motilitesini uyardığı da gösterilmiştir. Platelet Aktive Edici Faktör spermde mevcuttur ve endojen içeriğinin motilite ve gebelik oranı ile önemli ve olumlu ilişkisi vardır. PAF'ın eylem mekanizması tam olarak belli olmasa da, normal üreme fonksiyonuna dair önemi barizdir. Endojen PAF normal sperm fonksiyonu için bir biyobelirteç olarak da rol oynayabilir. PAF kullanmanın özel bir avantajı, sperm tarafından üretilen doğal bir madde olmasından ve pentoksifilin gibi diğer bazı hareketliliği uyarıcılardan farklı olarak toksik etkisinin olmamasındandır. Sperm motilitesinin geliştirilmesi yardımla üreme tekniği sonuçlarını etkili biçimde artırabilir. Özellikle total immotil olgularda canlı sperm seçiminde ve testis biyopsi örneklerinde kullanımı fertilizasyon oranlarını iyileştirici yönde etki göstermektedir. Bu projede Pentoksifilin ve Platelet Aktive Edici Faktör (PAF) uygulaması sonrasında Sperm Kromatin Dağılımı (SCD) metodu ile DNA hasarının incelenmesini ve sonuçların kıyaslanmasını amaçladık.
İnsan endometriyal kanser hücrelerinde östrojenin konsantrasyona bağlı etkilerinin incelenmesi
Östrojenin insan uterusunda endometriyal hücrelerin büyüme ve gelişmesini uyardığı bilinmektedir. Östrojenin endometriyal hücreler üzerindeki etkilerini karakterize etmek için iyi diferansiye insan endometriyal kanserinden üretilmiş Ishikawa hücre soyunu kullandık. Önce 17-ß-östradiol (östradiol)'ün hücre yaşamsallığı üzerine olan etkisini tripan mavisi alma deneyi ile test ettik. İlginç olarak, fizyolojik serum düzeyinin üstündeki östrojen konsantrasyonlarında, östradiol (1-25 ?M) düşük serum ortamında Ishikawa hücrelerinde konsantrasyona bağlı hücre ölümüne yol açtı. İmmünositokimyasal boyama ile gösterilen prolifere hücre nükleer antijeni (PCNA) ekspresyonu ve 5- bromo2'-deoksi-üridine (BrdU) inkorporasyon testleri benzer konsantrasyonlardaki östradiolün hücre büyümesini inhibe ettiğini ortaya koydu. Ayrıca, terminal deoksinukleotidil-transferaz-aracılı deoksiüridin trifosfat nick-end işaretleme (TUNEL) analizi ile östradiol tarafından uyarılan hücre ölümünün apopitozun karakteristik belirtileri olan sitoplazma çekilmesi, kromatin yoğunlaşması, ve DNA fragmantasyonu gösterdiğini ortaya koyduk.Bulgularımıza göre, östradiolün yüksek konsantrasyonlarda, menopozdaki düşük östrojen içeren ortamı taklit eden düşük serum ortamında Ishikawa hücrelerinde apopitoza yol açması, yüksek konsantrasyonlarda östrojenin postmenopazal kadınlarda oluşan hormona bağlı endometriyum kanserinin gerilemesine neden olabileceğini ortaya koydu.
Meme kanseri hücre soylarında ß katenin ve proliferasyon ilişkisi
ÖZETBu çalışmada meme kanseri hücre soyları MDA-MB 231, MCF-7 ve T47D hücrelerinde ß katenin ve fosfo ß katenin ekspresyonu immünositokimyasal olarak incelendi. MDA-MB 231 hücrelerinde nükleer lokalizasyonlu ß katenin ekspresyonu saptandı. Fosfo ß katenin ekspresyonu bazı hücrelerin nukleus ve nukleusa yakın bölgelerinde izlendi. MCF-7 hücrelerinde ß katenin ekspresyonu hücre membranında lokalize idi, fosfo ß katenin ekspresyonu ise gözlenmedi. T47D hücrelerinde ß katenin ekspresyonu hücre membranında lokalizasyon gösterirken, fosfo ß katenin ekspresyonu az sayıda hücre membranında zayıf olarak izlendi. Hücrelerin proliferasyon düzeyi BrdU işaretleyicisi kullanılarak immünositokimyasal olarak incelendiğinde MDA-MB 231 hücrelerinin proliferasyon oranının en yüksek oranda olduğu gözlendi. En düşük proliferasyon oranı ise T47D hücre soyunda tespit edildi.Sonuç olarak, MDA-MB 231 hücre soyunda ß katenin ekspresyonunun nukleusta lokalize olması ve proliferasyon hızının daha yüksek olması bu hücrelerin MCF-7 ve T47D hücrelerine göre daha malign karakterde olmasıyla uyum göstermektedir.
Oksijen konsantrasyonunun implantasyon öncesi embriyo gelişimi ve gebelik oranı üzerine etkisi
Fertilize oosit dişi genital kanallar içerisinde, %5 O2 konsantrasyonu etkisi altında bulunmaktadır. Üremeye yardımcı tedavi yöntemlerinden biri olan mikroenjeksiyon yönteminde embriyolar in vitro ortamda atmosferik oksijene (%20 konsantrasyonda) maruz kalabilmektedirler. Bu oranın olası olumsuz etkilerini ortadan kaldırabilmek amacıyla O2 kontrollü inkübatörler üretilmiştir.Bu çalışmada, çocuk sahibi olmak isteyen infertil çiftlerin tedaviye alınmasını takiben mikroenjeksiyon işlemi uygulandı. Elde edilen embriyolar randomize şekilde %20 ve %5 konsantrasyonda O2 içeren inkübatörlerde ayrı ayrı inkübe edildi. Mikroenjeksiyondan sonraki birinci günde, üçüncü günde ve uygun vakalarda beşinci günde kontrol edilen embriyolar, skorlanarak fertilize oosit sayısı, üçüncü günde blastomer sayısı, üçüncü günde fragmantasyon, üçüncü gün iyi kalite embriyo sayısı, üçüncü gün kompaktlaşma, beşinci gün blastosist oluşturma, beşinci gün iyi kalite iç hücre kütlesi, beşinci gün iyi kalite trofoblast, implantasyon ve gebelik oranları bakımından karşılaştırıldı. Sonuçlar Mann-Whitney U testi ile değerlendirildi. Buna göre üçüncü günde kompaktlaşma oranı, beşinci gün blastosist oluşturma oranı ve beşinci günde iyi kalitede iç hücre kütlesine sahip olma oranı %5 O2 grubunda istatistiksel olarak anlamlı düzeyde daha yüksek bulundu (p<0.005). Beşinci günde iyi kalitede iç hücre kütlesine sahip olma oranındaki anlamlılık ileri düzeydeydi. Diğer parametrelerde fark gözlenmedi. İmplantasyon oranı %5 O2 grubunda daha yüksek olmasına karşın bu fark anlamlılık düzeyinde değildi.Bu bulgular %5 O2 konsantrasyonu grubunda elde edilen embriyoların daha kaliteli olduğunu, bu etkilerin özellikle üçüncü günden sonra morula ve blastosist aşamalarında belirgin olduğunu, fakat bu durumun embriyo ve gebelik elde etme oranlarını etkilemediğini göstermiştir. Yine de embriyo kalitelerindeki bu farkın uzun dönem etkilerini inceleyen ileri araştırmaların yürütülmesi gerekmektedir.
Bazal folikül stimülan hormon düzeyinin intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu sonuçlarıyla ilişkilendirilmesi
İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) erkek kaynaklı infertilite tedavisi için yaygın olarak kullanılan yardımcı üreme tekniğidir. Yardımcı üreme tekniklerinde amaç, uygun tedavi protokolu ve yöntemleri kullanarak kaliteli gamet hücreleri ile embriyo ve gebelik elde edilmesidir. Yaşla birlikte overlerdeki germ hücre havuzu azalmaktadır. Bununla birlikte kadınlarda ilerleyen yaş ile paralel olarak azalan over rezervi, gonodotropin stimülasyonuna yanıtın azalmasına neden olmakta ve tedavide başarı şansını olumsuz olarak etkilemektedir. Yıllar içerisinde over progresif olarak folikül havuzunu kaybeder ve inhibin seviyesi düşer, buna karşılık adenohipofizden folikül stimülan hormon (FSH) salınımı artar. Bu nedenle günümüzde erken fazda ölçülen bazal FSH değerleri over rezervinin önemli bir belirteci olarak kabul edilmektedir. FSH değeri, oosit rezervinin yanı sıra kaliteli oosit ovulasyonu açısından önem taşır. Bazal FSH ölçümlerinin in vitro fertilizasyon (IVF) uygulamalarında gebelik sonuçları üzerine etki eden önemli bir belirteç olarak kullanılabileceğini bildiren pekçok çalışma mevcuttur.Bu çalışmada, kadın hasta bazal FSH düzeyinin ICSI sonuçları üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. ICSI tedavisine alınan 99 çift çalışma grubumuza dahil edildi. Hastalar bazal FSH <10 IU/ml ve FSH >10 IU/ml olan kadın ve normospermili erkek hastalar ile bazal FSH <10 IU/ml, FSH >10 IU/ml olan kadın ve oligospermili erkek hastaların oluşturduğu dört grup altında toplandı. Bazal FSH değeri <10 IU/ml olan normospermili ve oligospermili gruplarda, toplanan oosit sayısı ve metafaz II (MII) oosit sayısı, FSH değeri >10 IU/ml olan her iki gruba göre artmış olarak bulundu ve gruplar arası istatistiksel anlamlılık izlendi. Metafaz I (MI) ve germinal vesikül (GV) içeren oosit gelişimi, fertilizasyon oranları ve takiben elde edilen embriyoların 2. ve 3. gün iyi ve kötü kalite embriyo oranları arasında istatistiksel bir anlamlılık saptanmadı. Gebelik oranları bazal FSH < 10 IU/ml olan normospermili grupta 33.3, oligospermili grupta 40.0, FSH >10 IU/ml olan gruplarda ise sırasıyla 18.8 ve 26.7 olarak bulundu. Bazal FSH değerleri >10 IU/ml olan grupta gebelik oranları düşme göstermesine karşın istatististiksel olarak anlamlılık tespit edilmedi.
Endometriyum hücrelerinde hormonlara bağlı ß-katenin ve nükleer faktör ?B (NF-?B) düzeylerindeki değişiklikler
Bu çalışmada in-vitro endometriyum hücre modelinde, progesteron ve östrojen hormonlarına bağlı olarak gelişen endometriyal siklus evreleri ve sinsistyotrofoblastlarca sentezlenen insan koryonik gonatotropin hormonuna bağlı olarak ß-katenin ve nükleer faktör ?B (NF-?B) sinyal yolakları ile hücre proliferasyonunda meydana gelen değişiklikler immünositokimyasal olarak incelendi.Hücre proliferasyonunun değerlendirilmesinde S fazına özgü bir işaretleyici olan bromodeoksiüridin (BrdU) immünositokimyası uygulandı. Östrojen inkübasyonu sonrasında BrdU inkorporasyonunda artış izlenirken, progesteron ve insan koryonik gonatotropini uygulaması sonrasında hücre proliferasyon oranlarında bir değişiklik izlenmedi. Endometriyal hücrelerde, plazma membranının intraselüler sınırları boyunca belirgin ß-katenin ekspresyonu izlendi. Östrojen ve progesteron hormonlarıyla inkübasyon sonrasında mevcut ß-katenin ekspresyonunda bir değişiklik izlenmedi. İnsan koryonik gonatotropini (HCG) ile inkübasyon sonrasında ise membran yerleşimli ß-katenin ekspresyonunun azaldığı izlendi. NF-?B aktivitesi, östrojen ve HCG uygulanan deney grubu hücrelerde kontrol grubuna benzer bulundu. Ancak progesteron uygulanan grupta sitoplazmik NF-?B ekspresyonunda artış izlendi.Çalışmamız sonucunda; östrojen hormonu inkübasyonuyla artan S faza özgü BrdU pozitif hücre oranı bu hormon kontrolündeki siklus evresiyle uyumlu bulundu. Plazma membranında lokalize olan adezyon molekülü ß-katenin ekspresyonunun, insan koryonik gonadotropini etkisiyle azaldığı belirlendi. İnflamasyon kontrolünde rol oynayan ve steroidlerle etkileşen NF-?B ekspresyonunun, progesteron hormonuyla ilişki gösterdiği ancak sinsityotrofoblastlar tarafından salınan insan koryonik gonadotropininden bağımsız bir etki gösterdiği sonucuna varıldı.