Bacillus simplex BCHCNZ282B'den α-amilaz saflaştırılması ve karakterizasyonu

Bu çalışmada Diyarbakır'ın Ergani ilçesinde bulunan Makam Dağı'ndan toprak örnekleri alındı. Topraktan alınan örneklerden bakteri izolasyonu gerçekleştirildi. Toprak örneklerinden elde edilen izolatı tanımlamak amacıyla biyokimyasal testler ve 16S rRNA analizleri yapıldı. Yapılan analizler sonucunda izolat Bacillus simplex BCHCNZ282B olarak tanımlandı. Bacillus simplex BCHCNZ282B tarafından ekstraselüler olarak salgılanan α-amilaz üretiminin optimum koşulları belirlemek amacıyla farklı parametrelerin etkisi araştırıldı. Bakteri üremesine ait optimum koşulların 12.saat, 37°C ve pH 7,0 olduğu belirlendi. Maksimum enzim üretiminin gerçekleştiği süre 36. saat olarak belirlenerek bakteri üretimi gerçekleştirildi. 36 saat üretilen bakteri kültüründen alınan üst sıvıda α-amilaz aktivite tayini yapılarak enzimin optimum sıcaklık ve pH'sının sırasıyla 50°C ve pH 7,0 olarak tespit edildi. Enzim üretimi üzerine %1 oranında farklı karbon, azot kaynakları ve besi yerlerinin etkisi incelendi. Karbon kaynaklarından sükrozun enzim üretimini inhibe ettiği, azot kaynaklarının enzim üretimine etki etmediği tespit edildi. Maksimum enzim üretiminin gerçekleştiği besiyerinin NB (Nutrient Broth) besiyeri olduğu tespit edildi. Bacillus simplex BCHCNZ282B tarafından üretilen α-amilaz %80 amonyum sülfat [(NH4)2SO4] çöktürmesi, diyaliz ve nişasta afinite kromatografisi ile %19,50 verimle 6,13 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan α-amilazın SDS-PAGE ile molekül ağırlığı ~70 kDa olarak belirlendi. Saflaştırılan α-amilaz aktivitesi üzerine EDTA, PMSF, 2-Merkaptoehtanol, Etanol ve Metanol gibi bazı inhibitörlerin etkisi araştırıldı. 5 mM, 10 mM EDTA (sırasıyla %79, %84) ve 10 mM PMSF'in (%61) enzim aktivitesinde güçlü bir inhibisyona neden olduğu belirlendi. Saf α-amilaz aktivitesi üzerine 1,5 mM konsantrasyonundaki ZnCl2, HgCl2, CuCl2, MgCl2, CaCl2 ve MnCl2 gibi bazı metallerin etkisi araştırıldı. MgCl2 (%115) ve MnCl2 (112)'nin enzim aktivitesini arttırırken kontrolle karşılaştırıldığında HgCl2 (85)'nin enzim aktivitesini az da olsa inhibe ettiği tespit edildi. Saf α-amilaz aktivitesi üzerine %0,5'lik Tween-40, Tween-60, Tween-80, TritonX-100, SDS, Brij ve içeriğinde enzim bulundurmayan ticari olarak temin edilen Omo matik gibi bazı deterjanların etkisini araştırıldı. SDS'in (%20) enzim aktivitesinde güçlü bir inhibisyona neden olduğu tespit edildi. Saf α-amilaz 60 dk boyunca pH 8,0 ve 40°C-50°C'de stabilite gösterdiği tespit edildi. Saf α-amilazın Km ve Vmax değerleri Lineweaver–Burk plot'a göre sırasıyla 0,002 mM ve 2,125 μmol/dk. olarak hesaplandı. Anahtar Kelimeler: Bakteri izolasyonu, Bacillus simplex, α-Amilaz, Saflaştırma, Nişasta afinite kromatografisi