Testing of ompa signal peptide for bile salt hydrolase (BSH) recombinant protein secretion in bacterial expression system

Sinyal peptit (SP) adı verilen spesifik hedefleme dizisi proteinleri, prokaryotik ve ökaryotik hücrelerin salgı yoluna yönlendirir. 25-30 kalıntıdan oluşan tipik bir sinyal peptidi, proteinlerin N amino-terminal bölgesinde bulunur ve protein translokasyonunda görev alır. Temel olarak SP'nin yapısı üç ana bölümden oluşur: pozitif yüklü alana sahip N bölgesi, hidrofobik bir çekirdek olan H bölgesi ve kesilme bölgesi olan C bölgesidir. Sinyal peptidazları, C-bölgesine bağlanarak proteini salgı yolunda serbest bırakan enzimlerdir. Escherichia coli'nin salgılanabilir rekombinant protein üretim yeteneği; üretim maliyetini ve sonraki işlem basamaklarını en aza indirdiği için biyoteknoloji endüstrisi için çok önemlidir. Bununla birlikte, rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretiminde inklüzyon cisimciklerinin oluşumu veya proteazlar yoluyla protein bozunması gibi çeşitli engellerle karşılaşılabilinmektedir. Bu yüksek lisans tez çalışmasında, OmpA SP'nin E. coli'de rekombinant safra tuzu hidrolaz (BSH) üretimi için bir pET ekspresyon sistemi üzerindeki salgı etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. OmpA sinyal peptidinin salgılama verimliliğini göstermek için, bsh ve OmpA SP kodlayan genler pET-28b(+) plazmit DNA'sına klonlandı ve elde edilen pEDE3 klonunun E. coli BLR(DE3) hücrelerinde eksprese edilmiştir. Çalışmada, OmpA SP'nin salgılama etkisi direkt plaka yöntemi ile gözlemlenirken, BSH enzimlerinin ifade seviyeleri SDS-PAGE analizi ile tespit edilmiştir. Doğrudan plaka yöntem sonuçları da OmpA ve bsh geni içeren pEDE3/BLR(DE3) klonunun ortama BSH enzimi salgıladığını göstermiştir. Ancak, SDS-PAGE sonuçları ise 35-42 kDa boyutundaki çözünür BSH proteinlerinin poliakrilamid jel üzerinde görünür olmadığını göstermiştir. Çalışma sonucunda elde edilen bu veriler, OmpA SP içeren pEDE3 klonunun az miktarda da olsa aktif bir BSH proteini üretim kapasitesine sahip olduğunu göstermiştir.