Bazı basil türlerinin β-galaktosidaz gen ve enzimi üzerine çalışmalar

Çalışmamızda Bingöl Binkap sıcak su kaplıcasından izole edilen Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK'nın intrasellüler β-Galaktosidaz gen ve enzimi üzerine çalışmalar yapılmıştır. β-Galaktosidaz geni için tasarlanan bazı spesifik primerler kullanılarak PCR yardımıyla bu genin amplifikasyonu gerçekleştirilmeye çalışılmıştır. Her üç bakterinin β-galaktosidaz gen varlığının tayini için farklı primerler kullanarak yapılan PCR ürünleri incelendiğinde üç genin ürününün de ~2.4 kb olduğu tespit edildi. Enzim üzerine yapılan sıcaklık ve pH'nın etkisi 25-65˚C ve pH 4.0-11.0 aralığında incelendi. Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK için optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 45˚C, pH 6.0 ve 55˚C, pH 6.0 olarak bulundu. Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK enzimi için termal stabiliteler sırasıyla 40-50˚C ve 45-60˚C aralıklarında 30-120dk. da incelendi. Bacillus subtilis 4NK'nın termal stabiliteye sahip olduğu bulundu. Bacillus paralicheniformis 5NK termal stabiliteye sahip olduğu ancak 55˚C de aktiviteyi kısmen koruduğu 60˚C de ise koruyamadığı bulundu. Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK için amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz yoluyla kısmi olarak saflaştırma işlemi uygulandı. Bu saflaştırma sonucunda Bacillus subtilis 4NK diyaliz sonrasında enzimin verimi %85.2, saflaştırma katsayısı da 2.8 olarak bulundu. Bacillus paralicheniformis 5NK verimi %76.8, saflaştırma katsayısı 2.0 olarak bulundu. Enzim üzerine bazı kimyasal, metal ve şelatörlerin etkisi denendi. Bacillus subtilis 4NK β-galaktosidazı için bu kimyasallardan PCMB (4-kloro civa benzoik asid)'in çok yüksek oranda, DTT, PMSF ve NEM'in düşük oranda inhibisyona yol açtığı, iodoasetamid' in ise enzim üzerine ciddi etkisi olmadığı bulundu. Bacillus paralicheniformis 5NK β-galaktosidazı için bu kimyasallardan iodoasetamid ve PCMB'in yüksek oranda inhibisyona neden olduğu, PMSF'nin 10 mM da yüksek düzeyde inhibisyonuna neden olduğu ve NEM'in 5 ve 10 mM' da kısmı inhibisyonuna neden olduğu bulundu. DTT'nin ise enzim üzerine önemli oranda etkisi olmadı. Bacillus subtilis 4NK β-galaktosidazı için yapılan incelemeler sonucunda düşük konsantrasyonlarda CoCl2 ve MnCl2'ün (1ve 2.5 mM) yüksek oranlarda enzimi aktive ettiği bulundu. CuCl2 ve CdCl2 yüksek konsantrasyonlarda (10 ve 20 mM) inhibisyona neden oldu. EDTA'nın ise tüm konsantrasyonlarda enzimi aktive ettiği bulundu. Bacillus paralicheniformis 5NK β-galaktosidazı için yapılan incelemeler sonucunda birçok konsantrasyonda CuCl2 ve CdCl2'ün yüksek oranlarda enzimi inhibe ettiği bulundu. EDTA'nın ise enzimi aktivasyonunda ciddi anlamda etki etmediği bulundu. NB besiyerinde %1 laktozlu ve laktozsuz besiyerleri kullanılarak 6-48 saat aralığında kültüre alınan Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK bakterilerinin çoğalması ve enzim üretimi üzerine laktozun etkisi incelendi. 4NK bakteri varyetesinde laktozlu ortamda 24. saatten sonra bakteri çoğalmasında artış olduğu bulundu. Fakat 5NK bakteri çoğalması açısından laktozlu ortamda laktozsuz ortama göre değişiklik olmadı. Her iki bakteri için de laktozlu ortam enzim üretimini arttırdığı bulundu. Enzimin Km ve Vmax değerlerini bulmak için farklı oNPG konsantrasyonları kullanıldı. Km ve Vmax değerleri 4NK ve 5NK için sırasıyla; 23.80 mM, 1.978 abs/dk. ve 5.61 mM, 1.869 abs/dk olarak bulundu.