Buğdayda (Tiriticum aestivum L.) protoplast izolasyonu, kültürü ve bitki regenerasyonu

Yeni buğday çeşitlerinin geliştirilmesinde biyoteknolojik yöntemlerin uygulanabilmesindeki basan öncelikle en uygun kallus, hücre süspansiyon kültürü, protoplast ve bitki regenerasyonunun gerçekleştirilmesine bağlıdır. Bu çalışmada, beş hexaploid buğday (Triticum aestivum L.) çeşidinin (Seri 82, Panda, Shafır, Gemini, Çukurova 86) olgunlaşmamış ve olgun embriyolarının embriyogenik kallus, hücre süspansiyon kültürü, protoplast ve bitki regenerasyonu kapasiteleri belirlenmeye çalışılmıştır. Öncelikle, döllenmenin gerçekleşmesinden yaklaşık 15 gün sonra alman olgunlaşmamış buğday embriyoları değişik 2,4-D (lmg/1, 2mg/l, 3mg/l, 5mg/l) konsantrasyonları içeren MS (MÜRASHIGE ve SKOOG, 1962); LS (LINSMAIER ve SKOOG, 1965), B5 (GAMBORG B5, 1975), N6 (MOROCZ ve ark., 1990) ortamları üzerinde, olgun embriyolar ise yine değişik 2,4-D (lmg/1, 3mg/l, 5mg/l, 8mg/l) konsan rrasyonl arı içeren MS, LS, B5, N6 oramlan üzerinde kültüre alınmışlardır. Olgunlaşmamış ve olgun buğday embriyoları kültüre alındıkları bütün ortamlarda farklı oranlarda kallus oluşturmuşlardır. Döllenmenin gerçekleşmesinden yaklaşık 15 gün sonra alınan olgunlaşmamış embriyolar yüksek oranda embriyogenik kallus oluştururlarken, olgun embriyolarda bu oran oldukça düşük olmuştur. Bununla birlikte kallus oluşumu yönünden olgunlaşmamış embriyolar 2mg/l 2,4-D, olgun embriyolar ise 5mg/l 2,4-D içeren MS ve B5 ortamlarında diğer ortamlara göre daha iyi sonuç vermişlerdir. Olgunlaşmamış ve olgun embriyolardan kallus oluşumuna ortama ilave edilen organik maddelerin etkilerini belirleyebilmek için patates ekstraktı, buğday nişastası, kazein hidrolizat ve glutamin içeren MS ortamlarında kültüre alınmışlardır. Kültüre alındıkları ortamlara ilave edilen organik maddeler bütün çeşitlerde kallus oluşumunu önemli ölçüde artırmıştır. Bu nedenle elde edilen119 kalkışların altkültürleri 2mg/l 2,4-D, 100mg/l kazein hidrolizat, 500mg/l glutamin içeren MS ortamları üzerinde yapılmıştır. Embriyogenik hücre süspansiyon kültürleri, Seri 82 buğday çeşidinin olgunlaşmamış embriyolarından elde edilen beyaza yakın renkteki, kolay dağılabilen, hızlı gelişen embriyogenik kalluslarından oluşturulmuştur. Hücre hacimi artışlarını (%HHA) belirleyebilmek için Seri 82 çeşidinin embriyogenik hücre süspansiyon kültürleri kazein hidrolizat, glutamin ve asparagin içeren sıvı MS ortamlarında kültüre alınmışlardır. Bu hücreler 100mg/l kazein hidrolizat, 500mg/l glutamin ve 150mg/l asparagin içeren ortamlarda yüksek oranda hücre hacimi artışı (%HHA) göstermişlerdir. Protoplast izolasyonunda Seri 82 buğday çeşidinin hızlı gelişen hücre süspansiyon kültürleri kullanılmıştır. VASIL ve ark., (1990) tarafından kullanılan enzim solüsyonunda, 6 saatlik inkübasyon sonunda, 1 gram hücre kültüründen 2x10 protoplast izole edilmiştir. Hücre bölünmesi ve kaplama etkinliği üzerine hücre kültürünün farklı altkültür sürelerinin, farklı protoplast yoğunluğunun, sıvı ve farklı agaroz konsantrasyonlarının etkileri karşılaştırılmış ve hücre altkültürünün 3. ve 5. günlerinde alınan, 1x1 06 prtoplast/ml yoğunlukta, 0.5 mg/1 2,4-D içeren MS ortamında kültüre alman protopl astların yüksek oranda bölünme ve kaplama etkinliğine sahip oldukları görülmüştür. Kültüre alındıktan 4-5 hafta sonra oluşan mikrokalluslar somatik embriyo ve bitki regenerasyonu için değişik konsantrasyonlarda oksin (0.1-0.5mg/l 2,4-D; 0.1mg/l IAA; 0.1mg/l NAA) ve sitokinin (lmg/1 BAP; lmg/1 kinetin) içeren MS ortamlarında kültüre alınmışlardır. Kültüre alındıktan yaklaşık 1 6-20 hafta sonra, mikrokalluslardan 0. lmg/1 IAA, lmg/1 BAP, lmg/1 kinetin içeren MS ortamında %38.7 oranında bitki regenere edilmiştir. Hücre süspansiyon kültürlerinde ve regenere edilen bitkilerde yapılan sitolojik çalışmalarda, hücre süspansiyon kültürlerinde %52 oranında kromozom120 kayıpları, %2 oranında kromozom fazlalıkları, %46 oranında 2n=42 normal kromozom sayısı gözlenmiştir. Protoplastlardan regenere edilen bitkilerde ise 2n=42 normal kromozom sayısı gözlenmiş, fakat bazı bitkilerde geniş yaprak ayası, aşın kardeşlenme, albino bitki ve erken dönemde içi boş başakçık oluşumu gibi anormalliklere rastlanmıştır. Mezofil protoplastlannm izolasyonunda Seri 82 buğday çeşidi in vitro bitkilerinin yapraklan kullanılmıştır. Fide elde etmek için buğday tohumlan yüzelsel sterilizasyona tabi tutulduktan soma in vitro 'da kültüre alınmıştır. 7-8 günlük buğday fidelerinin yaprakları 1-2 mm kalınlığında kesilerek WATANABE ve ark., (1988) tarafından kullanılan enzim solüsyonuna konulmuş ve 3 dakika süre ile vakum altında tutulmuştur. Daha sonra 25°C'de, 1500 lux işık altında enzim solüsyonu içerisinde inkübe edilmiştir. 7 saatlik inkübasyon sonunda 1 gram yapraktan 6x1 05 protopalst izole edilmiştir. İzole edilen mezofil protoplastlart farklı ortamlarda kültüre alınmışlardır. Dört haftalık inkübasyon sonunda, hücre bölünmesi ve dolayısıyla da bitki regenerasyonunun ilk aşamalarından olan mikrokallus oluşumu gözlenmemiştir.