Erkek germline kök hücre-benzeri hücrelerin olgun sperme ın vitro farklılaşması ve ın vivo spermatogenez restorasyonuna etkisi

Germline kök hücresi (GKH), germ hattı gelişimi sırasında kendini yenileyerek veya farklı evre/alt tipte kök hücrelere dönüşerek daha fazla kök hücre üreten ve yavru oluşturmak için spermatozoa ve ovaya farklılaşan benzersiz bir hücre türüdür. Testis biyopsisinden elde edilen spermatogonyal kök hücreler (SKH)/GKH'ler veya yetişkin dokulardan elde edilen uPKH'lerden türetilen primordiyal germ hücresi-benzeri hücreler (PGHBH), Klinefelter sendromu gibi genetik hastalıklara veya başka nedenlere bağlı non-obstrüktif azoospermik yetişkin erkeklerde ve radyoterapi/kemoterapi alacak kanser teşhisi konmuş prepubertal erkek çocuklarında spermatogenez restorasyonu amacıyla otolog transplantasyon için veya in vitro spermatogenez için kullanılabilirler. Gen mutasyonları taşıyan hastaların GKH'leri veya PGHBH'leri, CRISPR/CAS9 teknolojisi kullanılarak transplantasyondan önce düzeltilebilir. Bununla birlikte, uPKH'lerin in vitro gametogenez alanına katkısı hafife alınamasa da, yeniden programlama ile ilişkili epigenetik modifikasyonlar açısından güvenliği ile ilgili kaygılar bulunmaktadır. Bu çalışmada ilk kez CD49f+ GKH'lerin GDNF, EGF, bFGF, IGF2, SCF ve mLIF varlığında pluripotensi belirteçlerinin ifadelerinde anlamlı artış ve alkalen fosfataz aktivitesi gösteren GKHBH'lere dönüşebileceğini gösterdik; özellikle, bu AP+CD49f+ GKHBH kolonileri, >%95 GATA4+ testiküler somatik hücre (TSH) besleyici tabakası üzerinde iki aydan uzun bir süre çoğaltılabildi. AP+CD49f+ GKHBH'ler, TGF-β/Aktivin/Nodal yolu inhibitörü, SB431542 ve ardından retinoik asit uygulandığında in vitro ortamda mayozu tamamladı ve kuyruk gelişimi olan sperm-benzeri hücrelere farklılaştı. SB431542 ön aşamasından sonra leptoten spermatositler gözlenmiş olsa da, retinoik asidin kombine etkisi üzerine mayozun daha ileri aşamasındaki pakiten ve diploten spermatositler ile sperm-benzeri hücrelerin bir arada bulunduğu heterojen bir popülasyon saptandı. Elde edilen sperm-benzeri hücreler, intrasitoplazmik enjeksiyondan sonra blastokist oluşumunu tetikleyebildi. GKHBH'lerin ve Sertoli hücrelerince zengin TSH'lerin germ hücre ablasyonu yapılmış fare testislerine ko-transplantasyonunun ardından, tübül başına düşen DDX4+SYCP3+ hücreler, yalnızca TSH transplante edilenlerden daha yüksekti. Sonuç olarak, TSH'ler bozulmuş nişi yeniden oluşturarak endojen spermatogenezi yeniden başlatabilirken, eksojen GKHBH'ler sağlıklı niş hücreleri varlığında başarılı bir şekilde spermatogenezi tamamlayabildi. Genel olarak yaklaşımımız, tanımlanmış kültür koşulları altında GKH'lerin fonksiyonunu ve canlılığını kaybetmeden sayıca arttırılabileceğini ve GKH-GKHBH hücre dönüştürme yöntemimizin, Oct4a, Sox2, Nanog, SSEA-1 pluripotensi belirteçlerinin ekspresyonunu upregüle edebileceğini, GKHBH'lerin in vitro olarak fonksiyonel sperm-benzeri hücrelere farklılaşabileceğini ve somatik niş hücresi desteğiyle de in vivo spermatogenezi yeniden başlatabileceğini göstermektedir.