Farklı habitatlardan izole edilen aktinomiset genomlarında yeni ilaç adaylarının taranması

Yeni biyoaktif bileşiklerin keşfi için, biyoteknolojik potansiyele sahip doğal ürünlerin mikroorganizmalardan eldesi son zamanlarda oldukça ilgi uyandıran bir araştırma konusudur. Karasal ve sucul habitatlardan izole edilen aktinomisetler yeni biyoaktif doğal ürünlerin keşfi için önemli kaynaklardan biridir. Bu potansiyellerinden ötürü aktinomiset genomlarında doğal ürün biyosentez genlerinin taranması en güncel yaklaşımlardan biridir. Son yıllarda doğal ürün araştırmalarında farklı yöntemler uygulanmaktadır. Bu yöntemlerden biri dejenere polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) primerleri ile doğal ürünlerin biyosentetik gen kümelerinin taranmasıdır, diğeri ise genom dizilimi bilinen izolatlarda doğal ürün gen kümelerine ait biyoinformatik verilerin, kimyasal verilerle birlikte değerlendirilmesi ilkesine dayalı kütle spektroskopisi (MS) temelli genom taramalarıdır. Bu çalışmada karasal (Streptomyces) ve deniz (Salinispora) aktinomisetlerinin doğal ürün gen kümelerinin sırasıyla, PCR ve MS temelli genom tarama yöntemleri ile taranması sonucunda hem genetiksel hem de kimyasal olarak doğal ürün sentezleme potansiyelleri araştırıldı. Çalışmanın ilk kısmında endemik bitki kök çevresi Streptomyces izolatlarının NRPS ve PKS-I genlerinin sırasıyla, adenilasyon (A) ve ketosentaz (KS) domainleri, dejenere primerler kullanılarak PCR ile tarandı. PCR amplifikasyonları, klonlama ve DNA dizi analizleri sonucunda izolatların tümünün (altmış beş) genomunda A domaini, yaklaşık % 80'inkin de ise KS domaini tespit edildi. A ve KS domaini DNA dizilimlerinin BLASTX analizlerine göre, elde edilen NRPS fragmentlerinin %34'ünün, PKS fragmentlerinin ise %56'sının Genbankasındaki en yakın akrabaları ile %70'in altında benzerlik gösterdiği görüldü. Özellikle, NRPS A domainlerinin büyük bir çeşitliliğe sahip olması bunların, farklı biyosentetik metabolik yolların sentezinde görev aldığını düşündürdü. Ayrıca A domain veri tabanında incelenen klonların büyük bir bölümünde A domain motiflerinin substratları ilgili program tarafından tahmin edilemedi. Bu bulgu ilgili A domainlerinin yeni aminoasitleri substrat olarak tanıyabileceği anlamına gelmektedir. Bununla ilişkili olarak yeni NRPS ürünü olabileceğini düşündürmektedir. Zorunlu deniz aktinomisetlerinden Salinispora cinsi üyeleri doğal ürün araştırmalarında kullanılan model mikroorganizmalardandır. Genom dizilimi bilinen otuz Salinispora izolatının genomları, doğal ürün gen kümelerini araştırmak için MS temelli genom tarama yöntemi ile tarandı. Biyoinformatik incelemeler sonucunda izolatların NRPS, PKS, terpen, indol, lantibiyotik, aminoglizokit ve siderefor gibi farklı doğal ürün ailelerine ait bileşikleri sentezleyebilme potansiyeline sahip oldukları tespit edildi. Bununla birlikte; hem dereplikasyon hem de kimyasal network analizleri için, Salinispora izolatı ham ekstraktlarından elde edilen sıvı kromatografisi/kütle spektroskopisi (LC/MS/MS) verileri, GNPS (Global Natural Product Society) veritabanında incelendi. Dereplikasyon analizleri sonucunda lomaiviticin C, 7-OH-staurosporine, staurosporine ve cyanosporaside B doğal ürünlerinin izolatların ekstraktlarında bulunduğu tespit edildi. Ayrıca moleküler network analizleri ile izolatlara ait 1347 MS/MS verisinin spektral benzerliği incelendi. Bu inceleme sonucunda Salinispora tropica CNT250, Salinispora pacifica CNY703, Salinispora arenicola CNY299 ve Salinispora arenicola CNY011 izolatlarına ait spesifik MS/MS spektrumları biyoinformatik veriler ile birlikte değerlendirildi. Kimyasal ve biyoinformatik değerlendirmeler sonucunda S. pacifica CNY703'ün kültür ortamında glikolize bir bileşiğe ve bu bileşiğin sentezinden sorumlu olduğu düşünülen NRPS-PKS-I gen kümesine ulaşıldı. Bu gen kümesinin sentezlediği bileşiğin yapı aydınlatma çalışmaları devam etmektedir. Antimikrobiyal aktivite testleri sonucunda karasal izolatlardan Streptomyces sp. CAH29'un güçlü ve geniş spektrumda biyoaktif doğal ürün sentezleme potansiyeli tespit edilmişti. Bu sebepten dolayı, bu izolatın kültür ortamındaki biyoaktif bileşiklerinin saflaştırması, kimyasal yapı analizi ve değişik biyolojik aktivite testi çalışmaları gerçekleştirildi. Spektroskopik analizler sonucunda biyoaktif bileşiğin tetrangomycin olduğu tespit edildi. Antrakinon yapısındaki bu bileşiğin Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, methicillin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve Candida albicans mikroorganizmalarına karşı, sırasıyla 14, 10, 12 ve 8 mm'lik inhibisyon zonları ile antimikrobiyal aktivite gösterdiği tespit edildi. Ayrıca tetrangomycin'in insan prostat kanseri (LNCaP) ve alveolar adenokarsinoma (A549) hücreleri üzerine sitotoksik etkisi yanısıra, düşük oranda DPPH radikalini söndürme etkisi olduğu gözlendi. Staphyloxanthin sentezinin ilk aşamasında dehidrosqualen sentaz (CrtM) enzimi görev almaktadır. Tetrangomycin'in anti-MRSA etkisinin incelenmesi amacıyla CrtM enzimi ile Docking analizleri gerçekleştirildi. Bu analizler sonucunda tetrangomycin ve pozitif kontrol dipotasyum (2-okso-2-{[3-(3-fenoksifenil) propil] amino}etil fosfonat) (830) ligandlarının dehidrosqualen sentaz CrtM enzimine bağlanma enerjilerinin birbirine yakın olduğu belirlendi. Bundan dolayı tetrangomycin'in yeni bir anti-MRSA ajan olarak kullanılma potansiyeli tartışıldı.