Farklı ovulasyon indüksiyonu protokolleri uygulamalarının sıçan over dokusunda follikül gelişimi üzerine etkilerinin immunohistokimyasal yöntemle ve ince yapı düzeyinde değerlendirilmesi

Yardımcı Üreme Teknikleri uygulamalarında, sağlıklı gebelik elde edebilmenin yüksek oranlara ulaşmasında, normal over döngüsü ve ovulasyon indüksiyonu protokollerinin over dokusunda moleküler düzeydeki etkilerinin araştırılması önemlidir. Çalışmada, normal over döngüsü ile rekombinant follikül stimüle edici hormon (rFSH) ve klomifen sitrat (KS) uygulamalarının sıçan over dokusunda kemik morfojenik proteinlerin (BMP), siklin bağımlı kinaz (cdc), konneksin (Cx) ve mitojen aktive edici protein kinaz (MAPK) dağılımlarına etkisinin immunohistokimyasal olarak ve bu dönemlerde folliküller gelişmede over dokusunda oosit ve granuloza hücrelerinin ince yapı düzeyinde, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır.Çalışmada erişkin dişi Wistar albino sıçanlar (230-280 gr), proöstroz, östroz, diöstroz, rFSH (10 İÜ, sc), KS (4mg, oral) (n: 7, herbiri) olarak 5 grupta değerlendirildi. Gruplar vajinal yayma preperatlarının Giemsa boyaması ile incelemesiyle belirlendi ve kan FSH değerleri ölçüldü. İlaç uygulamaları östroz grupta bulunan sıçanlara uygulandı. Genel anestezi uygulanan deney hayvanlarından elde edilen over doku örnekleri, ışık mikroskobik değerlendirme için %10 formalinle tespit edilerek rutin parafin doku protokolüne göre takip edildi. Elektron mikroskobik değerlendirme için doku örnekleri % 2,5'luk gluteraldehit ve takiben % 1 osmiyum tetroksit ile tespit edilerek rutin elektron mikroskop protokolüne göre takip edilerek araldit karışımına gömüldü.Parafin bloklardan alınan 5 µm. kesitler Hematoksilen Eozin'le (H.E) boyanarak, gruplarda follikül değerlendirmesi ve sayımı yapıldı. Ek kesitler anti-BMP-4, anti-BMP-6, anti-P34cdc2, anti-Cx43 ve anti-P38MAPK primer antikorlarıyla avidin-biyotin-peroksidaz yöntemi ile indirek immunohistokimyasal olarak değerlendirildi. İmmunoreaktivite şiddeti hafif, orta, şiddetli olarak belirlendi. Tüm sonuçlar, ANOVA istatistik testiyle karşılaştırmalı olarak değerlendirildi.Araldit bloklardan alınan 1 µm. yarı ince kesitler, toluidin mavisi ile boyanarak, gruplarda follikül değerlendirilmesi yapıldı. 140 nmlik ince kesitler, uranil asetat- kurşun sitrat ile kontrastlama yapılarak ZEISS elektron mikroskobunda değerlendirildi.FSH değerleri vajinal yayma sonuçları ile uyumlu olarak bulundu. H.E. boyalı preparatlarda proöstroz grupta çoğunlukla gelişmekte olan folliküller, östroz grupta Graff follikülleri ve diöstroz grupta sekonder follikül ile korpus luteum yapıları izlendi. rFSH grubunda daha fazla olmakla birlikte indüksiyon yapılan gruplarda artmış gelişen ve Graff follikül yapıları gözlendi. MAPK, Cx43, p34cdc2 immunoreaktiviteleri oosit, granüloza, teka hücrelerinde; BMP-6 oosit ve granüloza hücrelerinde; BMP-4 teka hücreleri, stromal hücreler ve germinal epitelde pozitif olarak değerlendirildi. Moleküller proöstroz dönemde hafif/orta, östroz dönemde orta/şiddetli, diöstroz grupta hafif/orta olarak değerlendirilirken, rFSH grubunda şiddetli, KS grubunda orta/şiddetli olarak değerlendirildi.Yarı ince kesiti alınan proöstroz grubunda gelişmekte olan folliküller, östroz grubunda Graff follikülü ve diöstroz grubunda korpus luteum ve sekonder follikül yapıları izlenirken, rFSH ve KS grubunda sekonder follikül ve Graff follikül yapıları değerlendirildi. İnce kesitlerde, oosit sitoplazmasında lipid damlacıkları, mitokondriyonlar; oosite ait mikrovillusların ve kumulus granuloza hücre çıkıntılarının zona pellusida içerisine yayıldığı gözlendi. Östroz, rFSH ve KS gruplarında oosit sitoplazması içinde lipid damlacıklarının ve mitokondriyonların arttığı izlenirken, diöstroz grubunda azaldığı izlendi.Normal over döngüsü süresince, FSH artışı; p38MAPK aracılığıyla oositte cAMP ve BMP-6 artışına neden olmakta ve p34cdc2 ile konneksin 43 etkileşimi sonucu ovulasyon süreci düzenlenmektedir. BMP-4 ve -6, FSH'a bağlı olarak progesteron sentezini inhibe ederek, granuloza hücrelerinin luteinizasyon sürecinde rol oynamaktadır. P38MAPK ise östradiol sentezini arttırmakta ve granuloza hücrelerinin hücre içi değişikliklerini ve yaşamını etkilemektedir. Çalışmada, uygulanan dozlarda rFSH ve KS kullanılması ile sıçan over dokusunda çok sayıda follikül gelişmeye başladığı ve rFSH'da daha fazla olmak üzere moleküllerin artarak birbirleri ile etkileşimleri yoluyla, follikül gelişimi ve oositlerin olgunlaşma sürecinde düzenleyici yönde etkili oldukları düşünülmüştür.