HIV ile enfekte olmuş hastalarda M41L direnç mutasyonunun ' Real- Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu ' ile saptanması

HIV/AIDS, Sahra-altı Afrika'da birinci, dünyada ise dördüncü sıradaki ölüm nedeni olarak bildirilmektedir. AIDS'in tedavisindeki en önemli sorunlardan birisi, antiretroviral ilaçlara karşı dirençli mutantlardır. Günümüzde rutin veya epidemiyolojik amaçlı HIV antiviral direnç testleri, yaygın olarak konvansiyonel dizi analizi yöntemi ile yapılmaktadır. Oysa, son yıllarda tedavi başarısını olumsuz etkileyebilen ve total viral popülasyon içinde azınlıkta olan ilaç dirençli mutant varyantları, konvansiyonel dizi analizine kıyasla, daha duyarlı saptayan yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmada, HIV tedavisinde ilk ve halen en önemli ilaç olan zidovudine ve stavudine direncinde en sık karşılaşılan mutasyonlardan biri olması ve gerçek zamanlı PZR yöntemiyle bu direncin daha önce ülkemizde araştırılmaması nedeniyle M41L direnç mutasyonu Nokta-Mutasyon Spesifik Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (NMS-GZ-PZR) yöntemi ile araştırıldı.Çalışmada Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Moleküler Mikrobiyoloji Laboratuarı'nda daha önce konvansiyonel dizi analizi ile (ABI Prism 310, Foster City, A.B.D.) incelenmiş, enfekte olduğu tarih bilinmeyen, 60 HIV?1 genotip B pozitif örnek kullanıldı. Center for Diseases Control'den (A.B.D.) Heneine ve arkadaşları tarafından HIV?1 genotip B'de oluşabilen dokuz ana ilaç mutasyonunu saptamak üzere geliştirilerek valide edilmiş olduğu ve konvansiyonel dizi analizine göre duyarlığının daha yüksek ve yorumunun daha kolay olduğu bildirilen NMS-GZ-PZR yöntemi, LightCycler 2.0 (Roche Applied Science, Almanya) aygıt sisteminde, M41L direnç mutasyonunu saptamak üzere önerilen primerler ve TaqMan probu kullanılarak uygulandı. RNA kalitesinin bozuk olduğuna karar verilen 3 örnek çalışma dışı bırakıldı. Öneriye uygun olarak, vahşi tip ve mutant varyantları ayırt edebilmek için, pozitiflik ölçütünü belirlemek amacıyla, total viral kopya reaksiyonu ile mutant varyant reaksiyonunun Ct değerleri (?threshold cycle?) arasındaki fark (?Ct) değerlendirildi.57 HIV?1 genotip B örnek arasından, NMS-GZ-PZR sonuçlarına göre, total viral kopya amplifikasyonunun Ct değeri 10'dan küçük olan ( yüksek kopya sayısı nedeni dilüsyon ile tekrar gerekliliği) ve 26'dan büyük olan ( düşük kopya sayısı nedeni ile belirsiz sonuç) 25 örnek, öneriye uygun olarak, pozitiflik ölçütü olarak kullanılacak ?Ct eşik değerini belirlemek için yapılan çalışmanın dışında bırakıldı. Eşik değer hesaplamasında kullanılan 32 örnek, merkezi eğilim dağılımına göre ?Ct ortanca değeri (5.81) eşik değer olarak belirlendi. Buna göre, ?Ct değeri, eşik değerin üzerinde olan olgu örnekleri, M41L mutasyonu açısından negatif kabul edildi. Bu eşik değer ölçütü ile değerlendirilen NMS-GZ-PZR sonuçlarına göre, 32 örneğin 16'sında M41L direnç mutasyonu pozitifliği saptandı. Bu örneklerin 6'sında, konvansiyonel dizi analizi sonuçlarına göre de, M41L direnç mutasyonu pozitifti. Çalışmaya alınan toplam 57 örnek arasında, konvansiyonel dizi analizi ile pozitif olduğu bildirilen 13 örnekten 7'sinin sonuçları, NMS-GZ-PZR sonuçlarına göre total viral kopya Ct'si 26'nın üzerinde olduğu için, belirsiz kabul edildi. Bu örneklerde, düşük viral yüklerine bağlı olarak yanlış sonuç verme riski nedeniyle, ön amplifikasyon aşamasından sonra, testin tekrar edilmesi önerilmektedir. Ancak daha önceki saklama koşullarında dondurulup çözünme çok olduğu için, RNA kalitesi bozulan bu örnekler tekrar edilmedi. Konvansiyonel dizi analizi ve NMS-GZ-PZR yöntemlerinden birisinin referans yöntem statüsü olmadığı için, iki yöntem arasındaki karşılaştırmalı uyuşmanın güvenirliği, kapa istatistiği ile ölçüldü. Kapa istatistiğine göre, iki yöntem arasında, orta düzeyde uyuşma (k=0.375;P<0.007) saptandı.Bilgimize göre, bu çalışma, Türkiye'de, HIV enfeksiyonunun tedavisinde kullanılan antiviral ilaçlara karşı azınlık direnç mutasyonlarını, konvansiyonel dizi analizine kıyasla daha duyarlı ve uygulaması daha kolay bir yöntemle araştırarak bildiren ilk çalışmadır. NMS-GZ-PZR yöntemi, şimdilik, bilinen tüm direnç mutasyonları arasında yalnızca bir grubunu test etmek için geliştirilmiş durumdadır. NMS-GZ-PZR yöntemi, ultra derin dizi analizi düzeyindeki duyarlılıkta, minor azınlık direnç mutantlarının önemli bir grubunun araştırılmasını sağlayabilmekte ve böylece HIV enfeksiyonu olgularında gelişen antiviral dirence ilişkin epidemiyojik dinamiklerin daha iyi anlaşılmasına ve tedavi başarısının artmasına katkıda bulunmaktadır.