ATB7B geninin transkripsiyonel regülatörlerinin genomik lokus proteomik yöntemi ile tanımlanması ve cisplatin direncine etkilerinin araştırılması

ATP7B, hücresel homeostazda hayati bir rol oynayan bir bakır pompasıdır. Bakır birikiminin toksik sonuçlarını önlemek için hücrede biriken fazla metali ekzositoz yolu ile hücreden uzaklaştırır. Yetersiz ATP7B aktivitesi, vücutta bakır toplanmasına neden olarak Wilson hastalığına neden olur. ATP7B'nin expresyonundaki artış ise tam tersine, platin bazlı ilaçların bakırla birlikte hücreden atılmasına neden olarak ilaç direncine yol açar. ATP7B'nin transkripsiyonel seviyede regülasyonunu anlamak, bu genin disregülasyonu sonucu oluşan hastalıkların mekanizmalarını anlamaya yardımcı olabilir. Metal Düzenleyici Transkripsiyon Faktörü 1 (MTF1), ATP7B'nin en çok çalışılmış transkripsiyonel düzenleyicisidir, ancak ekspresyonu, kanserlerde ATP7B ekspresyonu ile her zaman ilişkili değildir. Bir transkripsiyon faktörünün ekspresyonu her zaman hedef genin ekspresyonu ile ilişkili olmak zorunda değildir. Ancak ATP7B'nin tek bir transkripsiyon faktörü tarafından düzenlenme olasılığı da çok düşüktür, bu da ATP7B'nin düzenleyicilerinin tanımlanması gerekliliğini göstermektedir. ATP7B anlatımını düzenleyen ek faktörleri bulmak için, TRANSFAC/PROMO yazılımı kullanılarak bir in-silico analiz gerçekleştirildi ve birkaç transkripsiyon faktörünün -3000 ila +1 civarında odaklanan ATP7B promotörüne bağlanabileceği bulundu, bu da düzenleyici dizilerin en çok bu bölgede toplandığını göstermektedir. ATP7B ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyon faktörlerini tanımlamak için bu tezde "Genomik Lokus Proteomik" adlı yeni bir proximity-labeling metodolojisi kullanılmıştır. Bu teknikte, dCas9 proteini APEX2 enzimi ile birleştirilmiş ve protein, spesifik gRNA'lar aracılığıyla ATP7B promotörüne yönlendirilir. -3000 ila +1 bölgesini kapsayan gRNA'lar, T7E ve ChIP-qPCR deneyleri ile belirlendi. ATP7B promotörünün dCas9 hedefli bölgelerinin yakınındaki proteinler daha sonra APEX2 enzimi ile biyotinlendi ve streptavidin-manyetik bead ile çöktürüldü. İşaretlenen proteinler daha sonra kütle spektrometresi ile tanımlandı ve zenginleştirme puanlarına ve kanserlerde ilaç direnci ile ilişkilerine göre birkaç protein hedef olarak seçildi. ATP7B aktivitesi ile ilişkisini aydınlatmak için hedef gen PINX1 (Pin2/TRF1-Interacting Protein) analiz edildi ve bu genin aşırı ekspresyonunun ATP7B ekspresyonunda bir artışa yol açtığı gösterildi. Ayrıca, HEK293T ve Huh7 hücrelerinde PINX1 aşırı ekspresyonu, sisplatin tedavisine karşı hücre canlılığını arttırdı. Analiz sonuçları PINX1 ve ATP7B arasında transkripsiyonel bir şekilde bir bağlantı olduğunu göstermektedir. Bu ilişki hastalığın ilerlemesine sebep olabilir ve daha etkili tedaviler geliştirmek için kullanılabilir.