Limbal kök hücrelerin in vitro koşullarda üretilmesi ve karakterizasyonu oküler yüzey kök hücre tanımlanmasında yeni bir boya: ?Mitotracker deep red?

Günümüzde, limbal ve konjunktival epitelyal kök hücrelerin izole edilmesinde flow sitometrik yöntemlerin kullanılması giderek yaygınlaşmaktadır. Bu flow sitometrik yöntemlerin önde gelenlerinden bir tanesi, DNA'ya bağlanan bir boya olan Hoechst 33342 boyası kullanılarak, kök hücrelerin ayrıştırılmasıdır. Oküler yüzey kök hücreleri, sahip oldukları Adenozin trifosfat kaset bağlayıcı taşıyıcısının G2 alt tipi (ABCG2) sayesinde, bu boyayı hücre dışına atabilmektedirler. Bu hücre dışına atım kapasiteleri kullanılarak, diğer hücrelerden ayrıştırılabilen kök hücreler, literatürde yan popülasyon olarak adlandırılmaktadır. Kök hücrelerdeki ABCG2 taşıyıcısı tarafından, Hoechst 33342 boyasının hücre dışına atılımı sayesinde, bu boyanın hücre içinde birikmesi ve DNA'nın içine girmesi önlenmektedir. Hoechst 33342 boyası ultraviyole lazer (UV) ile uyarılmaktadır. Kök hücrelerin ayrıştırılmasında kullanılan bu yöntemde, Hoechst 33342 ile uzamış inkübasyon ve UV kullanılması gerekmektedir. Bu iki özellik de yöntemin en önemli dezavantajlarından olup, hücrelerde DNA hasarına yol açabilmektedir.Bu çalışmada, oküler yüzey epiteli kök hücre seçilmesinde, bir ABC taşıyıcısı ile taşınan ve 633 nm'de uyarılan ?Mitotracker deep red? (MTDR) boyasını, Hoechst 33342 boyasına alternatif yeni bir boya olarak tanımladık. Bu boya, DNA yerine mitokondride birikmekte, uygulaması çok kısa bir inkübasyon süresine ihtiyaç duymakta ve genişletilmiş bir YP seçilmesine olanak sağlamaktadır. Bu boyanın kullanımında, gerek UV lazer ihtiyacının olmaması, gerekse boyanın DNA'da birikmemesi nedeniyle hücrelerde meydana gelebilecek DNA hasarı riski azalmaktadır. Bu özellikleri sayesinde, öncül hücreler ile ileride yapılacak klinik uygulamalarda, genetik materyal hasarına bağlı oluşabilecek istenmeyen etkilerden korunmada önem taşıyacaktır.