Melatonin ve melatonin reseptörlerinin aorta ve HUVEC üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi

Zamanla insanlarda pineal bezden salgısı azalan melatonin, serebral ve periferik etkiler gösterdiği gibi vasküler etkiler de göstermektedir. Bu çalışmada melatoninin etkisi melatonin reseptör antagonistleri ile kıyaslanarak ortaya çıkan vasküler cevaplar ve hücre içi yanıtlar sıçan aortu ve Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) hücre dizisi üzerinde değerlendirilmiştir. Bu amaçla sağlıklı erkek albino Wistar sıçanlardan (350-400g), endoteli sağlam torakal aortalar çıkarıldı ve aorta halkaları inkübasyon materyaline göre dört gruba ayrıldı. Birinci grup olan, kontrol grubu aortalara hiçbir inkübasyon yapılmadı. İkinci grup non-selektif MT reseptör agonisti (10-5 M) melatonin (MLT), üçüncü grup nonselektif MT reseptör antagonisti (10-5 M) luzindol (LZL), dördüncü grup (10-5 M) MLT ve (10-5 M) LZL kombinasyonu ile inkübe edildi. İnkübasyon periodunun ardından kümülatif KCl (10-50mM) veya Phe (3x10-9-10-6M) ile elde edilen vazokonstriktif cevaplar, ayrıca Ach (10-10-10-5 M) veya SNP (3x10-9-10-6 M) ile elde edilen vazorelaksan cevaplar kıyaslandı. Veriler iki yönlü varyans analizi ve ardından Bonferroni testi (n:5) (Graph Pad) uygulanarak değerlendirildi. Endotel hücresi deneyleri için ise HUVEC hücre dizisi F12 medyumunda kültüre alındı ve inkübasyon materyaline göre 5 gruba ayrıldı. Birinci grup hiçbir inkübasyon yapılmayan kontrol hücrelerden oluşmaktadır. İkinci grup (10-10-7 M) MLT ile, üçüncü grup (10-10-7 M) MLT ve (10-5, 10-6 M) LZL ile, dördüncü grup (10-10-7 M) MLT ve (10-5, 10-6 M) 4P-PDOT ile, beşinci grup (10-10-7 M) MLT ve (10-5, 10-6 M) GR135531 ile 24 saat inkübe edilmiştir. Bu gruplara daha sonra MTT, kalsiyum miktar tayini ve total nitrat/nitrit miktar tayini yapılmıştır. Sonuçlar kontrole göre yüzde olarak verilmiş, iki yönlü varyans analizi ve ardından Bonferroni testi (n:3) yapılarak değerlendirilmiştir (Graph Pad). (10-5M) MLT inkübasyonu (3x10-7-10-5 M) Phe ve (20mM) KCl ile elde edilen vazokonstrüktif yanıtları anlamlı olarak arttırdı ve bu artış (10-5 M) LZL veya (10-5 M) MLT ve LZL kombinasyonunda görülmedi. Ayrıca 10-5 M MLT, Phe ve KCl eğrilerinden elde edilen EC50 değerlerini belirgin olarak arttırdı, bu sonuçlara uygun olarak 10-5 M LZL ve 10-5 M MLT ve LZL kombinasyonunda bu artış görülmedi. Fakat hiçbir grupta Ach ile elde edilen vazorelaksan cevaplarda belirgin bir değişiklik olmadı. 10-5 M MLT ile inkübasyon (3x10-7 and 10-7 M) SNP ile elde edilen vazorelaksan cevapları artırdı, bu sonuçlara uygun olarak 10-5 M LZL veya 10-5 M MLT ve LZL kombinasyonunda bu artmış cevaplar kontrol seviyelerine kadar azaldı. Melatoninin MT reseptörleri aracılığıyla ortaya çıkan sitotoksik etkileri olup olmadığını anlamak için HUVEC hücre dizisi kullanarak MTT testi gerçekleştirildi. 10-10-3 M MLT hücre canlılığını yüzde olarak belirgin biçimde düşürdü (sırasıyla % 60±4, 66±2, 55±1, 65±1, 64±4). fakat 10-4-10-7 M konsantrasyonlarda ise MLT hücre canlılığını kontrole göre hafif bir şekilde artırdı. 10-2 ve 10-3 M MLT?e 10-5 M LZL or 10-5 M 4P-PDOT eklenmesi hücre canlılığını belirgin olarak artırdı ve kontrol seviyelerine ulaştırdı. Benzer sonuçlar 10-1-10-3 M MLT'e 10-6 M LZL veya 10-6 M 4P-PDOT eklenerek de elde edilmiştir. Buna rağmen MLT (10-10-7 M) ile 10-5 veya 10-6 M GR135531 inkübasyonu, MLT (10-10-7 M)?e göre sitotoksisite üzerinde hiçbir fark ortaya çıkarmamıştır. MLT (10-1-10-7 M) inkübasyonu hücre içi kalsiyum miktarı yüzdesini ise artırdı ve MLT ile 10-5 veya 10-6 M LZL ve 10-5 M veya 10-6 M 4P-PDOT kombinasyonu intraselüler kalsiyum seviyesini belirgin olarak azalttı fakat MT3 reseptör agonisti GR135531 kombinasyonu ise MLT ile kıyaslandığında hücre içi kalsiyum miktarı bakımından hiçbir değişiklik göstermedi. HUVEC hücreleri ile melatonin ve melatonin reseptörlerinin NO üzerindeki etkisini anlamak amacıyla NO miktarının bir göstergesi olan total nitrit/nitrat miktar tayini yapılmıştır. 10-4 mM MLT ile azalan total nitrit/nitrat miktarı, 10-5 M 4P-PDOT veya 10-5 M GR135531 ile birlikte inkübasyon yapıldığında anlamlı artış göstermiştir. 10-5 mM MLT ile 10-5 M luzindol kombine olarak inkübe edildiğinde total nitrit nitrat miktarının 10-5 M MLT?ye göre anlamlı olarak azaldığı görülmektedir. MT reseptörlerinin vasküler etkilerinin değerlendirildiği çalışmaların çoğu ya sıçan kaudal arteri yada sıçan serebral arteri kullanılarak yapılmıştır. Kaudal arter (kuyruk arteri) sıçanda önemli görevler ifa ederken insanda kaudal ater hem çok kısa hem de etkisi çok sınırlıdır, serebral arter ise genel vasküler basıncın bir göstergesi olarak kabul edilmekten uzaktır. Dolayısıyla serebral arter veya kaudal arterde görülen etkilerin, aorta gibi özel fonksiyonları olan damarlarda dahil olmak üzere, bütün damar yataklarında aynı şekilde olması gerekir gibi bir genelleme yapmak doğru olmayabilir. Bu sebepten aortada melatonin ve melatonin reseptörlerinin etkileri ayrıca incelenmelidir. Sıçan torakal aortasında protein ve mRNA seviyesinde yanlız MT1 reseptörü bulunması; bu reseptörlerin de endotelde (Tunica adventitia) yoğunlaşması sebebiyle, bu çalışmada 10-5 M MLT, KCl veya Phe ile elde edilen vazokonstriktör cevaplar ve SNP ile elde edilen vazorelaksan cevaplar, endoteli sağlam aortada MT1 reseptörü aracılığıyla ortaya çıkmaktadır. HUVEC kullanarak elde ettiğimiz sonuçlar ise 10-10-3 M MLT'in daha çok MT2 reseptörleri aracılığıyla olmak üzere MT1/MT2 reseptörleri üstünden sitotoksik etkiler ortaya çıkardıkları sonucuna ulaşılmıştır. Ayrıca MLT hücre içi Ca2+ seviyelerini MT1/MT2 reseptörleri aracılığıyla artırmaktadır, MT3 reseptörü ise hücre içi Ca2+ miktarına etki etmemektedir. Total nitrit nitrat miktarı ölçülerek yapılan deneylerden elde edilen sonuçlara dayanarak MLT?nin HUVEC hücrelerinde NO miktarını baskıladığı ve bu etkiyi başlıca MT2 reseptörleri aracılığıyla yaptığı sonucuna ulaşılmıştır. Anahtar Kelimeler: Melatonin, melatonin reseptörleri, HUVEC, aorta, vazoreaktivite, nitrik oksit, kalsiyum, sitotoksisite.