Mezenkimal kök hücre yaşlanmasında NF-KB/P65 ve PKNOX2 protein-protein etkileşimlerinin incelenmesi

Mezenkimal kök hücreler in vitro kültürde pasajlamalar sonucu replikatif yaşlanmaya uğrayarak kök hücre özelliklerini kaybeder. Grubumuzun daha önceki çalışmalarında sağlıklı Kİ-MKH'de PKNOX2 proteini ile yapılan ko-immünopresipitasyon (ko-İP) sonrası proteomiks analizlerinde PKNOX2 ile etkileşime giren proteinler arasında yaşlanma ilişkili sekretomların ana düzenleyicisi olarak kabul edilen Nüklear Faktör-κB'nin p65 alt ünitesi (NF-κB/p65) bulunmuştur. Bu tez çalışmasında; 1) kültür ortamında yaşlandırılan Kİ-MKH'lerde PKNOX2 ve p65/RelA protein düzeylerinde değişim olup olmadığının araştırılması, 2) PKNOX2 ve NF-κB/p65 (RelA) etkileşiminin kanıtlanması ve 3) yaşlanma sürecindeki etkileşim değişimlerinin olup olmadığının incelenmesi amaçlanmıştır. Replikatif yaşlanma SA-β-Gal boyaması ve p16, p21 protein seviyeleri ile değerlendirildi. Genomik stres, γH2AX seviyeleri immünofloresans görüntüleme ile tespit edildi. Western blotlama sonuçları, PKNOX2 protein düzeylerinin replikatif yaşlanma ile azalma eğiliminde olduğunu gösterdi. 200 μM H2O2 ile indüklenen oksidatif stresin Kİ-MKH'de genel olarak NF-κB/p65 protein düzeylerini arttırdığını gösterdi. Ko-İP sonrası western blotlama ve in situ proximity ligation assay (PLA) teknikleri ile NF-κB/p65 ve PKNOX2 etkileşimde olduğu in vitro ve in situ tespit edildi. PLA analizleri, NF-κB ve PKNOX2'nin etkileşimlerinin Kİ-MKH'lerinin hem sitoplazma hem de çekirdeğinde mevcut olduğunu gösterdi ve etkileşim düzeylerinin 9. pasajda arttığını ve pasaj 12'de düştüğünü gösterdi.