Method development and validation to determine neurotransmitters by using hplc

Bu çalışmada, sıçan beyinlerinin hipokampüs, amigdala ve rafe çekirdeği bölgelerinden mikrodiyaliz yöntemi ile toplanan beyin omurilik sıvısı örneklerinde gama aminobütirik asit (GABA), glutamat, serotonin ve noradrenalin nörotransmitterleri ile melatonin hormonunun tayini için floresan dedektör, C18 ters-faz kolon ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak iki farklı metot geliştirilmiştir. Birinci metotta, GABA ve glutamatın birlikte tayini için siyanür iyonunun varlığında 2,3-naftalindikarboksialdehit (NDA) ile ön-kolon türevlendirme yapılmıştır. Türevler izokratik yıkama ile ayrılmış ve 420 nm uyarma ile 480 nm emisyon dalga boylarında floresan detektör ile tayin edilmişlerdir. İkinci metot türevlendirme basamağı olmaksızın melatonin, serotonin ve noradrenalinin birlikte tayinini içerir. Bileşikler izokratik yıkama ile ayrılmış ve 280 nm uyarma ile 340 nm emisyon dalga boylarında floresan detektör ile tayin edilmişlerdir. Metotların validasyonu yapılmıştır. Metotların performansı lineer aralık, algılama ve tespit limiti, geri kazanım ve kesinlik parametreleri ile değerlendirilmiştir. Kalibrasyon doğruları için standart ekleme metodu kullanılmıştır. Algılama limitleri GABA için 28 ppb, glutamat için 9 ppb, melatonin için 0,5 ppb, serotonin için 1,2 ppb ve noradrenalin için 2,7 ppb olarak bulunmuştur. Tespit limitleri ise GABA için 92 ppb, glutamat için 30 ppb, melatonin için 1,7 ppb, serotonin için 3,8 ppb ve noradrenalin için 8,8 ppb'dir. Ortalama geri kazanım değerleri GABA için % 103 ile % 118, glutamat için % 87 ile % 99, melatonin için % 88 ile % 121, serotonin için % 76 ile % 117 ve noradrenalin için % 72 ile % 105 arasında değişmektedir. Yüzde bağıl standart sapma (RSD) değerleri ise GABA için 0,78 ile 1,80, glutamat için 0,80 ile 1,67, melatonin için 0,31 ile 2,18, serotonin için 0,84 ile 5,05 ve noradrenalin için 0,44 ile 8,24 aralıklarında bulunmuştur. Tüm bileşikler için 'alttan-yukarı' yaklaşımı uygulanarak ölçüm belirsizlikleri hesaplanmıştır. Yüzde bağıl ölçüm belirsizlik değerleri 10,1 ile 16,7 aralığında değişim göstermiştir. Belirsizlik bütçesinin en büyük bileşenleri kalibrasyon eğrisi, stok çözelti ve geri kazanım olmuştur. Anahtar Kelimeler: Nörotransmitter, GABA, Glutamat, Serotonin, Noradrenalin, Melatonin, Beyin omurilik sıvısı, Mikrodiyaliz, HPLC, Floresan Detektör, Metot Validasyonu, Belirsizlik Bütçesi