Prematüre ovaryan yetmezlik modelinde foliküler atrezi ile granüloza hücrelerinin hücre ölüm mekanizmaları açısından ilişkisinin incelenmesi

Amaç: Prematüre ovaryan yetmezlik (POY) özellikle 40 yaşından önce kadınlarda klinik olarak amenore, yüksek gonadotropin ve düşük östrojen seviyeleri ve ovaryumda gelişen folikül kaybına bağlı ovaryum rezervlerinin erken tükenmesi ile ortaya çıkan önemli bir infetilite nedenidir ve etiyolojisi hala tam olarak anlaşılamamıştır. Ovaryumda oosit ve folikül gelişimine metabolik destek sağlayan granüloza hücrelerinin aşırı kaybı ile tetiklenen foliküler atrezi sürecinde rol oynayan hücre ölüm mekanizmalarının araştırılması yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Son zamanlarda POY etiyolojisinin araştırılmasında kematerapötiklerle indüklenmiş hayvan modelleri kullanılmaktadır. Kanser tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir kemoteröpatik ajan olan siklofosfamid, ovaryumlara sitotoksik etki yaparak foliküler atreziyi tetiklemektedir. Çalışmamızda, siklofosfamid ile C57BL/6 cinsi dişi farelerde prematüre ovaryan yetmezlik modelinin oluşturulması, alınan kan ve doku örnekleri ile modelin oluşumunun biyokimyasal ve histopatolojik yönden doğrulanması ve foliküler atrezi sürecinde rol oynayan hücre ölüm mekanizmalarından apoptoz, otofaji ve paraptozun immünohistokimyasal yöntemlerle değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç Yöntem: C57BL/6 cinsi dişi fareler rastgele kontrol, sham ve POY olmak üzere 3 gruba ayrıldı (n:6, herbir grup için). Prematüre ovaryan yetmezlik modeli siklofosfamid uygulaması ile oluşturuldu. Kontrol grubuna herhangi bir uygulama yapılmadı. POY grubuna siklofosfamid, sham grubuna ise aynı oranda serum fizyolojik uygulandı. Siklofosfamid 3 hafta boyunca her 2 günde 1 intraperitoneal, ilk doz 70 mg/kg, devam eden dozlar 30mg /kg olarak uygulandı. 3 hafta sonunda hormon serum seviyelerinin analizi için tüm gruplardan genel anestezi altında intrakardiyak 3ml kan alındıktan sonra hayvanlar servikal dislokasyonla sakrifiye edilerek ovaryumları alındı ve histolojik takip yöntemleri uygulanarak elde edilen kesitlere histopatolojik değerlendirme için hematoksilen-eozin boyaması yapıldı. Tüm gruplara ait kesitlerde ışık mikroskobu altında folikül sayımı yapıldı. Kanda serum FSH, LH ve östradiol seviyeleri ELİSA yöntemiyle çalışıldı. Hücre ölüm mekanizmaları belirteçlerinden apoptoz için kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9, otofaji için Lamp1 ve MAP LC3β, paraptoz için ise GRP78 ve CHOP primer antikorları ile immünohistokimyasal boyama yapıldı. Apoptotik hücre varlığının tespiti için TUNEL analizi uygulandı. Sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi. Bulgular: Kontrol ve sham grubuna göre POY grubunda serum FSH ve LH seviyelerinde artış gözlenirken östradiol seviyelerinde düşüş saptandı. Gruplardan alınan ovaryum dokularının histopatolojik değerlendirmesinde, kontrol ve sham grubuna oranla POY grubunda ovaryum dokusundaki bozulma, foliküler atrezinin bir belirteci olan gelişen folikül kaybı ve atrezik folikül sayısında belirgin bir artış gözlendi. Folikül sayımı ile kontrol ve sham grubuna göre POY grubunda gelişen folikül sayısının azaldığı benzer oranda atrezik foliküllerde artış olduğu izlendi. İmmunohistokimyasal boyamalar sonucunda; kaspaz 3, kaspaz 8 ve kaspaz 9 immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise kaspaz 3 hafif/orta, kaspaz 8 ve kaspaz 9'un orta şiddette; Lamp1 ve MAP LC3β immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise Lamp1 hafif/orta, MAP LC3β orta şiddette; CHOP ve GRP78 immünoreaktivitesi kontrol ve sham grubunda hafif, POY grubunda ise orta şiddette gözlendi. TUNEL analizi sonucunda, POY grubu ovaryum kesitlerinde kontrol ve sham grubuna göre daha fazla apoptotik hücre tespit edildi. Sonuçlar: Prematüre ovaryan yetmezlik modelinin siklofosfamid uygulaması ile C57BL/6 dişi farelerde başarılı bir şekilde oluşturulduğu biyokimyasal ve histopatolojik olarak doğrulanmıştır. Foliküler atrezi sürecinde görülen hücre ölüm mekanizmalarından apoptoz, otofaji ve paraptozun varlığı immünohistokimyasal olarak gösterilmiştir. TUNEL analizi ile hastalık grubundaki apoptotik hücre artışı tespit edilmiştir. Bu çalışmada prematüre ovaryan yetmezliğe yol açan foliküler atrezi sürecinde apoptoz ve otofajinin yanı sıra paraptozun da rol aldığının gösterilmesi, yeni tedavi protokollerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Anahtar Kelimeler: Prematüre Ovaryan Yetmezlik, Siklofosfamid, Foliküler atrezi, Apoptoz, Otofaji, Paraptoz