Autophagy
67 theses under this subject heading
Bovine herpesvirüs-1'in farklı kanser hücre hatlarında apoptotik ve otofajik etkilerinin araştırılması
Kanser tedavisinde viroterapi olarak adlandırılan, onkolitik virüslerin kanser hücrelerin yıkımı için kullanımı kanser tedavisinde alternatif bir yol olarak önerilmektedir. Onkolitik virüs, seçici olarak kanser hücrelerinde lizise, apoptozise neden olmakta ve immun sistem hücrelerini uyararak immünoterapiye katkı de sunmaktadır. Çok sayıda virüs bu amaçla aday gösterilirken avantaj ve dezavantajları tüm detaylarıyla yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Yapılan araştırmalarda farklı türlerde patojen olan hastalık etkeni vahşi virüs adaylarının seçilmesi, genetik yapıları üzerinde değişiklikler yapılarak rekombinant formlarının oluşturulması ve kullanımı süreçleri sonrasında bazı virüsleri onkolitik etkisinin önemli olduğunu göstermiştir. Projede önerilen BHV-1 patojen olarak hastalık meydana getirdiği konağı sığırdır. İnsanlarda herhangi bir hastalık etkeni olarak tanımlanmamıştır. Son yıllarda BHV-1 üzerine yapılan bazı araştırmalarda onkolitik potansiyelinin olabileceği önerilmektedir. Bu çalışmada, sığırlarda patojen olan Bovine herpesvirus-1 (BHV-1) 'in farklı kanser hücre hatlarında neden olabileceği ölüm yolaklarından apoptotik ve otofajik onkolitik etkilerinin araştırılması amaçlandı. Bu amaçla, meme kanseri hücre hattı (MDA-MB-231), akciğer hücre hattı (A549), prostat kanseri hücre hatları (DU145 ve PC3) ve servix kanseri hücre hattı (Hela)'nda yapılacak apoptotik ve otofajik yolaklar araştırıldı. Hücre hatları farklı titrelerideki birüs enfeksiyonuna ve zamana bağlı değişiklikler değerlendirildi. Virüsü enfeksiyonuna bağlı miktar ve zamana bağlı hücre kayıplarının arttığı, apoptotik hücre sayısının artığı tespit edildi. Enfekte hücrelerde bazı markırların (BCL-2, ATG7, p62, kaspaz-8 ve kaspaz-9) ekspresyon seviyesinin zamana ve doza bağlı olarak değiştiği değerlendirildi. Bu kanser hücrelerindeki ölüm mekanizmalarının aydınlatılması amacıyla daha fazla apoptotik markırların ve otofajik markırların kullanılması ihtiyaç duyulmaktadır.
Myxoma virüslerin multipl myelomda otofajik etkilerinin incelenmesi
MM (Multipl Myelom) tüm hematolojik maligniteler içinde ikinci sıklıkta rastlanan ve plazma hücrelerini etkileyen malign bir hastalıktır. MM un tedavisinde son yıllarda ortaya çıkan gelişmeler, yeni ilaç ve tedavi protokollerine yol açarak MM da küre yönelik tedavi araştırmaları son yıllarda hız kazanmıştır. Bu amaçla Multipl Myelomda etkinliği bilinen bir onkolitik virüs olan Myxomavirüslerin antimyelom etkinliklerinde Otofajin etkileri araştırılması amaçlanmıştır. Bununla birlikte özellikle kanserde birbirlerine etkileyen yolaklar olan otofaji ve Apoptoz ilişkisini değerlendirmek için apoptoz göstergesi olan Bcl-2 de yine farklı virüs dozlarında analiz edildi. Bu amaçla İnsan kökenli U-266 ve fare kökenli MOPC 315 Myelom hücre hatlarında MYXV'nin farklı dozları kullanılarak otofaji göstergeleri olarak Atg-5, p-62, Beclin-1, LC-IIIB kullanılırken ,apoptoz amacı ile Bcl-2'i inceledik. Bu tez çalışmasında hem U266 hem de MPOC hücre hatları kullanıldı. Analizler ELİZA ile değerlendirildi. Otofajide otofogozomların görüntülenmesi için Elektron Mikroskobu kullanıldı. Çalışmanın sonucunda özellikle 15 MOI gibi yüksek virüs içeren gruplarda ATG 5 ve Beclin-1 artışlarının otofajinin erken aşaması olan ilk 24 saatte U-266 ve MOPC-315 hücre hatlarında arttığını saptadık.Otofajiyi Elektron Mikroskobunda otofogozomlar olarak gösterdik. Otofajinin geç dönem göstergesi oln LCIIIB artışını da 48 saatte saptadık yine Elektron Mikroskopla geç otofaji döneminde otofogozomları tespit ettik. Apoptoz markeri olarak kullanılan Bcl-2 artışını hatlarda saptamadık. Bu marker apaptoz otofaji ilişkisi açısından incelendi. Ancak daha fazla apoptoz göstergesi kullanılarak bu ilişkinin farklı çalışmalarala değerlendirilmesi gerekebilir. Sonuç olarak MM da antimyelom etkinliği bilinen MYXV ile otofaji ilişkisi açısından yapılmış ilk çalışma olan bu tezde virüsün otofajiyi etkin şekilde kullandığını saptadık
Kalıtsal metabolik hastalıklarda otofaji, oksidatif stres ve inflamasyon ilişkisi
Kalıtsal metabolik hastalıklarda, hastaların klinik izlemi sırasında epilepsi, katarakt, hepatik yetmezlik, kronik böbrek hastalığı gibi komplikasyonlar gelişebilir. Bu çalışmanın amacı bu komplikasyonların gelişmesinde otofajik disfonksiyon, inflamasyon ve oksidatif stresin rolünü araştırmaktır. Klasik galaktozemi, akça ağaç şurubu hastalığı (MSUD), herediter tirozinemi tip 1, lizinürik protein intoleransı (LPI) tanılı 48 hasta ve 10 sağlıklı çocuk çalışmaya dahil edildi. Hasta ve sağlıklı kontrol gruplarında otofaji (Beclin 1, LC3B-II, p62) ve inflamazom (NLRP3, ASC, Kaspaz 1, NF-Ƙβ) yolağında yer alan gen ve protein ekspresyonlarının analizi, oksidatif stres biyobelirteçlerinin (total tiyol, nativ tiyol, disülfit, tiyol/disülfit denge, total antioksidan kapasite ve total oksidatif stres) ve sitokin düzeylerinin ölçümü, lenfosit alt grupları ve lenfosit aktivasyon belirteçleriyle immun fenotiplendirme, hedefsiz metabolomik analizle metabolomik profilleme çalışmaları gerçekleştirildi. En yüksek total tiyol, nativ tiyol, TAS ve TOS değerleri MSUD grubunda gözlendi. En yüksek disülfit ve en düşük TAS değerleri LPİ grubunda saptandı. Hasta ve kontrol grupları arasında sitokin düzeyleri belirgin farklılık göstermedi. Bütün gruplarda NLRP3/p62 gen ekspresyonları yükselmişti. En yüksek kat değişimleri galaktozemi ve LPI gruplarında gözlendi. Otofaji disfonksiyonu tüm gruplarda mevcuttu. p62, molekülü, antioksidan, otofaji ve inflamasyon yolaklarını birbirine bağlayan önemli bir oyuncu olarak görünmektedir. Çalışmamızda NLRP3 gen ekspresyonları, katarakt geliştiren galaktozemi, akciğer tutulumu olan LPI grubunda ve hepatik fibrozis geliştiren tirozinemi hastalarında daha yüksek bulundu. İmmün fonksiyonlar açısından yapılan incelemede T ve B lenfositlerle, DNT, NKT, CD3HLADR, klasik ve klasik olmayan monosit düzeyleri açısından hasta gruplarında göre istatistiksel olarak belirgin farklılık gözlendi. Yolak analizlerinin PLS-DA istatistik yöntemi ile değerlendirilmesinde hasta gruplarında sağlıklı kontrol gruplara göre belirgin farklılaşmış metabolitler tespit edildi. Özellikle steroid biyosentezi, lipid, pürin-pirimidin metabolizması, enerji metabolizması gibi genel metabolik yolaklarda yer alan metabolitlerin hasta grubunda normal gruba göre değişkenlik gösterdiği saptandı. LPI hastalarının metabolomik profillemesi kronik inflamatuvar hastalıklarda etkilenen yolaklara benzerlik göstermekteydi. Çalışmamız intoksikasyon tip kalıtsal metabolik hastalıklarda, aynı anda inflamazom ve otofaji gen ve protein ekspresyonlarını, oksidatif stres, otofaji ve inflamasyon ilişkisini, immun fonksiyonları ve metabolomik profillemeyi araştıran ilk çalışmadır. Çalışmanın sonuçları metabolik hastalıkların patogenezinde otofajik disfonksiyon oksidatif stres, inflamasyon ve immun disregülasyonun önemli rol oynayabileceğini gösterdi. Anahtar Kelimeler: İnflamazom, otofaji, oksidatif stres, hedefsiz metabolomik analiz, kalıtsal metabolik hastalıklar
İnsan nöroblastoma hücre kültüründe amiloid beta ile oluşturulan alzheimer hastalığı modelinde atorvastatinin sestrin-2, sirtuin-1, TPP1 ve LC3B ekspresyonuna etkisi.
Çelik, H. İnsan Nöroblastoma Hücre Kültüründe Amiloid Beta ile Oluşturulan Alzheimer Hastalığı Modelinde Atorvastatinin Sestrin-2, Sirtuin-1, TPP1 ve LC3B Ekspresyonuna Etkisi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2019. Alzheimer hastalığı (AH), beyinde amiloid-beta (Aβ) peptidlerin birikimi ve nörofibriler yumakların oluşumu ile karakterize, bilişsel fonksiyonların azaldığı ve demansın gözlendiği nörodejeneratif bir hastalıktır. Lipid metabolizmasındaki bozuklukların AH gelişimi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Kolesterolün amiloid prekürsör protein (APP)'den Aβ oluşumunu etkilediğinin gösterilmesi, AH patogenezinin Aβ-kolesterol yolakları açısından araştırılması ihtiyacını ortaya koymaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar AH patolojisi ile otofaji yolakları arasında da yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. Otofaji, AH'nın patolojisini oluşturan Aβ gibi protein agregatlarının lizozomal yıkımla parçalanmasında ve hücreden uzaklaştırılmasında yaşamsal öneme sahiptir. Nörodejeneratif hasara ve Aβ toksisitesine karşı koruyucu olarak değiştikleri gösterilen, bu etkilerinde antioksidan ve otofajiyi indükleyici mekanizmaların sorumlu olduğu düşünülen sestrin-2 (SESN2) ve sirtuin-1 (SIRT1) ile lizozomal bir enzim olan tripeptidil peptidaz 1 (TPP1) ve otofaji belirteci mikrotübülle ilişkili protein hafif zinciri (LC3B) proteinlerinin etki mekanizmalarında kolesterol düşürücü atorvastatinin rolünün araştırılması amaçlanmıştır. İnsan nöroblastoma (SH-SY5Y) hücre hattına uygulanan Aβ (10 μM)'nın SESN2 ekspresyonunda artış, SIRT1 ekspresyonunda azalma yaptığı, eşzamanlı atorvastatin (1μM) tedavisinin bu proteinlerdeki değişiklikleri kontrol seviyelerine geri döndürdüğü ayrıca hücrelerde 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A'yı (HMG-KoA) ve lipid peroksidasyonunun göstergesi malondialdehiti (MDA) inhibe ettiği gösterilmiştir. Otofaji belirteci LC3B, Aβ (10 μM) ile atorvastatinin (1μM) eşzamanlı uygulaması ile artmış, lizozomal bir enzim olan TPP1 seviyelerinde ise değişiklik olmamıştır. Bu tez çalışmasında, atorvastatinin Aβ hasarı sırasında farmakolojik etkisini, HMG-KoA redüktaz enzim inhibitörü ve antioksidan etkisinin yanı sıra, SESN2, SIRT1 ve LC3B proteinlerinin ekspresyonlarını değiştirerek gösterdiği sonucuna varabiliriz. Anahtar Kelimeler: Alzheimer hastalığı, atorvastatin, sestrin-2, sirtuin-1, otofaji Destekleyen Kuruluş: HÜBAB (Proje Numarası: THD-2017-13478)
Glukokortikoid uygulanan ratlarda kinoanın (chenepodium quinoa willd) apoptotik, otofajik, antioksidan ve inflamasyon markırları üzerine etkisi
Bu çalışma, glukoırtikoid uygulanarak deneysel insülün direnci oluşturulan ratlarda kinoa uygulanmasının apoptotik, otofajik, antioksidan ve inflamasyon markırları üzerine etkisinin araştırılması amacıyla planlandı. Bu amaçla, 42 adet 200–250 g ağırlığında Wistar-Albino ırkı erkek rat kullanıldı. Denekler rastgele her biri 7 rattan oluşan; kontrol (K), kinoa verilen (Q), insülin direnci oluşturulan (İ), insülin direnci oluşturulup kinoa verilen (İQ), insülin direnci oluşturulup metformin verilen (İM), kinoa verilip insülin direnci oluşturulan (Qİ) grup olmak üzere altı deneme grubu olarak ayrıldı. İ, İQ, İM, Qİ gruplarındaki ratlara 7 gün boyunca intraperitonal olarak deksametazon (1mg / kg / gün) enjekte edilerek insülin direnci oluşturuldu. İ grubu 7 gün sonunda sakrifiye edildi. Daha sonra 6 gün İQ'ya kinoa yemi verildi, İM'ye 6 gün 40 mg/kg/gün metformin verildi. Qİ grubuna ise önce 6 gün kinoa yemi, sonra deksametazon verilip insülin direnci (7 gün) oluşturuldu. Kontrol grubuna 7 gün fizyolojik serum, kinoa grubuna 6 gün kinoa yemi verildi. Deney süresinin sonunda i.p. 50 g/kg/tek doz ketamin (Ketalar, Eczacıbaşı, Türkiye) tüm hayvanlara uygulandı ve hayvanlardan kan ve doku numuneleri alındı. Serum örneklerinde kan glukoz, ALT, AST, ALP, total kolesterol, total protein, üre, kreatinin, insülin tayinleri yapıldı. Karaciğer dokuları çalışma gününe kadar -80 °C'de saklandı. Bu amaçla; tüm gruplarda rat karaciğerinden elde edilen RNA izolasyon ürünlerinde, oksidatif stres (Gpx1, sod1), inflamasyon markırları (IL1-β, TNF-α),apoptotik (Bax, Bcl-2, kaspaz-3), otofajik (Atg5, Sqstm1), yolaklarda görev alan önemli genlerin ekspresyonu real time-PCR ile belirlendi. Real time-PCR'da internal kontrol geni olarak gliseraldehit-3-Fosfat dehidrojenaz (GAPDH) kullanıldı. Sonuç olarak, deksametazon ile oluşturulan deneysel insülin direncinde artan glukozla oluşan karaciğer ve böbrek hasar göstergelerinde kinoa uygulaması ile bir azalma olduğu tespit edildi. Kinoanın hem biyokimyasal parametreler ve apoptotik, otofajik, antioksidan, inflamasyon markırları üzerinde kayda değer yararlı etkilerinin olduğu tespit edildi. Anahtar kelimeler: Chenopodium Quinoa Willd, İnflamasyon, İnsülin direnci, Oksidatif stres, Rat.
Glukozilseramidaz-beta gen mutasyonlarının dopaminerjik nöronlarda α-sinüklein yıkım mekanizmaları üzerindeki etkilerinin araştırılması
Lizozomal Glukoserebrosidaz (GS) enzimini kodlayan Glukozilseramidaz-beta (GBA) genindeki mutasyonların, otozomal resesif kalıtılan lizozomal bir depo hastalığı olan Gaucher Hastalığı'na (GH) neden olduğu bilinmektedir. GH, hücrelerde lizozomal glukoserebrosit birikimi ile karakterize olup karaciğer, dalak, kemik iliği, akciğer ve sinir sistemi gibi farklı doku ve sistemleri etkileyerek hastalık patolojisine neden olmaktadır. Gaucher Hastalığı nörolojik bulgularına göre Tip I (nöropatik olmayan form), Tip II (akut nöropatik form) ve Tip III (kronik nöropatik form) olmak üzere klinik alt tiplere ayrılmaktadır. Son yıllarda, GH ile ilişkili olduğu kanıtlanmış GBA mutasyonlarının Parkinson Hastalığı (PH) ve diğer sinükleopatiler için en önemli risk faktörü olduğu da tanımlanmıştır. Bu bağlamda, yapılan moleküler analizler, mutant Glukoserebrosidaz (GS) enziminin ?sinüklein birikimini tetikleyerek patolojiye neden olduğunu göstermiştir. GS ve α-sinüklein birikimi arasındaki patolojik ilişkiyi açıklayabilmek için, hücre içi lipit kompozisyon değişikliği, otofajik/lizozomal fonksiyon bozukluğu, Ubikitin Proteozom sistemindeki bozukluklar ve hücre içi kalsiyum dengesinin bozulması gibi birçok farklı mekanizma öne sürülmesine rağmen iki hastalık arası ilişkinin temelleri hala tam olarak bilinmemektedir. Bahsi geçen ilişkiyi açıklayabilmek için öne sürülen patolojik mekanizmalardan biri de, GBA mutasyonları sonucu Glukoserebrosidaz enzim aktivitesindeki değişikliklerin α-sinükleinin yıkım mekanizmalarını etkileyerek hücre içi α-sinüklein birikimine neden olduğudur. Yapılan çalışmalar, GS enzim eksikliğinin, α-sinükleinin yıkımından sorumlu olan Ubikitin-Proteazom Sistemi (UPS), Şaperon Aracılı Otofaji (ŞAO) ve Makrootofaji mekanizmalarını etkileyerek α-sinüklein birikimine neden olabileceğini göstermiştir. Hücredeki protein kalite kontrolünün sürekliliği için bu mekanizmaların gerekli durumlarda birbirlerini kompanse ettiği bilinmektedir. Fakat, GBA mutasyonları sonucu oluşan GS enzim eksikliğinin bu mekanizmaları nasıl etkilediği tam olarak bilinmemektedir. Bu bilgiler ışığında, nöropatik ve nöropatik olmayan Gaucher Hastalığı'na neden olan farklı GBA mutasyonlarının, hücrelerde biriken α-sinükleinin yıkım mekanizmaları arasındaki ilişkiyi etkileyerek nöronal dejenerasyonda rol oynayabileceği hipotezi kurulmuştur. Bu amaçla, farklı nörolojik tutulum gösteren Gaucher hastalarından ve Parkinson hastalarından alınan fibroblast kültürlerinden elde edilecek olan indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPKH) kökenli dopaminerjik nöron kültürlerinde, GBA mutasyonlarının biriken α-sinükleinin yıkımında rol oynayan Ubikitin Proteozom Sistemi (UPS), Şaperon Aracılı Otofaji (ŞAO) ve makrootofaji mekanizmalarını nasıl etkilediğinin araştırılması amaçlanmaktadır. GBA mutasyonlarının, α-sinüklein yıkım mekanizmaları üzerine etkilerinin belirlenmesi nörolojik tutulumlu Gaucher Hastalığı patogenezinin aydınlatılması açısından büyük önem taşımaktadır.
İnsan mide adenokarsinoma hücrelerinde Helicobacter pylori'nin neden olduğu DNA çift sarmal kırıkları ve oksidatif strein değerlendirilmesi
Çeşitli mikroorganizmaların oluşturduğu infeksiyonların reaktif oksijen bileşikleri (ROS) ve reaktif azot bileşiklerinin (RNS) oluşumuna yol açtığı iyi bilinmektedir. Bu bileşiklerin de intrasellüler oksidan/antioksidan dengeyi değiştirip oksidatif strese neden olduğu birçok çalışmada gösterilmiştir. Oksidatif stres, birçok farklı mekanizma ile DNA hasarı oluşturabilmektedir. DNA hasarı, basit ve onarılabilir baz lezyonlarından, en tehlikeli DNA hasarı olan DNA çift sarmal kırıklarına (DSB) dek oldukça geniş bir yelpazede görülebilir. Radyasyon ve bazı bakteri toksinleri DSB'yi indükleyerek, karsinojeneze yol açabilir. Helicobacter pylori gastrik mukozada kronik infeksiyona neden olan bir Gram negatif bakteridir. Helicobacter pylori infeksiyonu Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı tarafından "Grup I karsinojen" olarak sınıflandırılmıştır. Helicobacter pylori'nin neden olduğu toksisite altında yatan mekanizmalar ve bu bakterinin yol açtığı gastrik karsinojenezin mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Çalışmalar Helicobacter pylori'nin hem doğrudan DNA hasarı yaparak, hem de epigenetik mekanizmalarla genetik instabiliteye neden olduğunu göstermektedir. Helicobacter pylori infeksiyonu konak DNA'sında oksidatif hasara neden olmaktadır. Literatürde, Helicobacter pylori infeksiyonunun oksidatif strese ve DSB'ye neden olduğu ve DSB onarım mekanizmalarını da etkileyebileceğini gösteren çalışmalar mevcuttur. Ancak, Helicobacter pylori infeksiyonu ile oksidatif stres arasındaki ilişkiyi inceleyen yeterli sayıda çalışma bulunmamaktadır. Bu verilerin ışığında gerçekleştirilen tez kapsamında, gastrik adenokarsinoma (AGS) hücrelerinin Helicobacter pylori'ye maruziyeti sonucu ortaya çıkabilecek olası sitotoksisite, intrasellüler ROS artışı ve oksidatif stres, DNA baz lezyonları, DNA onarım proteinlerindeki değişiklikler, apoptotik ve otofajik değişiklikler detaylı bir şekilde araştırılmıştır. Ayrıca, AGS hücrelerinin Helicobacter pylori'yle infekte olması sonucu, hücrelerde DSB'nin bir biyogöstergesi olan histon 2A ailesi üyesi X (H2AX) fosforilasyonunun (-H2AX) belirlenmiştir. Diğer taraftan, DSB onarım yolaklarıyla ile Helicobacter pylori maruziyeti sonucu ortaya çıkabilecek DSB'lerin onarılabileceği de düşünülerek çalışmaya bir DSB onarımında önemli rolü olan DNA-protein kinaz (DNA-PK) inhibitörü eklenmiş ve ilgili parametreler DNA-protein kinaz inhibitörü varlığında da ölçülmüştür. Bu şekilde, DSB onarımı bozulmuş bireylerde Helicobacter pylori infeksiyonunun neden olabileceği olası durumun öngörülmesi planlanmıştır. Elde edilen sonuçlar, Helicobacter pylori infeksiyonunun özellikle DNA-PK inhibitörü varlığında oksidatif streste önemli artışlara, DNA onarım proteinlerinde değişikliklere ve g-H2AX düzeylerinde belirgin artışlara yol açtığı ve apoptozu ve otofajiyi tetiklediği görülmüştür. Diğer taraftan, Helicobacter pylori ve DNA-PK inhibitörü birlikte maruz kalan grupta apoptoz ve otofajinin çok daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak, Helicobacter pylori infeksiyonunun özellikle DSB onarımında sorun olan hücrelerde ciddi sorunlara yol açabileceği belirlenmiştir.
Deneysel polikistik over sendromu (pkos) modelinde tamoksifen ve klomifenin ovaryum dokusu üzerine etkilerinin otofajik açıdan değerlendirilmesi
Polikistik over sendromu (PKOS), menstrüel disfonksiyon, hiperandrojenizm, hirsutizm, infertilite ve polikistik overlerle karakterize endokrin bir bozukluktur. Üreme çağındaki kadınların %5 ila %10'unu etkileyen bu hastalık anovulasyon nedeniyle ortaya çıkan infertilitenin en önemli sebeplerinden biridir. PKOS'un neden olduğu infertilinin tedavisinde en sık kullanılan ilaç olan klomifen, hipotalamusta bulunan östrojen reseptörlerine bağlanarak östrojenin negatif feed-back mekanizmasını engeller. Bu durum FSH hormonunun artmasına neden olarak ovulasyonun gerçekleşmesini sağlar. Tamoksifen, Klomifen gibi nonsteroid selektif östrojen modülatörüdür ve yapısal olarak klomifene benzerdir. Esas olarak meme kanseri tedavisinde kullanılsa da ovulasyon indüksiyonu için yapılan çalışmalarda Klomifenle benzer ovulasyon ve gebelik oranlarına ulaşılmıştır. Çalışmamızda, 21 gün boyunca gavaj yöntemiyle 1mg/ kg Letrozol verilerek oluşturulan PKOS modelinde, grup ismine bağlı kalınarak dişi sıçanlara 5 gün boyunca Tamoksifen ve Klomifenin uygulaması yapılmıştır. Uygulama süresinin sonunda sakrifiye edilen hayvanlardan alınan ovaryum dokuları, histokimyasal, immünohistokimyasal boyamalar ve Real time-PCR (RT-PCR) tekniği ile analiz edilmiştir ve bu ilaçların ovaryum dokusu üzerine etkinliklerinin, otofaji yolağıyla ilişkisi araştırılmıştır. Yaptığımız çalışmada immünohistokimyasal boyamalar ve RT-PCR analizlerinde, tamoksifen ve klomifen gruplarında LC3 ekspresyonunun arttığı, mTOR ekspresyonunun azaldığı gözlemlenmiştir. Bu bulgulara dayanarak, tamoksifen ve klomifenin PKOS'lu ovaryumlarda, otofajiyi indükleyabileceği sonucuna vardık.
Kutanöz malign melanomda AMBRA1 ve mTOR genlerinin ekspresyon düzeylerinin incelenmesi
Melanom, melanosit adı verilen pigment üreten hücrelerin mutasyon sonucu kontrolsüz bir şekilde bölünmeye başlamasıyla ortaya çıkan invaziv cilt kanseri türüdür. Melanom teşhisi konan her on hastadan birinde hastalık öyküsü olan aile üyesi varlığının saptanması, hastalıkla genetik arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Araştırmamızda kutanöz malign melanomun genetik özelliğine odaklanılmış olup, Activating Molecule in Beclin-1-Regulated Autophagy (AMBRA1) ve (mTOR) geni çalışılmıştır. Çalışmamızda kutanöz malign melanom tanısı almış hasta (n=50) ve kontrol grubunu oluşturan (n=50) bireylerde ilgili AMBRA1 ve mTOR genlerinin ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Doku örneklerinden cDNA örnekleri elde edildikten sonra Real Time PCR ile TaqMan prob kullanılarak AMBRA1 ve mTOR genlerinin karşılaştırmalı CT yöntemi (ΔΔCT) kullanılarak ekspresyon düzeyleri ölçülmüştür. KMM etiyolojisinde yer aldığı düşünülen AMBRA1 ve mTOR genlerinin ifade düzeylerinin kontrol ve hasta gruplarındaki dağılımları incelenerek bunlara ait p değerleri ve tanımlayıcı istatistikler hesaplanmıştır. Çalışmamız sonucunda, kontrollerle karşılaştırıldığında Kutanöz Malign Melanom tanısı almış hastalarda, AMBRA1 ve mTOR genlerinin ekspresyon düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmemiştir (p>0,05). Gelecek çalışmalarda fazla örneklem sayısıyla ekspresyon analiz yapılmasının yanı sıra, kodlanmayan RNA'ların ve protein seviyelerinin de belirlenmesinin anlamlı sonuçlanacağı kanısındayız. Mersin örneklemi temelinde gerçekleştirdiğimiz bu çalışma AMBRA1 ve mTOR genlerinin KMM'li doku ve kontrol grubundaki ekspresyon değerlerine dair ülkemizdeki ilk çalışma olma özelliği taşımaktadır.
Kolon kanseri hücrelerinde kolekalsiferol/D3 vitamin uygulamasının otofaji ve endoplazmik retikulum stresi üzerinden değerlendirilmesi
D vitamini, vücut üzerinde yaygın etkileri olan güçlü bir steroid hormon kolekalsiferolün öncüsüdür. Antikanser etkiye de sahip olan D vitamini, yetersiz güneş ışınlarına maruz kalma ve kanserli bireylerde görülebilecek çeşitli sebeplerden dolayı bu etkisini gösteremez. Ayrıca bazı kanser hastalarında D vitamini eksikliği ile de karşılaşılmaktadır. Kolekalsiferol vücudu besleyen en önemli D vitamini formudur. Yapılan çalışmalar kolekalsiferolün çeşitli kanser hücrelerinin proliferasyonunu, göçünü, invazivliğini ve anjiyogenezini inhibe ettiğini göstermiştir. Ayrıca kolekalsiferol, bağırsaktaki bağışıklık hücrelerinin biyolojisini düzenleyerek bağırsak mikrobiyotasını olumlu yönde etkilemektedir. Bu çalışmada kolekalsiferol uygulamasının kolon kanseri hücrelerinde otofaji ve endoplazmik retikulum (ER) stresi üzerine etkisi değerlendirilmiştir. Kolekalsiferolün HT-29 ve HCT 116 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi XTT analizi ile araştırılmıştır. Sitotoksisite sonuçları dikkate alınarak, sonraki analizde hücreler 48 saat boyunca 150 ve 250 µM kolekalsiferol ile muamele edilmiştir. Ardından kontrol ve doz gruplarından RNA izolasyonu yapılmış, cDNA sentezlenmiş ve apoptoz, ER stresi ve otofaji ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyeleri qRT-PZR ile analiz edilmiştir. Kolekalsiferolün kolon kanseri hücrelerinin koloni oluşturma yetenekleri üzerine etkisi, koloni formasyon analizi ile değerlendirilmiştir. Ayrıca florometrik tabanlı otofaji kiti ve GRP78/BiP ELISA kiti kullanılarak kolekalsiferolün otofaji ve ER stresi üzerine etkisi araştırılmıştır. qRT-PZR sonuçlarına göre, kolekalsiferol uygulaması kolon kanseri hücrelerinde apoptoz ve ER stresi ile ilişkili genlerin ekspresyonunu artırırken, otofaji ile ilişkili genlerin ekspresyonunu azaltmıştır. Benzer şekilde kolekalsiferol uygulaması sonrasında otofaji azalırken ER stresi belirteci GRP78/BiP miktarında artış saptanmıştır. Ek olarak, kolekalsiferol, kolon kanseri hücrelerinin koloni oluşturma yeteneğini önemli ölçüde azaltmıştır. Tüm sonuçlar bir arada değerlendirildiğinde, kolekalsiferolün kolon kanseri hücrelerinde otofajiyi baskılayarak, ER stresi ile apoptozu arttırarak antikanser etkiye neden olduğu düşünülmektedir.
Resveratrolün ıshikawa endometriyal kanser hücrelerindeki apoptozis ve otofaji üzerine etkileri
Endometriyum kanseri, kadınlarda jinekolojik kanserler içinde birinci sırada yer alan bir kanser tipidir. Tanı ve tedavi aşaması üzerine olan çalışmalar son zamanlarda önem kazanmıştır. Mevcut tedavi seçeneklerine ek olarak geleneksel ilaçlar geliştirilmeye çalışılmaktadır. Resveratrol, antiinflamatuvar, antikanser etki gibi birçok biyolojik etkisi olan bir fitoaleksindir. Resveratrol'ün kanserdeki terapötik etkisini hücre ölüm mekanizmaları yoluyla gösterdiği düşünülmektedir. Ancak bu etkilerinin mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmada Resveratrol'ün endometriyal kanser hücre hattı olan Ishikawa hücreleri üzerindeki doz bağımlı etkilerini araştırmak amaçlanmıştır. Resveratrol' ün Ishikawa hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisi MTT testi ile belirlendi. IC50 dozu ile RT-qPCR ile Apoptoz ve Otofaji İlişkili Genlerin mRNA Ekspresyon Analizi gerçekleştirildi. IC50 dozu uygulandıktan sonra immunoflorasan boyama yapıldı. Resveratrol'ün, Ishikawa hücrelerinin proliferasyonunu doza bağlı bir şekilde inhibe ettiği görüldü. IC50 doz grubu, kontrol grubu hücreleri ile mRNA ekspresyon düzeylerine göre karşılaştırıldığında Beclin-1, LC3-I, LC3-II, Casp-7, Casp-8, Casp-9, CycS ve FADD düzeylerinde anlamlı bir artış gözlendi. Çalışmamızda, Resveratrol'ün apoptozisi ve otofajiyi indüklemesi kanser tedavisinde kullanılabilecek bir ajan olabileceğini düşündürmüştür. Resveratrol'ün anti kanser özelliklerinin klinik çalışmalarla da değerlendirilmesi; yeni tedavi stratejileri geliştirmek için önem arz etmektedir. Anahtar kelimeler: Ishikawa hücreleri, hücre ölüm mekanizmaları, Resveratrol
Replikasyon defektif adenovirüsün apoptoz ve otofaji yolaklarının tümör hücre hatları üzerinde etkileri
Adenovirüsler moleküler biyolojide yüksek verimli gen transferi için sıklıkla kullanılmaktadır. Konakçısını enfekte eden Adenovirüs, ölüm mekanizması olarak adlandırılan Apoptoz Yolağını indükleyerek hücre ölümüne neden olur. Apoptoz, kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları engellemek için hücrelerin normal fizyolojik süreçlerinde karşılaştığı bir süreçtir. Aynı zamanda sitoprotektif mekanizma olan Otofaji de Adenoviral enfeksiyon sürecinde hücre ölümüne neden olmaktadır. Gen tedavisi çalışmalarında genellikle replikasyon defektif adenovirüsler kullanılmaktadır. Bu virüslerin, doğal adenovirüs gibi hücre ölümüne yol açmaması beklenmektedir. Replikasyon defektif adenovirüslerin apoptoz ve otofaji indükleme potansiyelleri konusunda yeterli çalışma bulunmamaktadır. Tez çalışmamızda, COVID-19 aşı tedavisi için geliştirilmiş ve klinik çalışmalarda kullanılan bir rekombinant adenoviral vektörün CoVacHG (Ad-spike proteini)'nin hücrelerde apoptoz ve otofaji sürecinde etkili olan genlerin ifadeleri üzerindeki etkisine hem mRNA hem de protein düzeyinde incelenmiştir. CoVacHG ile enfekte edilen normal hücrede, koruma mekanizması aktifleşmiş fakat hücreler ölüme gitmemiştir. Bu sonuçlar adenoviral vektörlerin sağlıklı bireylerde aşı vektörü olarak güvenilir olabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca kanser aşısı olarak tasarlanan Ad-CD-GMCSF vektörünün de apoptotik ve otofajik genler üzerindeki etkisine hem mRNA hem de protein düzeyinde incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre Ad-CD-GMCSF ile enfekte edilen normal hücrede, koruma mekanizmasının aktifleşmiştir. Aşının kanser hücrelerinde ise kanser tipine göre farklı sonuçlar elde edilmiştir. Akciğer kanser hücrelerinde hücrelerin aşıya daha duyarlı olduğu fakat meme kanseri hücrelerinin daha dirençli olduğu bulunmuştur. Bu nedenle adenoviral vektör aşısının meme kanseri hücrelerini apoptoza götürmediğini düşündürmektedir.
Sıçan pankreatik beta hücre hattında (INS-1E) lipotoksisiteye verilen cevapta fonksiyon gösteren parkin proteininin regülasyonunda rol alan mikroRNA'ların saptanması
Tip 2 diyabet (T2D); hiperglisemiye neden olan, periferal insülin direnci ve pankreatik beta (β) hücrelerinden bozulmuş insülin salınımı ile karakterize endokrin ve metabolik bir bozukluktur. Endoplazmik Retikulum (ER) ve Mitokondriyon'da (Mt) oluşan problemler sonucu bozulan lipit ve kalsiyum homeostazı, ER stresi, Mt fonksiyon bozukluğu, ER ve Mt arası iletişim bozuklukları, otofaji mekanizmasının bozulması ve T2D sürecinde; insülin direnci ve pankreatik β hücre fonksiyon kaybı olarak kendini göstermektedir. Park2 geninin ürünü ve bir E3 ubikuitin protein ligaz olan Parkin proteini otofaji ve mitofajiye aracılık eden aynı zamanda sahip olduğu ubikuitinasyon yeteneği sayesinde; DNA onarımı, transkripsiyon, translasyon, organel trafiği, proliferasyon, inflamasyon ve hücre ölüm/sağkalım yolaklarında aktif rol almaktadır. İnsülin direnci ve T2D'in en temel nedenlerinden olan lipotoksisiteye karşı Parkin proteininin hücre sağkalımını otofaji üzerinden desteklediği, Parkin proteininin yokluğunda ise hücrenin apoptoza yönelim gösterdiği bilinmektedir. Minimal lipotoksisite farklılıklarında Park2 geni ifade düzeyi ve proteinin fonksiyonunda hızlı değişimler meydana gelmektedir. Bu durum Parkin protein regülasyonunun hızlı hareket eden RNA interferans (RNAi) mekanizması üyesi mikroRNA'lar (miRNA) ile düzenlenebileceği hipotezini ortaya çıkarmıştır. Buradan yola çıkarak bu tez çalışmasında biyoinformatik yaklaşımlar ve deneysel analizler bir arada kullanılarak ER ve Mt'de organel stresine neden olan palmitik asitle (PA) oluşturulan lipotoksik koşullarda Parkin proteini varlığında ve siRNA aracılı olarak Park2 geninin sessizleştirildiği koşullarda pankreatik beta hücrelerinde meydana gelen miRNA ifade farklılıkları incelenmiştir. Gerçekleştirilen miRNA profillemesi ve yapılan ileri biyoinformatik analizler ile validasyon çalışmaları sonunda hücre sağkalımında rolü olan Parkin proteininin regülasyonunda görev aldığı düşünülen rno-miR- 96-5p, rno-miR-153-3p, rno-miR-30e-3p ve rno-miR-344a-5p miRNA'ları öne çıkmıştır. Bu miRNA'ların özellikle, hücre sağkalım, otofaji, apoptoz, T2D ve insülin sinyalizasyon yolaklarında etkin olduğu gösterilmiştir. Aday miRNA'ların hedeflediği genlerin ifadelerinin validasyonları için gerçekleştilen Gerçek Zamanlı PZR çalışmaları da seçilen miRNA'ların bu süreçteki düzenleyici rollerini destekler niteliktedir.
Sıçan miyokardit modelinde insülin benzeri büyüme faktörü (IGF-1)'in kardiyoprotektif etkileri
Doksorubisin (Dox) oksidatif hasara bağlı kardiyotoksisik etkisi nedeniyle miyokardite neden olmaktadır. İnsülin benzeri büyüme faktör (IGF)-1 antiinflamatuvar, antiapoptotik ve antioksidan özelliğe sahip kardiyovasküler sistem üzerinde etkili farmakolojik bir ajandır. Yapılan çalışmada Dox ile indüklenen miyokardit modelinde IGF-1'in moleküler mekanizmalarının aydınlatılması ve kardiyoprotektif etkilerinin araştırılması amaçlandı. Wistar albino erkek sıçanlar Kontrol, Dox (4mg/kg/hafta), IGF-1 (1 µg /kg iki gün arayla) ve Dox + IGF-1 (4mg/kg/hafta Dox ve 1 µg /kg iki gün arayla IGF-1) olarak 4 gruba ayrıldı ve tüm uygulamalar intraperitoneal olarak yapıldı. 4 haftalık deney protokolünün sonunda Ketamin ve Ksilazin anestezisi altında sakrifikasyon yapıldı. Kan serumundan CK-MB ve Troponin-I seviyeleri biyokimyasal analizlerle ölçüldü. Kalp dokusundan histopatolojik ve immünohistokimyasal (Kaspaz-3 ve ICAM-1) değerlendirmeler yapıldı. Ayrıca kalp dokusundan ELISA yöntemiyle TNF-α, IL-6, TAS ve TOS seviyeleri ile RTPCR yöntemiyle Beclin-1, SQSTM1, LC3, HIF-1α, iNOS, SERCA2a ve MasR gen ekspresyonları analiz edildi. Dox uygulaması histopatolojik ve immünokimyasal skorları, CK-MB, Troponin-I, TNF-α, IL-6 seviyelerini ve TOS/TAS oranını arttırdı. Moleküler analizler sonucunda Beclin-1, SQSTM1, LC3, SERCA2a, MasR ve HIF-1α ekspresyonlarını indükleyerek kardiyak hasara neden oldu. IGF-1 tedavisi sonrasında hasar parametrelerinde anlamlı seviyede iyileşme görüldü. Dox ile indüklenen miyokardit modelinde IGF-1'in SERCA2a/ MasR sinyal yolağı aracılı otofajiyi inhibe ederek kardiyoprotektif etki sağladığı bulundu. IGF-1'in Dox ile indüklenen miyokardit modelinde inflamatuvar süreçlerin düzenlenme, oksidatif hasarı azaltma, apoptotik hücre ölümü ve otofajiyi inhibe etme mekanizmalarıyla terapötik etki sağladığı bulundu.
Onkogenik wip1 fosfatazın metabolik stres indüklü otofaji aktivasyonunda rolünün araştırılması
Amaç: Bu çalışmada Wip1'i aşırı ifade eden nöroblastom (SH-SY5Y) ve meme kanseri (MCF- 7) hücreleri kullanılarak hipoksi ve açlık ile metabolik stres aracılı otofajide Wip1 'in rolü araştırılmıştır. Gereç ve Yöntem: MCF-7 ve SH-SY5Y hücre hatlarına Western Blot, MTT analizi, Annexin V/7AAD analizi, immün çöktürme ve immün floresan teknikleri uygulanmış olup elde edilen verilerin istatistiki analizi 'one-way ANOVA' ile yapılmıştır. Bulgular: Yapılan Western blot ve immün floresan yöntemi ile belirlenen konsantrasyonların otofaji indüksiyonunu sağladığı saptandı. MCF-7 ve SH-SY5Y hücre hatlarında otofaji indüksiyonu için belirlenen konsantrasyonların MTT ve Annexin V/7AAD analizi aracılığıyla hücre ölümünü tetiklemediği gösterilmiştir. Wip1-ULK1 ilişkisi ise immünçöktürme ve western blot teknikleri aracılığıyla gösterilmiştir. Sonuç: Yapılan deneyler sonucunda Wip1 fosfatazın otofaji başlangıç kompleksinde görevli temel bir protein olan ULK regülasyonunda etkili bir fosfataz olduğu açığa çıkarılmıştır. Yapılan Western blot ve immün çöktürme yöntemleri ile elde edilen veriler, Wip1 fosfatazın ULK defosforilasyonunda rol aldığına işaret etmektedir. Anahtar Kelimeler: Hipoksi, MCF7, Metabolik Stres İndüklü Otofaji, SH-SY5Y, Wip1 fosfataz
Genotoksik stres indüklü otofaji ilişkili sekretom'un doğal öldürücü hücre aracılı antitümör immün yanıt üzerine etkisinin araştırılması
Amaç: Bu tezin amacı, kemoterapi ajanı etoposid ile indüklenen genotoksik stres aracılı otofajiye bağlı oluşan otofajik sekretomun karakterize edilmesi ve bu sekretom içeriğinin MCF-7 meme kanseri hücrelerine yönelik NK aracılı immün cevabı etkileyip etkilemediğinin araştırılmasıdır. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada MCF-7, kontrol-NK92 ve DNAM1-NK92 hücre dizileri kullanılmıştır. Etoposid aracılı otofaji indüksiyonu, LC3I/II ve p62 western blot ve immünfluoresan analizleriyle ölçülmüştür. Hücrelerde apoptoz oranı Annexin V/7AAD analizi ile ölçülmüştür. Otofajik sekretom karakterizasyonu LC/MS-MS ve sitokin array analizleri ile yapılmıştır. Sitokinlerin validasyonu da ELISA analizi ile yapılmıştır. Kontrol-NK92 ve DNAM1-NK92 hücrelerinin MCF-7 hücrelerini hedefleme kapasitesi degranülasyon analizi ile belirlenmiştir. Bulgular: 24 saat süre ile 150 μM Etoposid ile MCF-7 hücrelerinde otofajinin indüklendiği LC3I/II ve p62 gibi otofaji belirteçleri ile gösterilmiştir ve kemoterapi indüklü otofajinin apoptoza neden olmadığı tespit edilmiştir. LC/MS-MS sonuçları ile kemoterapi indüklü otofaji sırasında metabolik enzimlerin, tümör antijenlerinin, şaperonlar ve metastazla ilişkili proteinlerin salgılandığı tespit edilmiştir. Ayrıca, sitokin array analizi ile de sekretom içerisinde 41 farklı sitokin/kemokin ve büyüme faktörü tespit edilmiştir ve CCL5, TGFβ ve IL10 gibi bazı sitokin, kemokin ve büyüme faktörü için ELISA analizleri ile validasyon yapılmıştır. Son olarak, kontrol NK-92 ve DNAM1-NK92 hücrelerinin otofajik sekretomlarla muamele edilmesinin ardından, MCF-7 hücrelerini hedefleme kapasitesinde gruplar arasında farklılıklar olduğu görülmüştür. Sonuç: Tez kapsamında ilk kez kemoterapi ile indülenen otofajik sekretomun içeriği tümüye karakterize edilmiştir. İn vitro şartlarda, kemoterapiye bağlı otofaji indüksiyonunun NK hücre efektör fonksiyonlarını uyarıp uyarmadığını ve antikanser aktivitesine katkıda bulunan ilaç kaynaklı stres türlerini nasıl algıladığını ve bunlara nasıl tepki verdiğini belirlemede önemli veriler elde edilmiştir.
Metformin'in yanık staz zonu üzerindeki etkisinin araştırılması
Isıya maruz kalma yaralanmaları sonucunda, deride yanık yarası meydana gelmesi yanık olarak tanımlanır. Yanık sık karşılaşılan ciddi bir problemdir. Yanık yarası, hem yaralanma yeri ve çevresinde lokal etkilere hem de tüm vücudu ilgilendiren genel bir yanıta sebebiyet verir. Yanık oluşan bölgede meydana gelen lokal etkiler ve vücudun herhangi bir bölgesinde ortaya çıkabilecek tüm sistemik etkiler, belirgin bir ayrım noktası olmadan devamlılık gösterir. Yanık yarasının karmaşık yapısı, yanıkla ilgilenen tüm hekimleri zorlayan bir konudur. Bu nedenle hekimin yanık tecrübesi çok önemlidir. Yanıktaki patofizyolojik değişikliklerin daha iyi anlaşılması ve bu konularda yapılan çalışmalar, yanık tedavisinde daha başarılı olunmasına imkan verir. Jackson, yanığı destrüksiyonun şiddeti ve kan akımı değişimlerini baz alarak üç farklı zona ayırmıştır. Dış çevre tabakada, artmış kan akımını içeren hiperemi zonu bulunur. En merkezde koagülasyon zonu adı verilen, koagülasyon nekrozu ile karakterize bölge bulunmaktadır. Bu iki bölgenin arasında ise iskemiye uğramış dokuların bulunduğu, erken dönemde hücre ve doku hasarının geri dönüşümlü olduğu staz zonu bulunmaktadır. Staz zonundaki hücrelerin canlılığını yitirip nekroz olmamaları için hastanın destekleyici tedavisinde geç kalınmamalıdır. Eğer uygun koşullar sağlanırsa ve patolojik değişiklikler durdurulabilirse, staz zonundaki hücrelerin nekroz olması önlenebilir. Staz zonunu kurtarmak için birçok molekül deneysel olarak araştırılmıştır ve birçok çalışmada devam etmektedir. Son yıllarda yanık ile ilgili yapılan güncel çalışmalar çoğunlukla staz zonunun kurtarılması ile ilgilidir. Bu çalışmanın amacı staz zonunun kurtarılmasında etkin ve maliyeti uygun bir çözüm bulabilmektir. Otofaji, hasarlı hücrelerin kendilerini sindirerek enerji ve besin oluşturması ve bu şekilde diğer hücrelerin yaşamasına destek sağlanması olarak tarif edilmektedir. Yanıklı derideki staz zonunda ilk 48 saatte normal deriye göre otofajinin azaldığı bilinmektedir. Yanıkta oluşan termal hasar ve yanık bölgesinde oluşan reaktif oksijen türevleri hücre ölümünü artırmakta, hücreler otofaji ile hasarlı organeller sindirilerek enerji elde edip hücre ölümünden kurtulabilmektedir. Birçok çalışmada metforminin AMPK (adenozin monofosfat aktive edici protein kinaz) aktivasyonu ile otofajiyi indüklediği gösterilmiştir. Yanık patofizyolojisinde yanıklı derideki azalmış otofajiyi metformin ile artırarak, geri dönüşümü olan staz zonunu kurtarmayı amaçladık. Bu çalışmada her iki grup 10 denek olacak şekilde 20 adet Sprague- Dawley tipi ratlar kullanıldı. Her iki grubun sırtlarında Comb yanık modeline uygun olarak pirinçten yapılmış plak ile kutanöz yanık yarası oluşturuldu. Birinci grup, kontrol grubu olarak belirlendi. Kontrol grubuna herhangi bir ilaç uygulaması yapılmadı. İkinci grup, deney grubu olarak belirlendi ve yanık modeli oluşturulduktan sonra ilk günden başlanarak günlük 100 mg/kg intraperiteonal metformin yapıldı. Ratlardan 24.saat ve 7.gün sonunda biyopsiler alınarak histopatolojik, immünohistokimyasal, tunel testi çalışmaları yapıldı. 7.gün sonunda ratlar sakrifiye edildi. Histopatolojik parametreler olarak inflamasyon yoğunluğu, ülserasyon, epitelizasyon, nekroz ve ödem ölçümleri yapıldı. Deney grubu, kontrol grubuyla kıyaslandığında deney grubunda tüm histopatolojik parametlerde doku hasarı düşük bulundu. İmmünohistokimyasal olarak beclin-1 ve AMPKa1 antikor ölçümleri yapıldı. Deney grubunda 24. Saat ve 7. Günde, kontrol grubuna kıyasla antikor ölçümleri anlamlı derecede yüksek bulundu. Tunel testi sadece 24. Saatte bakıldı. Deney grubunda belirlenen apoptozis oranı, kontrol grubuna göre düşük bulundu. Çalışmamızın sonucunda ratlarda deneysel olarak oluşturulan staz zonu modelinde metforminin otofajiyi artırdığı, apoptozisi azalttığı ve inflamasyon yoğunluğunu azalttığı staz zonunun kurtarılmasında olumlu bir etkisi olduğu gösterilmiştir. Bu konu üzerinde ileri klinik ve deneysel çalışmalara ihtiyaç vardır. Anahtar Kelimeler: Staz zonu, metformin, yanık, otofaji
Apoptoz, otofaji ve retrograde transkripsiyonun CYC1, SUC2 ve GPD1 genlerinin ekspresyonlarına etkilerinin incelenmesi
Apoptoz hücrenin fizyolojik ve patalojik şartlarda kendini ortadan kaldırmasını sağlayan, bir programlanmış hücre ölüm mekanizmasıdır. Otofaji ise hücrede açlık durumlarında veya farklı uyaranların etkisi ile hasarlı organellerin ve bazı proteinlerin otofagosom denilen bir çift katlı membran yapısı içinde biriktirilerek geri dönüştürülmesidir. Retrograd kontrol ise mitakondriden nükleusa sinyal iletim mekanizması olup mitokondriyel hasarlar veya Krebs döngüsü bozuklukları ile aktive edilebilir. Bu sinyallere bağlı olarak aktive edilen transkripsiyon faktörleri nükleusa girerler ve hedef genleri ekspres ederek mitakondriyel hasarların onarılmasını sağlarlar. S. cerevisiae'da GPD1, CYC1 ve SUC2 genleri sırasıyla gliserol-3-fosfat dehidrojenaz enzimini, sitokrom-c, izoform-1 proteinini ve invertaz enzimini kodlarlar. Bu araştırmada S. cerevisiae'da apoptoz, otofaji ve retrograd kontrolün, GPD1, CYC1 ve SUC2 genlerinin transkripsiyonuna etkileri incelendi. Apoptoz koşullarının aktivasyonu ile GPD1, CYC1 ve SUC2 genleri transkripsiyonlarının baskıladığı görüldü. Otofaji koşullarında ise yaban tip maya suşunda GPD1 geni transkripsiyonunda düşük seviyelerde azalma görülürken, CYC1 geni transkripsiyonu etkilenmedi. SUC2 geni ekspresyonunun ise 3-kat baskılandığı görüldü. Apoptoz ve otofaji koşullarında Hog1p ve Tor1p kinazlarının bu genlerin transkripsiyonlarına farklı etkileri olduğu görüldü. İnvertaz aktivitesi ölçüldüğünde apoptozun invertaz sekresyonunu tamamen önlediği otofaji aktivasyonunun ise invertaz sekresyonuna önemli etkisi olmadığı bulundu. Retrograd kontrol mekanizmasının transkripsiyon faktörleri olan Rtg1/3p kompleksi retrograd hedef genlerinin promotorlarında R kutusu denilen sekansa bağlanmaktadır. GPD1, CYC1 ve SUC2 genlerinin promotorları R-kutusu sekansları için biyoinformatik araçlar ile analiz edildi. GPD1, CYC1 ve SUC2 genlerinin promotor bölgelerinde çok sayıda R-kutusu sekansı olduğu bulundu. Bu sonuçlar hücrede önemli metabolik işlevleri olan GPD1, CYC1 ve SUC2 genlerinin transkripsiyonlarının apoptoz, otofaji ve retrograd sinyal mekanizmalarına bağlı olarak belirli derecelerde kontrol edildiğini göstermektedir.
Şizofreni hastaları, sağlıklı kardeşleri ve sağlıklı kontrollerde serum beclin-1 ile ATG5 düzeylerinin incelenmesi
Çalışmamızda şizofreni tanılı hastalar ve hastaların sağlıklı kardeşleri ile kontrol grubu arasında otofaji adı verilen bir hücresel süreçte önemli rol oynayan Beclin-1ve Otofaji ile ilişkili 5 (Atg5) proteinlerinin düzeylerinin ölçülmesi, gruplar arasında fark olup olmadığının araştırılması ve otofajinin şizofreni etiyopatogenezindeki rolünün değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Araştırma kapsamında, DSM-5 tanı kriterlerine göre şizofreni tanısı konulan 26 hasta, bu hastaların 26 sağlıklı kardeşi ve 26 kontrol dahil edilmiştir. Tüm katılımcılar için, sosyodemografik ve klinik bilgi formu doldurulmuştur. Şizofreni tanısı konulan hastalara Negatif Semptomları Değerlendirme Ölçeği (SANS), Pozitif Semptomları Değerlendirme Ölçeği (SAPS) Apati Değerlendirme Ölçeği (ADÖ) ve Kısa Form-36 (SF-36) ölçeği uygulanmıştır. Katılımcıların serum Beclin-1 ve Atg5 seviyeleri, ELISA yöntemiyle ölçülmüştür. Verilerin istatistiksel analizinde SPSS 22,0 Windows versiyon paket programı ve MedCalc 19.8 paket programı kullanılmıştır. P<0,05 anlamlı kabul edilmiştir. Hasta ve kontrol grubu Beclin-1 ve Atg5 değerleri bakımından karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde fark olduğu saptandı (her biri için p<0.05). Hasta ve sağlıklı kardeş grubu Beclin-1 ve Atg5 düzeyleri karşılaştırıldığında anlamlı fark saptanmadı (p>0.05). Sağlıklı kardeş ve kontrol grubunun Beclin-1 ve Atg5 değerleri arasında istatistiksel açıdan anlamlı fark vardı (p<0.05). Yapılan korelasyon analizinde hastaların Beclin-1 ile Atg5 düzeyleri arasında ilişki saptanmazken, sağlıklı kardeş grubunda pozitif yönde orta şiddette bir ilişki bulundu(r=0,488; p=0,011). Bu çalışma, bildiğimiz kadarıyla şizofreni hastaları ve sağlıklı kardeşleri arasında Beclin-1 ve Atg5 düzeyinin değerlendirildiği ilk araştırmadır. Çalışmamız şizofreni etiyolojisinde otofajinin rol oynayabileceğini ve otofajinin şizofreni hastalarının ve sağlıklı kardeşlerinde de benzer düzeyde bozuk olduğunu göstermesi açısından önemlidir. Bu durumun bir endofenotipik özellik olarak yorumlanabilmesi ve Beclin1, Atg5 düzeylerinin marker olarak kullanılabilmesi için daha büyük örneklemlerde ve farklı ırkların dahil edildiği çalışmalara ihtiyaç vardır.
Küçük hücreli dışı akciğer kanserinde otofaji gen ekspresyon profilinin klinik ve patolojik parametrelerle ilişkisi
Son yıllarda otofajinin karsinogenezdeki rolü ile ilgili birçok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmalarda otofajinin hem karsinogenezin başlatılması, hem kanser hücrelerinin sağkalımının sağlanması hem de bunlara zıt olarak apoptozdan kaçan kanser hücrelerinin yok edilmesinde bir mekanizma olarak görev yapabileceği yönünde kanıtlar bulunmaya başlanmıştır. Özellikle tedavide otofajinin manüplasyonu (inhibisyonu veya aktivasyonu) ile başarılı olunabileceği fikri doğmuştur. Ancak elimizdeki veriler bu soruların aydınlatılması için henüz çok yetersizdir. Günümüzde birçok araştırma bu konu üzerine odaklanmaktadır. Akciğer kanserinde de özellikle tedavi önündeki en büyük engellerden birinin kanser hücresinin ölüm sinyalizasyonundaki disregülasyon olduğu bilinmektedir. Biz bu çalışmada otofaji yolağında rol alan genlerin ekspresyonlarının akciğer kanserinin farklı klinik evrelerinde, farklı patolojik tiplerinde nasıl değişkenlik gösterdiğini ve ayrıca hastaların diğer klinik parametreleriyle (sigara içme, sağkalım ve progresyon gibi) ilişkilerini araştırmayı planladık. Ancak gen ekspresyon verilerinin eldesinde bazı teknik olumsuzluklar nedeniyle istatiksel olarak anlamlı bilgilere ulaşamadık. Örneklem sayısının daha geniş tutulduğu ve daha iyi korunmuş patoloji preparatlarından ileride buna benzer bir çalışmanın yapılması gerektiğine inanıyoruz. İleride akciğer kanseri gibi diğer kanser tiplerinde de benzer çalışmaların yapılması özellikle tedavi alanında çok önemli bilgiler sağlayacaktır.
Kolorektal kanserinde otofaji gen ekspresyon profilinin klinik ve patolojik parametrelerle ilişkisi
Kolon kanseri tüm dünyada kadınlar ve erkeklerde üçüncü en sık gözlenen kanserdir. Yılda yaklaşık 1.200.000 yeni vaka ve yaklaşık 609.000 ölüm tahmin edilmektedir. Erkek ve kadınlardaki kanserlerin yaklaşık %10?unu oluşturmaktadır. Erken evre kolorektal kanser'in (KRK) primer tedavisi cerrahidir ve yüksek oranda kür sağlanabilir. Ancak nüks ve metastatik hastaların prognozu kötüdür ve median yaşam süresi 24 ay kadardır. Hastaların yaklaşık olarak yarısında metastaz gelişmektedir. Bu hastalarda temel tedavi kemoterapidir. Yeni kemoterapi ajanları ve hedefe yönelik ajanlar ile cevap oranları ve yaşam süresinde artış olmuştur. Otofaji kendi kendini yeme anlamına gelir. Otofaji uzun ömürlü proteinlerin, hasarlı organellerin, mikroorganizmaların ve virüslerin hücre içerisinde paketlenip lizozoma taşınarak parçalanması süreci olarak bilinmektedir. Otofaji genleri (Atg); otofajinin düzenlenmesinde rol oynarlar. Otofaji sitoplazmada otofagozom denilen çift zarlı keseciklerin varlığıyla tanımlanır. Yakın zamanda yapılan çalışmalarda otofajinin metabolizma, kanser, nörodejeneratif hastalıklar, enfeksiyonlar, morfogenez, yaşlanma, hücre ölümü ve bağışıklık sisteminde de rol oynadığı görülmüştür. Otofaji, hem hücrenin yaşatılabilmesi hem de hücre ölümü olmak üzere zıt iki role sahiptir. Otofaji hücre ölümüne de neden olduğundan dolayı programlı hücre ölümü II olarak isimlendirilmiştir. Otofajinin kanser ile ilişkisini ortaya koyan çalışmalar sonucu kanserde yeni tedavi stratejileri olarak otofaji sinyal yollarını hedefleyen ilaçlar geliştirilmektedir. Örneğin otofaji yolağını tetikleyerek etki gösteren mTOR inhibitörleri klinik olarak renal karsinom tedavisinde kullanılmaktadır. Çalışmamızda hem kanser oluşumunun erken evrelerinde hem de ileri evre kanserlerin progresyonunda önemli role sahip olduğu düşünülen Otofaji yolağı ile ilişkili 94 gen'in RT-PCR yöntemi ile normal kolon dokusunda ve tümör dokusunda ekspresyon düzeylerine bakıldı. Normal dokuda ve tümöral dokudaki gen ekspresyon düzeyleri karşılaştırıldı. Bu genlerden 47 tanesinin ekspresyon düzeyi tümör dokusunda anlamlı derecede daha yüksek bulundu. Bu sonuçlar hastaların demografik ve histopatolojik özellikleri ile karşılaştırıldı ve aralarında anlamlı bir ilişki olmadığı saptandı. Anahtar kelimeler: Kolorektal Kanser, Otofaji, Gen Ekspresyonu
Mir-96 ifadesinin otofaji üzerinde etkisinin meme kanseri hücre hatlarında araştırılması
Kanser hücrelerinde mikroRNA'ların (miRNA) ifade seviyelerindeki farklılıklar kanser araştırmacıları için ciddi bir araştırma konusu olmuştur. Tüm kanserlerde olduğu gibi meme kanserinde de kanserleşmeyi teşvik eden veya kanserinin oluşmasını baskılayan miRNA'lar bulunmaktadır ve her geçen gün bunlara yenileri eklenmektedir. miRNA'ların günümüzde meme kanserinin teşhisi, tedavisi, ilerleyişi ve kanserin ilaca verdiği cevap konusunda kullanılabileceği düşünülmektedir. miR-96 meme kanserinde kanserin seyrinin kötüleşmesine sebep olduğu bulunmuştur. Meme kanserinde otofaji yolağının rolünün aydınlatılması kanserin tedavisinde ve ilaçların etkileşimlerinde büyük önem arz etmektedir. Her2 pozitif meme kanserinde trastuzumab ilacı sıklıkla kullanılmaktadır fakat bu ilaç çok fazla etkin değildir. Ayrıca özellikle üçlü negatif meme kanserinde de etkin bir ilaç henüz bulunamamıştır. Everolimus ilacı da mTOR baskılayıcı, dolayısıyla otofaji yolağını uyarıcı rolü olan bir ilaçtır ve meme kanserinde faz çalışmaları yapılmaktadır. Bu çalışmada meme hücre hatlarında miR-96 ifadesi ve miR-96'nın tahmini olarak hedeflediği otofaji ile ilişkilendirilen ATG16L1, ATG9A, ATG7, CTSB, TP73 genlerinin gen ifade seviyeleri ilaç verilmeden, trastuzumab ve everolimus ilaçları ayrı ayrı ve birlikte verilerek araştırılmıştır. miR-96 RT-PCR, ATG16L1, ATG9A, ATG7, CTSB, TP73 genleri fluidigm cihazı ile qRT-PCR yöntemi kullanılarak ifade seviyelerine bakılmıştır. Yapılan gen ifade analizlerinde miR-96'nın normal epitelyum hücre hattına göre MCF-7 ve SKBR-3 meme kanseri hücre hatlarında anlamlı bir artış saptanmıştır. MiR-96'nın tahmini hedeflediği genlerde normal epitelyum hücre hattına göre: SKBR-3'te ATG16L1, ATG9A, ATG7 genlerinde düşüş; CTSB geninde her iki hücre hattında da düşüş; TP73 geninde ise sadece MCF-7'de aşırı bir artış anlamlı olarak gözlemlenmiştir. Everolimus ilacı verildiğinde MiR-96'da bütün hücre hatlarında anlamlı bir artış saptanmış; everolimus ve trastuzumab ilaçlarının her ikisi verildiğinde ise sadece MCF-7'de anlamlı bir artış gözlemlenmiştir. Anahtar Kelimeler: MiR-96, otofaji, meme kanseri hücre hatları, trastuzumab, everolimus.
Meme kanserli hastalarda ARSA, CXCR4, HGS, HPRT1, HDAC1, HTT, SNCA, SQSTM1 VE INS genlerinin ifadelerinin araştırılması
Otofajinin bozulmasının kanser hastalıkları başta olmak üzere birçok patolojiye sebep olabileceği ileri sürülmektedir. Bu araştırmada meme kanser hücrelerinde otofajik gen ailesinin ifade düzeylerinin incelenmesi amaçlandı. Böylece meme kanserinin dokularda henüz klinik değişiklikler oluşmadan gen analizleri ile erken teşhisi ve yakın gelecekte kanser için gen tedavisinin moleküler temellerinin daha fazla aydınlatılmasına destek olunması hedeflendi. Meme kanserli 71 hastanın ameliyat sırasında tümörlü ve sağlam meme dokularından örnekler alındı. Dokular Tıbbi Biyoloji ve Genetik labaratuarında taze doku örneklerinden "Qiagen " RNA izolasyon kiti kullanılarak RNA elde edildi. Nano teknoloji temelli yüksek kapasiteli Real Time Polymerase Chain Reaction(PCR) ile gen ekspresyon çalışması BioMark™ HD System ile yapıldı. ARSA, CXCR4, HGS, HPRT1, HDAC1, HTT, SNCA, SQSTM1 ve INS otofajik genlerinin expresyon düzeyleri ölçüldü. Otofaji gen ekspresyonu analizi için oluşturdukları pikler, Ct değerleri ve kopya sayıları ayrı ayrı analiz edilerek 2–ΔCt metodu kullanılarak istatistiksel analiz yapıldı. Çalışmaya 71 kadın hasta dahil edildi. Yaş ortalaması 47,6 idi. Hastaların 62(%87, 3)'sinin patolojisi invaziv duktal karsinom olarak tespit edildi. Tüm evrelerden hastalar mevcuttu. Tümör dokusunda CXCR4, HPRT1, HDAC1 gen ekspresyonlarında anlamlı artış, ARSA, HGS, HTT, SNCA, SQSTM1, INS gen ekspresyonlarında azalma saptandı. Otofajinin kanser gelişiminde ve ilerlemesinde apopitosiz gibi rol oynadığı aşikardır.Bu önemli yolağın sonraki çalışmalarda araştırılmaya devam edilmesi kanserin erken tanı ve tedavisine katkı sağlayabileceği fikrini akla getirmektedir. Anahtar kelimeler: Chemokine Receptor Type 4, Histone Deacetylase 1, Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1, Gen Ekspresyonu, Meme Kanseri, Otofaji
Mukozit oluşturulmuş sıçanlarda farklı dalga boylarındaki lazer uygulamalarının otofajik mekanizmaya olan etkisinin incelenmesi
Günümüzde doku iyileşmesinde, yüksek doz radyasyonun aktif etkisinin olduğu bilinmektedir. Düşük doz radyasyonda ise tedavi gerçekleşmemektedir. Bu konunun aydınlatılmasında, radyasyonun haraplanmış bir doku üzerindeki tedavi başarısı ile apoptotik mekanizmasının kıyaslanması önem arzetmektedir. Bunun için çalışmaya 35 adet yetişkin Wistar Albino türü sıçan dahil edildi. Bütün sıçanlara, ilk gün 100 mg/kg, üçüncü gün 65 mg/kg 5-fluorouracil (5-FU) verildi. Bunun yanında 3. ve 5. gün hayvanların sol yanakları 18'lik gauge iğnesi ile çizildi. Mukozit oluşumu klinik olarak saptandıktan sonra hayvanlar eşit sayıda 5 gruba ayrıldı. 4 gruba, 4 gün boyunca günde bir defa olmak üzere, farklı dalga boylarında lazer uygulaması yapıldı. Kontrol grubuna lazer uygulaması yapılmadı. 4. günün sonunda hayvanların sol yanaklarından ekzisyonel biyopsi ile doku örnekleri alındı. Alınan patolojik ve normal dokulardan, moleküler analiz değerlendirmeleri yapıldı. Bu amaçla, dokularda ileri moleküler analiz ile otofajik mekanizmada rol oynayan genlerin (Atg5, Atg7, Atg10, Beclin1 ve Ulk) ekspresyon analizi yapıldı. Sonuçlar, normalizasyon ve istatistiksel analiz ile değerlendirildi. Sonuç olarak; Nd:YAG lazer uygulamasında Ulk1, Beclin1 ve Atg5 ekspresyonunun artmış olması, 1,064 nm dalga boyundaki lazerin otofajik mekanizmayı çalıştırdığını düşündürmektedir. Fakat Diod lazer uygulamalarında Becn1, Atg10, Atg5 ve Atg7 ekspresyonlarının rakamsal olarak azaldığı tespit edilmiştir. Atg5 geni, hücrede otofagozomların uzamasından sorumlu olan gendir. Becn1 geni ise otofajinin kontrol mekanizmasındaki kontrol genidir. Bu genlerde ekspresyonların azalması, yapılan çalışmada model oluşturmak için kullanılan ilacın (5-FU) etkisine bağlı gelişen bir olay olabileceğini düşündürmektedir. Oral mukozite bağlı olarak, hücredeki homeostazın sağlanması için tedavi genlerinin ekspresyonları artarken, koruma amaçlı genlerin ekspresyonlarında bir azalma olması, daha ayrıntılı çalışmaların planlanmasını işaret etmektedir