Smf (submerged fermentatıon) yöntemi ile topraktan izole edilerek tanımlanan Bacillus subtilis'ten α-amilaz üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Çalışmamızda kullanılmak üzere Ergani'de bulunan Makam Dağı'ndan toprak örneği alınmıştır. Alınan toprak örneğinden bakteri izolasyonu gerçekleştirilmiştir.İzole edilmiş mikroorganizma üzerinde bazı biyokimyasal analizleri uygulanmış ve 16S rRNA tanımlanması yapılmıştır. Elde edilen veriler sonucunda, izole edilmiş olan bakterinin Bacillus subtilis olduğu belirlenmiştir. SmF tekniği ile üretilen Bacillus subtilis izolatına ait α-amilaz üretimi üzerine çeşitli parametrelerin etkisi araştırılarak optimum koşulları belirlenmiştir. Bakteri çoğalmasına ait optimum koşulların süre bakımından 32. saat, sıcaklık bakımından 37°C ve pH bakımından da pH 7.0 olduğu belirlenmiştir. Enzimin maksimum düzeyde üretildiği süre olarak belirlenen 48. saatte bakteri çoğaltma işlemi gerçekleştirilmiştir. Kültüre edilmiş olan bakteriden üst sıvı alınarak α-amilaz aktivite çalışması yapılmıştır. Enzimin aktivite gösterdiği optimum pH'sı 7.0 ve optimum sıcaklık da 37°C olarak belirlenmiştir. Bakteri tarafından kullanılacak azot ve karbon kaynaklarının enzim üretimindeki etkisi incelenmiştir. Elde edilen verilere göre azot kaynaklarını kullanan bakteriden kontrole kıyaslandığında daha düşük amilaz aktivitesi belirlenmiştir. Azot kaynakları arasında amonyum nitrat ve amonyum sulfat eklenmesiyle en yüksek spesifik aktivite gözlenmiştir. Enzim üretimi üzerine karbon kaynaklarının etkisine bakıldığında ise galaktoz değerinin kontrole yakın bir değer gösterdiği ve diğer karbon kaynaklarında ise enzim üretiminin azaldığı görülmüştür. Enzimin optimum koşulları belirlendikten sonra saflaştırma işlemine geçildi. Saflaştırılan amilazın molekül ağırlığı SDS-PAGE ile ~73 kDa olarak tespit edildi. Deterjanların bazılarının, saflaştırılan enzim aktivitesi üzerine etkisini saptamak için 0.005'lik Tween-40, SDS, TritonX-100, Tween-8 ve brij kullanılmıştır. Kullanılan deterjanlardan SDS'nin önemli ölçüde amilaz enzimini inhibe ettiği görüldü. Bazı metallerin, saflaştırılan enzim aktivitesi üzerindeki etkisi incelendiğinde CaCl2'nin aktiviteyi arttırdığı, MnCl2 ve MgCl2 metallerinin eklenmesi sonucunda herhangi bir değişiklik gözlenmediği, FeCl2, CuCl2, ZnCl2 ve HgCl2 metallerinin eklenmesiyle de enzim aktivitesinin önemli ölçüde inhibe edildiği belirlenmiştir.