Termofilik Anoxybacillus sp. AH1'de ?-amilaz enzimi üzerine çalışmalar

Bu çalışmada Dargeçit (Mardin) sıcak su kaplıcalarından izole edilen termofilik Anoxybacillus sp. AH1'de biyoteknolojik öneme sahip olan ?-amilaz enziminin bazı özelliklerinin araştırılması amaçlanmıştır.Anoxybacillus sp. AH1 NB besiyerinde üretildi ve değişik inkübasyon sürelerinde ?-amilaz aktivitesi ölçüldü. Maksimum enzim üretimi 12?24 saatleri arasında tespit edildi.pH ve sıcaklık etkisi sırasıyla pH 4.0?11.0 ve 30?90 oC'de hem ham enzimde hemde kısmi olarak saflaştırılan enzimde araştırıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 7.0 ve 60 oC olarak bulundu.Enzim üretimi üzerine değişik besiyerlerinin, % 1'lik farklı azot ve % 0.5-% 1 oranlarında farklı karbon kaynaklarının ve nişastaların etkisi incelendi. Maksimum enzim üretimi NB1 besiyerinde elde edildi. En iyi azot kaynağı pepton ve beef ekstrakt, en iyi karbon kaynağı ise % 0.5 oranlarındaki maltoz, glukoz ve laktoz olarak belirlendi. Ayrıca % 0.5 ve % 1 oranlarındaki patates nişastasının ve % 1 oranında çözünebilir nişastanın enzim üretimini arttırdığı tespit edildi.Enzim üretimi üzerine çeşitli konsantrasyonlarda CaCl2'nin etkisi araştırıldı. CaCl2 varlığında enzim üretiminin arttığı tespit edildi. Maksimum enzim üretimi 20 mM'da elde edildi.Anoxybcillus sp. AH1'de ?-amilaz kısmi olarak saflaştırıldı ve enzim aktivitesi üzerine bazı kimyasalların, metallerin, metal şelatörlerin ve deterjanların etkisi incelendi.MgCl2 (8 mM'da % 41) ve CaCl2'nin (8 mM'da % 70) ?-amilaz aktivitesini belirli oranlarda arttırdığı, ZnCl2 (0.5 mM'da % 85 ve 1 mM'da % 93), CuCl2'nin (0.5 mM'da % 76 ve 1 mM'da % 100) ve metal şelatörleri olan EDTA (10 mM'da % 63) ve 1,10-phenanthroline'nin (10 mM'da % 22) ise yüksek oranda inhibe ettiği tespit edildi. ß-mercaptoethanol (10 mM'da % 64) ve DTT'nin (10mM'da % 100) ?-amilaz aktivitesini geniş ölçüde arttırdığı, PCMB (4mM'da % 52) ve PMSF'nin (4mM'da % 60) ise enzim aktivitesini belirli oranlarda inhibe ettiği tespit edildi. Iodaacetamide ve N-ethylmaleimide'nin enzim aktivitesini çok az etkilediği görüldü. Enzim aktivitesinin çeşitli deterjanlar varlığında arttığı; fakat üre tarafından güçlü bir şekilde inhibe edildiği tespit edildi.Km ve Vmax gibi kinetik parametreleri ?-amilazın % 0.5-% 3 (w/v) oranlarında tamponda hazırlanan çözünebilir nişasta ile inkübasyona bırakılarak hesaplandı. Km ve Vmax değerleri Lineweaver?Burk plot'a göre sırasıyla 0.102 mM ve 0.929 µmol/dk. olarak hesaplandı.Enzimin 45 oC'nin üzerindeki sıcaklıklara duyarlı olduğu ve termal stabilitesinin gliserol ve sorbitol tarafından arttırıldığı belirlendi. % 30 gliserol varlığında enzimin 55 oC ve 60 oC' de 120 dakika sonunda orijinal aktivitesini sırasıyla % 99 ve % 85 oranında koruduğu tespit edildi.Enzimin elektroforetik analizi nondenatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile yapıldı.Anahtar Kelimeler:, Anoxybacillus sp. AH1, Biyoteknoloji, ?-amilaz enzim üretimi, enzim karakterizasyonu