Theileria annulata'nın tanısında serolojik (indirekt ELISA) ve moleküler (PZR, çoklu PZR ve lamp) yöntemlerin geliştirilmesi

Bu çalışmada sığırlarda Theileria annulata tarafından oluşturulan tropikal theileriosis hastalığının teşhisinde kullanılmak üzere yeni tanı metodları geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla geliştirilmek istenen tanı metodları, seroloji ve moleküler olmak üzere iki ana başlık altında toplanmıştır. Bunlar, i) ELISA yöntemiyle tropikal theileriosisin serolojik teşhisinde kullanılmak üzere rekombinant proteinlerin belirlenmesi, ii) tropikal theileriosis'in teşhisinde moleküler tanı yöntemlerinin (PZR, multiplex PZR ve LAMP) geliştirilmesi.ELISA yöntemiyle tropikal theileriosisin serolojik teşhisinde kullanılmak üzere rekombinant proteinlerin belirlenmesi amacıyla öncelikle olarak biyoinformatik yöntemler kullanılarak T. annulata'nın makroşizont dönemine özgü proteinler saptanmıştır. Elde edilen proteinlere karşı deneysel enfekte hayvanlarda gelişen immun yanıt Western blot metodu kullanılarak incelenmiştir. İzleyen çalışmalarda, Theileria annulata yüzey antijeni olan TaSP'ın immunodominat bir makroşizont antijeni olup olmadığı incelenmiştir. Daha sonra, TaSP, immunopresipitasyon ile elde edilen Ta9 ve biyoinformatik yöntemler ile elde edilen TA06510 ve Ta9.4 rekombinant antijenler kullanılarak indirekt ELISA testlerinin geliştirilmesine çalışılmıştır.Serolojik çalışmaların başında, Western blotlarda gözlenen immunodominat bandlarda polimorfism olup olmadığı test edilmiştir. Bu amaçla, T. annulata'nın 16 farklı izolatı, T. parva Muguga ve T. lestoquardi Lahr'a ait makroşizont hücre kültürleri ve enfekte olmayan sığır lenfosarkoma (BL20) hücreleri parazit materyali ve protein ekstraktları olarak kullanılmıştır. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, 40-42 kDa arasindaki bandlarda polimorfizm olduğunu göstermiştir.Theileria annulata'nın makroşizont dönemine özgü proteinlerin biyoinformatik yöntemler kullanılarak belirlenmesinde T. annulata genomuna ait proteinlerin tamamı Signal P, GPI anchor, TMD ve PEST benzeri protein motiflerini içerip içermedikleri, EST verileri ve dN/dS oranları da dikkate alınarak incelenmiştir. Bu özelliklerine göre seçilen proteinleri kodlayan genler, klonlanarak rekombinant olarak üretilip Western blot ile değerlendirilmiştir. Bu yöntemle elde edilen TA06510 rekombinant proteinine karşı deneysel enfekte hayvanlarda antikor yanıt geliştiği tespit edilmiştir. Ancak bu proteine karşı elde edilen antikor yanıtının, daha önceki çalışmalarda immunojenik olduğu belirlenmiş Tams-1/2, TaSP gibi antijenlere karşı gelişen yanıta göre daha zayıf olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, biyoinformatik yöntemlerin T. annulata genomunca kodlanan ve immunojenik özelliğe sahip olan proteinlerin saptanmasında kullanılabileceğini göstermektedir. Ancak, biyoinformatik yöntemlerle belirlenen proteinlerin immunojenik olup olmadıkları fonksiyonel analizlerle doğrulanmalıdır.İmmun serumun TaSP rekombinant proteini ile bloklanması sonrasında yapılan Western blot analizleri sonucunda, daha önceki çalışmalarda immonodominant makroşizont antijeni olduğu öne sürülen TaSP molekülünün D7 protein ekstraktlarında görülen 42 kDa ağırlığa sahip immunodominant bant olmadığı tespit edilmiştir. Western Blot analizlerinde saptanan immunodominant bantların tanımlanabilmesi amacıyla immunopresipitasyon deneyleri ve proteomiks analizleri yapılmıştır. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, D7 protein ekstraktlarında saptanan immunodominat bantlardan birisinin Ta9 proteini olduğunu göstermiştir. İzleyen çalışmalarda, D7 protein ekstraktlarında saptanan ikinci immunodominant bantın ise, Ta9 proteini ile aynı paralog ailede yer alan Ta9.4 proteini olduğu belirlenmiştir.TaSP, Ta9, Ta9.4 ve TA06510 rekombinant antijenleri indirek ELISA testlerinin geliştirilmesinde kullanılmıştır. Bilinen pozitif ve bilinen negatif serum örnekleri kullanılarak yapılan testlerde en iyi sensitivite (%89.5) ve spesifite (%98.3) TaSP rekombinant proteini ile elde edilmiştir. Sahadan toplanan serum örnekleri ile yapılan testler IFA testi ile, TaSP, Ta9 ve Ta9.4 rekombinant antijenleri kullanılarak yapılan ELISA testlerine göre daha fazla sayıda pozitiflik belirlenmiştir (p<.05). Ancak, bu çalışmada geliştirilen indirek ELISA testlerinin sahada rutin olarak kullanılabilmesi için daha fazla sayıda bilinen pozitif ve negatif serum örnekleri kullanılarak yeniden standardize edilmesinde fayda görülmektedir.Bu çalışmada tropikal theileriosis'in moleküler tanısında kullanılmak üzere PZR, multipleks PZR ve LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) yöntemleri geliştirilmiştir. Bu amaçla yapılan moleküler analizlerde, T. annulata'nın 12 farklı izolatı, T. parva Kenya, T. sergenti, T. lestoquardi, B. bovis, B. bigemina ve T. equi'den elde edilen toplam 18 DNA örneği kullanılmıştır. PZR, multipleks PZR ve LAMP yöntemlerinde kullanılan primer çiftleri ilgili gen bölgelerine ait sekans bilgisine gore clustal X programı kullanılarak tasarlanmıştır. Moleküler testlerin duyarlılığının belirlenmesi amacıyla deneysel enfeksiyon oluşturulmuştur.Theileria annulata'nın mitokondriyal sitokrom b genini çoğaltan cyto b1 primer çifleri kullanılarak yapılan PZR ile düşük seviyede parazitemiye sahip hayvanların duyarlı (bir ?l kanda 0.1 piroplasm) ve özgün olarak tespiti yapılabilmiştir.Bu çalışmada geliştirilen multipleks PZR yönteminin, sığırlarda önemli hastalık tablosu oluşturan T. annulata, B. bovis ve A. marginale türlerinin eş zamanlı ve özgün olarak saptanmasında kullanılabilecek basit ve etkili bir yöntem olduğu gösterilmiştir.Bu çalışmada Theileria annulata'nın hasta ve/veya taşıyıcı hayvanlarda saptanması amacıyla, PZR ve multipleks PZR yöntemlerine ek olarak LAMP yöntemi de kullanılmıştır. LAMP yöntemi, termal siklusa ihtiyaç duymadan izotermal koşullar altında, kısa zamanda çok sayıda DNA'yı çoğaltılabilen, yüksek özgünlükte ve elde edilen ürünün kolay ve hızlı tespitine olanak veren bir yöntemtir. Ancak CYTOB1 primerleri kullanılarak sahadan toplanan örnekler üzerinde yapılan LAMP çalışmalardan elde edilen sonuçlar T. annulata'nın hasta ve/veya taşıyıcı hayvanlarda saptanmasında bu testin PZR yöntemine göre daha az efektif olduğunu göstermektedir.