549
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Türkiye endemiği Thermopsis turcica'da farklı gelişim evrelerindeki çiçeklerin karşılaştırmalı proteomik analizleri
Çiçek gelişimi birçok çevresel uyarıcı ve içsel sinyal tarafından kontrol edilen karmaşık bir fizyolojik olaydır. Şimdiye kadar birkaç moleküler çalışma çiçek gelişimi ile ilgili fizyolojik süreçler hakkında önemli bilgiler sağlamış olmasına karşın çiçek gelişimi sırasında meydana gelen proteom değişimleri hakkında çok az bilgi bulunmaktadır. Bu nedenle, bu çalışmada tek bir çiçekte 3-4 serbest karpele sahip sıra dışı legüm türü ve Türkiye endemiği Thermopsis turcica Kit Tan, Vural & Küçüködük bitkilerinde çiçek gelişimi sırasında gerçekleşen proteom değişimleri araştırılmıştır. Çiçek tomurcukları ve tamamen açmış çiçeklerinden protein ekstraksiyonu yapılmış ve iki-yönlü jel elektroforezi (2-DE) ile bu proteinler ayrıştırılmıştır. Görüntü analizleri çiçek gelişimi sırasında 66 protein beneğinin farklı şekilde ifade olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu proteinlerden 32'si MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser-desorption ionization-time of flight/time of flight) kütle spektrometrisi (MS) ve veri tabanı taraması ile başarılı bir şekilde tanımlanmıştır. Çiçek gelişimi sırasında farklı şekilde ifade olan bu proteinlerin transkripsiyon ve protein metabolizması, enerji ve karbonhidrat metabolizması, bitki savunma sistemi, fotosentez, hücre çeperi, sekonder metabolizma ve amino asit metabolizmasında fonksiyon gördüğü belirlenmiştir. Bununla birlikte, tanımlanan birçok proteinin ifade seviyesinin tamamen açmış çiçeklerde azalan yönde düzenlendiği bulunmuştur. Protein metabolizması, şeker metabolizması ve stres savunması ile ilişkili birçok proteinin çiçek gelişimi sırasında düzenlenmesi bu proteinlerin gelişimsel regülasyondaki muhtemel rollerini göstermektedir. Bu sonuçlar, çiçek gelişimi sırasında meydana gelen proteom değişimleri hakkında yeni bilgiler sağlamıştır.
Oxadiazon ve pendimethalin herbisitlerinin muhtemel genotoksik etkileririnin komet ve mikronükleus test sistemleriyle araştırılması
Bu çalışmada, tarım alanlarında yüksek verim elde etmek, kaliteyi arttırmak, istenmeyen organizmaları yok etmekte kullanılan ve hedef dışı organizmaları da etkileyebilen herbisitlerden Oxadiazon (OD) ve Pendimethalin (PM) herbisitlerinin Eisenia hortensis (E. hortensis) türü üzerine muhtemel genotoksik etkileri Komet ve Mikronükleus (MN) test yöntemleri kullanılarak belirlendi. E. hortensis sölomasitleriyle yapılan çalışmada Probit analiz yöntemi ile OD herbisitinin LD₅₀ dozu 0, 255 ppm ve PM herbisitinin LD₅₀ dozu 0, 243 ppm olarak bulundu. Araştırmada, OD ve PM herbisitlerinin 0,5xLD₅₀, LD₅₀ ve 2xLD₅₀ konsantrasyonları, 48 saat süreyle E. hortensis'lere uygulandı. Negatif kontrol grubu olarak distile su (dH₂O) kullanıldı. Komet testi sonucunda kontrol grubu ile karşılaştırılan OD ve PM herbisitlerinin LD₅₀ ve 2xLD₅₀ dozlarında, DNA hasar derecesindeki artış anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Aynı zamanda MN oluşumunun da konsantrasyon artışına bağlı olarak arttığı görülmüştür. Bununla birlikte OD herbisiti kontrol grubuna göre 0,5xLD₅₀, LD₅₀ dozlarında binüklear hücre oluşumunu anlamlı bir şekilde arttırmıştır. PM herbisitinde binüklear hücre oluşumu konsantrasyon artşına bağlı olarak anlamlı derecede artmıştır. OD ve PM herbisitlerinin Komet ve MN Test yöntemiyle E. hortensis sölomasitlerinde, DNA hasarındaki artış istatistiksel açıdan önemli bulunmuştur (p<0,05). Tarım alanlarında, solucanlar toprak kalitesinin belirlenmesinde ve ekolojik denge açısından çok önemli organizmalardır. Bu nedenle solucanların, toprağa bilinçsizce uygulanan kimyasallardan olumsuz etkilenecekleri göz önünde bulundurularak kimyasal kullanımına ve uygulanacak doz miktarına dikkat edilmesi gerekmektedir.
Deresinek (Afyonkarahisar) havzası florası
Bu araştırmada, Sultandağlarının Kuzey yamacında bulunan Deresinek vadisi ve çevresinin florası araştırılmıştır. Araştırma sonucu 78 familya ve 270 cinse ait 455 damarlı bitki taksonu tespit edilmiştir. Taksonların 9' u (Alyssum lepidotum Boiss., Aster alpinus L., Digitalis lamarckii Ivanina, Hypericum montbretii Spach, Muscari discolor Boiss. & Hausskn. ex Boiss., Oenothera biennis L., Polygonum alpinum All., Sideritis phrygia Bornm., Symphytum orientale L.) Afyonkarahisar florası için yenidir.55 adet takson endemiktir. Endemizm oranı % 12.08' dir. Araştırma alanındaki türlerin bitki coğrafyasına göre dağılımı; Akdeniz (66), Avrupa-Sibirya (50), İran-Turan (47) ve bilinmeyen (292).
Hydrachna globosa, Hydryphantes dispar ve Limnesia fulgida (Acari, Hydrachnidia) türlerinde spektrofotometrik analizler
Bu çalışmada, Karamık Gölü'nden toplanan farklı su kenesi türlerinde (Hydrachna globosa, Hydryphantes dispar ve Limnesia fulgida) UV ve FT-IR teknikleri ile spektrofotometrik analizleri ilk kez uygulandı. İncelenen üç türün titreşim frekansları okundu ve fonksiyonel gruplar (OH, C-H, C=O, C-O, C-N) tanımlanarak çalışılan örneklere ait UV ve FT-IR spektrum frekans aralıkları belirlendi. Elde edilen sonuçlar tür düzeyinde değerlendirildi. Tür düzeyindeki farklılıklar ele alındığında Hydryphantes dispar ve Limnesia fulgida türleri arasındaki fonksiyonel grupların daha yakın olduğu görüldü. Tüm türler için elde edilen veriler grafiksel olarak incelendi ve dört farklı spektrum bölgesi tanımlandı. Sonuç olarak bu türlere ait spektroskopik analiz grafikleri karşılaştırıldı. Buna göre; çalışılan türlerin spektrum grafik aralıklarının üç türde de oldukça yakın olduğu görüldü. Fakat her bir türün pik aralıklarında kendine özgü değerlere sahip olduğu gözlendi.
HepG2 hücrelerinde rosmarinik asidin cisplatin toksikasyonuna etkileri
Tıbbi bitkiler yalnızca terapötik ajan olarak değil, farmakolojik araştırmalar ve ilaç geliştirme için önemlidir. Günümüzde fitoterapiye (phytos: bitki, therapy: tedavi) ilgi artmıştır. Özellikle dermatolojik hastalıklar, enfeksiyonlar ve çeşitli kanser hastalıklarının tedavisinde fitoterapi kullanılmaktadır. Biberiye, kekik gibi bitkilerde bulunan, doğal antioksidan olan rosmarinik asit (RA), antimikrobiyal etkiye de sahiptir. Kemoterapik ajan olan sisplatin (CisP), kanser hücrelerinde gelişimi ilerlemeyi durdurucu etki gösterirken bununla birlikte sağlıklı hücreleri de yok etmektedir. Kemoterapik ilaçlarla birlikte fitoterapik bileşikler kullanılarak antikanser etkinin arttırılması ve yan etkilerin ise azaltılması amaçlı çalışmalar yapılmaktadır. Sunulan çalışmada karaciğer karsinom hücrelerini (HepG2) kullanarak, rosmarinik asitin sisplatin toksikasyonuna etkilerini; MTT yöntemi (3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid), mikronükleus testi ve komet yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Bu amaçla RA ve CisP'nin HepG2 hücrelerinde MTT yöntemi ile sitotoksisitesi belirlendi ve farklı konsantrasyonlarda hücre canlılığı etkisine bakıldı. Sonrasında RA'in CisP ile kombinasyonunda mikronükleus testi ve komet yöntemi ile DNA hasar tespiti ile antikanser etkilerine açıklık getirilmesi incelenmiştir. RA'in HepG2 hücrelerinde sitotoksisitesi belirlenirken kontrol grubu, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1,25 mM, 2,5 mM, 6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM, 50 mM dozları kullanıldı. RA'in LD50 değeri 13,8 mM ve LD0 değeri ise 0,01 mM bulundu. Sitotoksisite analizi sonuçlarına göre RA konsantrasyonu arttıkça hücre canlılığı azalmıştır. CisP dozları ise 10 µg/mL, 20 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, 400 µg/mL, 600 µg/mL, 800 µg/mL, 1000 µg/mL kullanıldı. Sisplatinin HepG2 hücrelerinde LD50 değeri 11,06 µg/ml olarak bulundu. RA ve CisP'e ait LD50 dozları belirlendikten sonra, HepG2 hücreleri yeterince çoğaltılarak hücrelerden 4 grup oluşturuldu. Her grupta n sayısı en az 3 olacak şekilde çalışıldı. Gruplar; kontrol grubu, RA grubu, CisP grubu ve RA+CisP grubu şeklinde planlandı. RA'in CisP toksikasyonuna etkisi belirlenirken LD0 dozu kullanıldı. CisP 'in ise LD50 dozu kulanıldı. Deney gruplarına uygulamalar yapıldıktan 24 saat sonra elde edilen hücreler komet ve mikronükleus testlerinde kullanıldı. Elde edilen sonuçlar CisP'nin HepG2 hücrelerinde genotoksisiteyi artırdığını, LD0 dozunda RA'in ise CisP toksikasyonu sonucu oluşan genotoksisiteyi azaltabileceğini akla getirmektedir. Fakat bunun daha net ortaya konabilmesi için, bu tez çalışmasında yapılan uygulamaların, sağlıklı hücrelerle eş zamanlı bir şekilde tekrarlanmasının yararlı olabileceği düşünülmektedir.
Kuraklık stresi altındaki Cleome spinosa (C3) ve Cleome gynandra (C4) bitkilerinin karşılaştırmalı proteomik analizleri
Toprak ve atmosferik su eksikliğinden kaynaklanan kuraklık stresi dünyadaki bitki büyümesini ve verimliliğini etkileyen en önemli çevresel faktörlerden biridir. Karboksilasyon yoluna bağlı olarak bitkilerin kuraklık stresine toleranslarında önemli farklılıklar vardır. C4 bitkilerinin, C3 bitkilerinin aksine, su stresine daha iyi adapte olduğu bildirilmektedir. Bitkilerin kuraklık stresine adaptasyon mekanizmaları proteom düzeyinde yoğun bir şekilde çalışılmış olmasına rağmen, kuraklık stresi altında büyüyen C3 ve C4 bitkilerinin adaptasyon stratejileri tanımlanmamıştır. Kuraklık stresinin proteom değişiklikleri üzerindeki etkilerini belirlemek için iki boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi (2-DE) ve MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight) kütle spektrometresi Cleome spinosa (C3) ve C. gynandra (C4) bitkilerinin yapraklarında kullanılmıştır. 2-DE jellerinde toplam 96 farklı şekilde ifade olan protein beneği tespit edilmiş ve bunlardan 65'i MALDI-TOF/TOF kütle spektrometrisi ile tanımlanmıştır. Her iki türde de fotosentez ve enerji metabolizması ile ilgili proteinler, kuraklık stresi altında büyük ölçüde etkilenmiştir. RuBisCO küçük alt birimlerinin bolluğu C. spinosa'da artmış olmasına rağmen, RuBisCO aktivaz proteinlerinin bolluğu azalmıştır. Ayrıca, OEE ve FNR proteinleri gibi fotosentezin ışık reaksiyonları ile ilgili proteinlerin bolluğu C. spinosa'da azalmıştır. Kuraklık stresi altında, triosfosfat izomeraz ve fruktoz-bifosfat aldolaz gibi glikoliz ile ilişkili proteinlerin bolluğu C. spinosa'da azalmıştır; ancak, enolaz proteini C. gynandra'da artmıştır. Kuraklık stresi altında kloroplastik ATP sentaz enziminin ifade seviyesi her iki türde de azalan yönde düzenlenirken, mitokondriyal ATP sentaz artan yönde düzenlenmiştir. Annexin ve 14-3-3 proteinleri gibi sinyal iletimi ile ilgili proteinlerin bolluğu C. spinosa'da artmıştır. Reaktif oksijen türlerinin detoksifikasyonu ile ilişkili proteinlerin bolluğu genellikle her iki türde artmıştır. Bu bulgular, karboksilasyon yolunda farklılık gösteren türlerin kuraklık stresi altındaki proteomik cevaplarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
DNA dizisi tabanlı olarak Raphidascaris acus'un moleküler tanımlaması
Bu araştırmada, müze materyali olarak etil alkol ortamında korunan Raphidascaris acus türünün (Nematoda, Ascarididae) 5.8S gen dizisi üzerinden moleküler tanımlaması yapılmıştır. 5.8S rRNA gen bölgesi dizi verileri, anatomik ve morfolojik yapılarına göre tanımlaması yapılan R. acus türünün taksonomik konumunu doğrulamıştır. Bu süreçte, özel olarak tasarlanan AcusF ve AcusR primerleri kullanılmıştır. gDNA (5.8S rRNA) geninin 750 bp kısmi belirgin nükleotidleri, her numuneden doğrudan dizilenmiştir. Araştırmada incelenen 12 R.acus örneğine ait 5.8S gen dizilerinde hiçbir nükleotid varyasyonu tespit edilmedi. 5.8S hizalı nükleotid dizileri bakımından, bu araştırmanın Raphidascaris acus izolatları (MK271779-MK271790) ile iki R.acus izolatı (KT633862, KM047505) arasında minimum varyasyon görülmüştür. Buna karşın, AY603537 R.acus izolatı ile %4.11 farklılık bulunmuştur. R.acus izolatlarımız, dört Raphidascaris türü ile (JN102362.1 Raphidascaris longispicula, FJ009682.1 Raphidascaris trichiuri, JF809816.1 Raphidascaris lophii, KR232377.1 Raphidascaris macrouri) %13.03-14.97, GQ215514.1 Eustrongylides sp. dış grubu ile %26 farklılık göstermiştir. Ayrıca bu çalışma sonuçları ile etanolde fikse edilen ve uzun süre etanolde korunan R.acus gDNA'larının hasar görmediğini ve rutin olarak çoğaltılabildiği gösterilmiştir.
DNA dizisi tabanlı olarak Ligula intestinalis L.'in moleküler tanımlaması
Bu çalışmada, müze meteryali olarak etil alkol ortamında korunan Ligula intestinalis (Pseudophyllidea, Cestoda) türünün, COI gen dizisi üzerinden moleküler tanımlaması yapılmıştır. Elde edilen genetik veriler, anatomik ve morfolojik özelliklerine göre teşhisi yapılan Ligula intestinalis türünün taksonomik konumunu doğrulamıştır. Bu süreçte COIA2 ve COIB2 primerleri kullanılmıştır. COI geninin 480 bp kısmi belirgin nükleotidleri, her örnekten doğrudan dizilenmiştir. Bir örnekteki bir C nükleotidi hariç, COI gen dizilerinde hiçbir nükleotid varyasyonu tespit edilmemiştir. COI geni hizalı nükleotid dizileri bakımından, bu araştırmanın L.intestinalis izolatları (MK286929-MK286934) ile bir AF153910.1 L.intestinalis izolatı arasında %7 farklılık bulunmuştur. Bu çalışma sonuçları ile etanolde fikse edilen ve uzun süre etanolde korunan L.intestinalis gDNA'larının hasar görmediği ve rutin olarak çoğaltılabildiği gösterilmiştir.
Doğu Karadeniz'de bazı amfibi türlerinde fungal patojeninin (Batrachochytrium dendrobatidis) real-time PCR tekniği ile araştırılması
Bu araştırmada, Türkiye'nin Doğu Karadeniz Bölgesinde dünya çapında amfibi ölümlerine yol açan Chytridiomycosis hastalığına sebep olan Batrachochytrium dendrobatidis'in Real-time PCR tekniği ile ilk kez çalışılmıştır. Ülkemizin en önemli ormanlık ve doğal sulak alanlarının bulunuşu ve türlere ait birey sayısı açısından zengin olan bölgemizde, dünyanın birçok bölgesinde toplu amfibi ölümlerine neden olan Batrachochytrium dendrobatidis yapılan bu çalışma sayesinde bölgemizdeki varlığı tespit edilmiş olacaktır. Yapılan bu çalışma, 2015 yılında (Haziran –Ağustos ayları boyunca), ülkemizin Doğu Karadeniz Bölgesinde (Trabzon, Rize, Artvin) 4 farklı lokaliteden (Uzungöl/Çaykara, Karagöl/Yusufeli, Sahra Milli Parkı/Artvin, Şavşat Gölü/Artvin) arazi çalışmaları yapılmıştır. Bu arazi çalışmaları sonucunda toplanan 47 örnekten 6 tanesinde pozitif sonuç alınmıştır. Ülkemizde sadece Doğu Karadeniz Bölgesinde bulunan, IUCN kriterlerine göre "Nesli tehlike altında bulunan hayvanlar (Near Threatened, NT)" kategorisinde yer alan ve azalmakta olan Pelodytes caucasicus türü bu fungal patojenin tehdidi altında olduğu görülmüştür. Pozitif sonuç alınan ve ülkemizde Doğu Karadeniz'de bulunan nesli tehlike altında olan Ommatotriton ophryticus örneklerinde de Bd pozitif sonuca rastlanmıştır. Bu araştırmada, ülkemizde Doğu Karadeniz Bölgesinin ekolojik zenginliğinin, amfibi türlerinin yok olmasından sorumlu tutulan Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) fungusu tarafından tehdit edildiği görülmüştür. Yapılmış olan bu tez çalışması sonucunda bölgemizdeki amfibi türlerinin korunması için yasal düzenlemeler yapılabilir ve bu patojenin hangi yollar ile bölgemize geçtiği daha sonraki çalışmalar ile araştırabilir.
Bolvadin, Çay ve Sultandağı'nda (Afyonkarahisar)yetişen doğal bitkilerin halk tarafındangeleneksel kullanımı
Bu araştırma, Türkiye'nin İç Batı Ege Bölgesi'nde bulunan Afyonkarahisar iline bağlı Bolvadin, Çay ve Sultandağı ilçelerindeki doğal olan bitkilerin yerel halk tarafından kullanımı üzerinedir. Çalışma için 15 köy, 5 belde ve 3 ilçe merkezinden 49 kişi ile görüşülmüştür. Araştırmamız sonucunda 41 familyaya ait 95 bitki türünün çeşitli kullanımları tespit edilmiştir. Bu tespit edilen bitkilerden 67'i insan sağlığı için, 48'i gıda olarak, 3'ü hayvan hastalıkları için 10'u hayvan yemi olarak, 6'sı baharat olarak ve 17 'si farklı maksatlar için kullanılmaktadır.
Eylais setosa (Acari, Hydrachnidia) türünde kurşun (Pb2+) uygulamaları ve enzim aktivitelerinin tespiti
Bu çalışmada, toksik bir ağır metal olan kurşunun (Pb2+), su kenesi türlerinden Eylais setosa (Acari, Hydrachnidia)'da antioksidan enzim aktivite düzeyleri farklı enzim kitleri ile (Süperoksit dismutaz, katalaz, glutatyon redüktaz, glutatyon peroksidaz ve glutatyon S-transferaz) belirlendi. Çalışmanın temel amacı, iç sularda ağır metal birikimlerine maruz kalan zooplanktonik organizmalardaki toksik etki düzeylerinin tespit edilmesidir. Bu amaçla, Nisan, Mayıs ve Haziran aylarında Işıklı Gölü'nden toplanan Eylais setosa örnekleri laboratuvar ortamında oluşturulan 4 farklı akvaryuma örnekler eşit miktarlarda olacak şekilde konuldu. Her bir akvaryuma farklı oranlarda Pb2+ (10-5 M, 10-4 M ve 10-3 M) yüklemesi yapıldı. Akvaryumlardaki canlı örnekler 7 gün boyunca gözlendi. Daha sonra her bir akvaryumdan hem su hem de canlı örnekler alınarak ICP-MS cihazı ile analizleri yapıldı. Bu analizler ile Eylais setosa örneklerinin absorpladığı kurşun miktarı ve örneklemelerin yapıldığı akvaryum sularındaki bu metalin miktarları ölçüldü. Buna göre, Eylais setosa'nın artan oranlarda kurşunu absorbe ettiği görüldü. Ayrıca, bu örnekler üzerinde antioksidan enzim aktiviteleri 5 farklı enzim belirleme kitleri kullanılarak gözlendi. Elde edilen bulgularda, Süperoksit Dismutaz (SOD), Glutatyon Redüktaz (GR) ve Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px)'ın arttığı (p<0.05), Glutatyon S-transferaz (GST) ve Katalaz (CAT) enzim aktivitelerinde azalmaların (p<0.05) olduğu saptandı. Analiz sonuçları değerlendirildiğinde, akvaryumlarda bulunan Eylais setosa örneklerinde ortama ilave edilen kurşun miktar oranlarına bağlı olarak enzim aktivitelerinin değişkenlik gösterdiği gözlenmiştir.
Sandıklı'da (Afyonkarahisar) yetişen doğal bitkilerin halk tarafından geleneksel kullanımı
Bu araştırmada, Afyonkarahisar İli Sandıklı İlçesinde yetişen doğal bitkilerin etnobotanik kullanımları incelenmiştir. 12 köy ve 3 ilçe merkezinde 49 kişi ile görüşüldü. 28 familyaya ait 71 bitkinin kullanım alanları tespit edildi. Bu bitkilerin fotoğrafları da çekildi. 71 bitki türü, (44) İnsan hastalıkları tedavisinde (99), Gıda (38), Çay (27), Baharat (6), Hayvan hastalıkları (2), Hayvan yemi (6), Ev- Eşyası (6), İlaç yapımında (2), Süs bitkisi (1), Boya (2) yapımında kullanılmıştır.
Arpa fidelerinde sodyum nitroprussid teşvikli NaCl toleransı üzerine proteomik analizler
Tarım topraklarının tuza maruz kalması dünya çapında ciddi bir sorun teşkil etmektedir. Bitkilerde tuz toleransını artırmak için farklı stratejiler geliştirilmiştir. Dışsal sodyum nitroprussid (SNP) uygulamasının tuzluluğun zararlı etkilerini hafifletebileceği ve bitkilerin tuz toleransını teşvik edebileceği gösterilmiş olmasına karşın, SNP'nin proteomik değişikliklerin düzenlenmesindeki rolleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu amaçla, arpa (Horedum vulgare L.) fidelerinin tuz stresine verdiği tepkileri daha iyi anlamak ve tuz kaynaklı hasarı hafifletmede dışsal SNP'nin koruyucu rollerini anlamak için NaCl ve/veya SNP uygulamalarına maruz bırakılan arpa fidelerinin yaprak dokularında karşılaştırmalı proteomik analizler yapılmıştır. Dışsal SNP uygulamasının NaCl stresi tarafından inhibe edilen fide büyümesini iyileştirdiği belirlenmiştir. Proteomik analizler, 24 proteinin SNP ve/veya NaCl stresi uygulamalarında farklı şekilde ifade olduğunu göstermiştir. Bu proteinlerden 15'i MALDI-TOF/TOF kütle spektrometrisi ile başarıyla tanımlanmıştır. Gen ontolojisi analizi; fotosentez, protein metabolizması, stres savunma ve enerji metabolizması gibi yolakların SNP ve/veya NaCl uygulamaları ile düzenlendiğini ortaya koymuştur. Dışsal SNP uygulaması, tuz stres altındaki arpa fidelerinin yapraklarında 20 kDa şaperonin, proteazom altbirim beta tip-2, 2-Cys peroksiredoksin BAS1, tiyazol biyosentetik enzim 1-1, ferredoksin-NADP redüktaz, S-adenozilmetiyonin sentetaz 3 ve uzama faktörü Tu proteinlerinin ekspresyon seviyelerini arttırmıştır. Mevcut sonuçlar, SNP'nin fotosentezin düzenlenmesi, yanlış katlanmış veya hasarlı proteinlerin parçalanması, stres savunmasının aktivasyonu ve poliaminler, prolin ve GABA sentezinin teşvik edilmesi yoluyla NaCl'nin neden olduğu büyüme inhibisyonunu hafifletebileceğini ileri sürmektedir. Bu çalışma, arpa fidelerinde tuz stresine yanıt olarak SNP'nin moleküler mekanizmasına proteomik düzeyde bilgi sağlayan ilk çalışmadır.
Afyonkarahisar'da farklı ağaç türleri üzerinde yetişen Viscum album L.'un biyolojik özelliklerinin belirlenmesi
Bu çalışmada, Afyonkarahisar ili sınırlarında çeşitli konakçıl bitkiler üzerinde yetişen Viscum album örneklerinin içerdikleri etken maddelerdeki farklılıklar karşılaştırılmıştır. Nitel analizler sonucu fenolik bileşikler, flavonoidler, kuercetin, rosmarinik asit, para-koumarik asit ve sinapink asit gibi madde gruplarının varlığı tespit edilmiştir. Çalışmamızda V. album'un toplam fenolik madde içerikleri incelendiğinde, karaçamdan alınan V. album örnekleri hariç diğer tüm konakçı bitkilerde yaşayan V. album örneklerinde en yüksek fenolik ve flavonoid bileşen değerleri V. album meyve örneklerinde tespit edilirken en düşük değerlerin ise V. album dal örneklerinde belirlenmiştir. Bu çalışmada gentisik asit, armut ağacında yaşayan V. album'un yaprakları ile karaçam, aksöğüt, kayısı ve dahum üzerinde yaşayanların ise meyvelerinde saptanmamıştır. Kuersetin, bütün örneklerde tespit edilmiştir. En yüksek kuersetin miktarı ise ahlat üzerinde yaşayan V. album yapraklarında belirlenmiştir. Rosmarinik asit, tüm örneklerde görülmüştür. En yüksek değer 486,06 ile Çöğür armudu üzerinde yaşayan yarı parazit V. album yapraklarında belirlenmiştir. Para-koumarik asit, en yüksek değer 268,53 ile aksöğüt üzerinde yaşayan V. album'un dallarında saptanmıştır. Sinaptik asit, alıç ve karadut ağaçları üzerinde yaşayan V. album meyvelerinde tespit edilirken; armut, Çöğür armudu, dahum, karaçam, Yalancı akasya, badem, aksöğüt, ahlat, muşmula ve kayısı ağaçları üzerinde yaşayan V. album meyvelerinde tespit edilememiştir. Öte yandan sinaptik asit, armut, Çöğür armudu, dahum, karaçam, Yalancı akasya, badem, aksöğüt, ahlat, muşmula, kayısı, alıç ve karadut ağaçları üzerinde yaşayan V. album dal ve yapraklarında tespit edilmiştir, en yüksek değer ise 146,64 ppm ile kayısı yapraklarında bulunmuştur. En yüksek % inhibisyon değerleri V. album dal örneklerinde saptanmış olup %inhibisyon değeri 91,74-84,68 değerleri arasında değişmektedir. Vanilik asit ve protokatekhuik asit ise hiçbir V. album örneğinde belirlenememiştir.
Maküler kornea distrofisinin mikroakışkan platform içerisinde in vitro hastalık modellenmesi
Cornea is an avascular structure that provides refraction, transparency, and protects the eye's anterior part. Collagen generates a unique tissue structure that promotes physical qualities and strengthens the rigidity of the outer eye. Corneal dystrophies are rare hereditary diseases that produce corneal defects. Macular corneal dystrophy (MCD) is an autosomal recessively inherited condition in which mutations in the CHST6 gene, which codes for the enzyme N-acetylglucosamine-6-sulfotransferase, induce aberrant proteoglycan production. Corneal opacity is caused by the accumulation of glycosaminoglycans among stroma keratocytes, resulting in visual impairment. MMP1 and MMP13 from the matrix metalloproteinase (MMP) family, which are involved in corneal remodeling, have been found to be reduced in the extracellular matrix in MCD disease. Current clinical methods are mostly focused on corneal transplants, which do not eliminate the risk of recurrence. Here, we create a dynamic microfluidic platform to test an alternate treatment technique that includes MMP enzyme therapy in an in vitro model of MCD. Primary human corneal cells were extracted and planted on a hydrogel made up of mainly collagen which mimicked the biochemical and mechanical properties of the cornea. The cells were cultivated in a microfluidic platform in continuous laminar flow under dynamic conditions. We demonstrate that imitating sulfation inhibition using sodium chlorate, a pharmacological inhibitor of 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate (PAPs), results in long-term cell survival and MCD (-) related molecular responses at the gene level. The bioengineered example disease model will be a good platform for learning more about MCD and creating new treatments in clinics. Key Words: Microfluidics, Disease Modelling, Rare Disease, Macular Corneal Dystrophy
Karaciğer kanserinin modellenmesinde indüklenebilir pluripotent kök hücre (IPSCs) kaynaklı hepatik organoidler
Liver cancer is a heterogeneous disease with very limited treatment options, which ranks 4th in the world in terms of death. Hepatocellular Carcinoma (HCC), the most common type, is cancer that usually develops on the basis of cirrhosis and is characterized by late diagnosis and drug resistance. The most important limitation in understanding the early molecular pathophysiological changes and identifying new treatment targets in HCC is lack of the in vitro and in vivo models mimicking human tumorigenesis. In this context, in this study, the interactions of the microenvironment with stemness and senescence morphology in hepatocytes produced from IPSCs were investigated (Karabicici, 2021) and it was aimed to develop a long-term and large-scale 3D cell culture model that models the formation and development of pre-malignant stages of liver cancer such as fibrosis and cirrhosis. Here we utilize CRISPR/Cas9 technology for targeted gene modification of three of the most commonly mutated liver cancer genes (p53, APC, and NF1) in Induced Pluripotent Stem Cell derived healthy organoids (eHEPO). Although the CRISPR/Cas9 strategy to make these driver genes knockout has been worked successfully in HEK293 cells, we only continued with p53 knockout on eHEPOs. For this, we firstly transfected px458 plasmids containing p53 specific gRNA to the eHEPOs via optimized Nucleofector conditions. After enrichment of the GFP+ cells by FACS, we manually selected p53 KO-eHEPO clones under Nutlin-3a treatment. To mimic pro-carcinogenic TME activated LX2 and M2 polarized cell secretoms were added to growing medium of p53 KO-eHEPOs as well as WT controls. P53-KO highly proliferative (Ki67) and all displayed features of pro-carcinogenic pathological marks of pre-malign stages including increased nuclear–cytoplasmic ratio, pleiomorphic and hyperchromatic nuclei, pseudo glandular and tubular rosettes and inflammatory-like cell morphology. In addition, mason trichome staining area and fibrotic gene expressions have been shown to increase significantly. As a result, it has been shown that a fibrotic organoid model can be created that will make significant contributions to the understanding of tumor formation mechanisms in a carcinogenic microenvironment by using p53 KO-eHEPOs, which is one of the driver genes at the onset of HCC.
Bağlanma afinite tahmin algoritmalarının spike: ACE2 derinmutagenez bağlanma verileri üzerinde değerlendirilmesi
COVID-19 is caused by the SARS-CoV-2 virus. The SARS-CoV-2 virus binds to the host receptor protein ACE2 via its spike protein to initiate viral entrance and viral infection. Because of their critical roles, these proteins have been widely investigated by experimental and computational approaches. Relatedly, ACE2 and spike variant binding rates were obtained by the deep mutational scanning experiments. The deep mutational scanning method provides a high throughput binding dataset and thereby facilitates benchmarking of computational tools. By taking advantage of the deep mutagenesis datasets of ACE2 and spike, we aimed to investigate the performances in predicting the impact of interfacial mutations of FoldX, EvoEF1, MutaBind2, and SSIPe as main predictors in addition to HADDOCK and UEP as naïve predictors. In addition to their overall performance analysis, we performed metric-based analysis using volume, hydrophobicity, flexibility changes upon mutations, and change of side chain properties of mutations. As a result, we found that FoldX has the highest performance with a 64% success rate. Additionally, we highlighted that none of the predictors performed well on the binding increasing mutations. As a result, we revealed that (i) the top-ranking predictor, FoldX, predicts most of the hydrophobicity increasing mutations as affinity depleting, (ii) HADDOCK tends to tag mutations with increasing volume as affinity enhancing, (iii) Conservation-based tools, MutaBind2 and SSIPe predict most of the mutations as affinity depleting. All in all, we concluded that classical binding affinity predictors are not yet sufficient to predict binding affinity changes across the interface of the host-pathogen protein system SARS-CoV-2 spike -ACE2.
Nörotrofin reseptörü ile ilişkili ölüm bölgesi proteininin WNT/ß- katenin sinyal iletiminin düzenlenmesindeki rolünün zebra balığı modelinde araştırılması
Wnt/β-catenin signalling pathway is crucial for developmental processes and tissue homeostasis. Abnormal regulation of this signalling transduction might lead to several disorders. Hence, the understanding mechanisms underlying Wnt-related diseases might provide benefits for novel therapeutic approaches. For this purpose, elucidation of the roles of the modulators in this pathway has a significant importance for discovering novel drug targets. In the context of this thesis, the role of the neurotrophin receptor associated death domain protein (Nradd), which is a homolog of p75 neurotrophin receptor (p75NTR), in regulation of Wnt/ß-catenin signaling was investigated using the zebrafish model. Since the Nradd is a transmembrane protein with an intracellular death domain, it is able to induce apoptosis in healthy and cancerous cells. Therefore, the relationship between regulatory role as part of the Wnt/ß-catenin signaling and induction of apoptosis in cell culture and zebrafish model has been aimed to be unravelled. As a result of this modulation mechanism, the interaction between Nradd and other Wnt components was determined as a indicator of the dual role of this novel death domain protein. Based on our biochemical and molecular biological results, Nradd was identified as a novel feedback regulator of the Wnt/β-catenin signalling pathway. Consequently, we propose that targeting Wnt signalling via modulation of Nradd in novel treatment strategies could be beneficial for eradicating neurological disorders.
TGF-b ve NF-kB sinyal yolaklarının çapraz konuşmasında Malt1 geninin rolü
Transforming growth factor-b (TGF-b) is a cytokine superfamily expressed in a variety of cell types. Through contextual regulation of a large number of genes, TGF-b ligands serve critical functions in key cellular and molecular mechanisms, including cancer cell survival and proliferation. Notably, canonical (Smad-dependent) and non-canonical (Smad-independent) signaling pathways are involved in its activity. Furthermore, TGF-b signaling is known to interact with other intracellular pathways, including MAPK, JNK, JAK/STAT and NF-kB. Importantly, the nuclear factor kappa-B (NF-kB) pathway constitutes a small family of transcription factors found in virtually every cell type and is involved in multiple aspects of biological functions relevant to physiological and pathophysiological processes. The activity of NF-kB pathway is also modulated by both canonical and non-canonical signals. Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1 (Malt1), a paracaspase first identified in a subset of MALT lymphoma, is a critical component of NF-kB pathway in several biological contexts. Yet, the role of Malt1 in TGF-b and NF-kB interaction is unknown. Here we report that Malt1 protein potentiates the crosstalk between TGF-b and NF-kB signaling pathways. Mechanistically, through extensive molecular studies in A549 and Huh7 cancer cell lines using RNAi and CRISPR/Cas9 perturbations, we find that Malt1 is a Smad3-dependent target gene of canonical TGF-b signaling. More significantly, TGF-b-mediated Malt1 induction facilitates NF-kB activation. Collectively, our pioneering work provides mechanistic insights into how TGF-b/Smad signaling regulates Malt1 expression and reveals a novel mode of crosstalk between TGF-b and NF-kB signaling pathways.
İlaç yanıtının tahmini için hasta kaynaklı tümör organoidleri
A key limitation in cancer treatment is the lack of valid predictive biomarkers, which reduces the efficacy of treatments. Personalized medicine strategies include protein-, RNA-based and genome based stratification, though in oncology, precision medicine has been largely based on genomic biomarkers. However, less than half of patients are eligible for genetically matched treatment and for the majority of anticancer agents no genetic markers are available. A promising predictive biomarker is individualized tumor response testing using patient-derived organoids (PDOs), in which anticancer agents are screened ex vivo on PDOs to predict clinical response. PDOs have been developed for a variety of tumors and are stem-cell derived, three-dimensional self- organizing structures comprised of epithelial cells, mimicking its corresponding tumor. This study aims to establish the organoids of colorectal cancer (CRC) patients by using in-house protocol and to predict drug response. The patient cohort of our study consists of CRC patients over the age of 18. Fresh surgical material taken from the patients reached our laboratory within 24 hours at +4oC. After dissociating the tumor tissue mechanically and chemically, cells were counted and embedded in matrigel. After 3-4 week culture, organoids were tyrpsinized into single cell and passaged into matrigel containing 96 well plate as 6000 cells/5ul dome. Whenever organoids reformed, drug (5-FU, FOLFOX, FOLFIRI, CAPOX,..) were added in different concentrations. After 7 day incubation, viability analyses were performed by CellTiter-Glo 3D Viability Assay kit. All experiments were replicated four times and statistical analyses were done by one-way ANOVA. Finally, IC50 of drugs were calculated by GraphPad Prism 8 program. We were able to establish organoids from tumor tissues with a success rate of 90%. By performing drug screening for various anticancer agents on these organoids, we determined that each patient's response to treatments is different. We have seen that targeted antibodies increase the efficacy of treatment in one patient. We have successfully predict drug responses for 5 patients as a proof of concept study.
İnsan indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı lakrimal bez organoidlerinin farklılaşma verimliliğinin arttırılması
The lacrimal gland (LG), also known as the tear gland, maintains homeostasis on the ocular surface by secreting electrolytes and proteins creating the aqueous layer of the tear film. As the main exocrine gland of the eye, it lubricates and protects the eye by the production of lacrimal fluid. Loss of function due to damage to the LG adversely affects eye health and vision quality. Although a large part of the human population is affected by eye diseases based on functional disorders in the LG such as dry eye disease, studies on human LG formation and development are limited. The LG is a structure that develops by branching, and it reaches its structural and functional maturity only when this process is completed, similar to salivary or mammary glands. In this study, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were differentiated into cells with characteristics of LG in vitro by recapitulating budding and branching morphogenesis. Branching was stimulated via exogenous FGF10 and BMP7 proteins aiming to increase the differentiation efficiency. As an additional approach, the LG models were developed under dynamic conditions using microfluidic platforms to better mimic the native environment and develop more realistic LG models. In this context, the effects of this stimulation were examined at the RNA and protein levels of gene expressions. The results suggest that budding and branching development could be induced in vitro using exogenous supportive proteins. Additionally, developed models could be improved using dynamic conditions and these platforms could be used as a potential platform for therapeutic approaches.
Sistem biyolojisi yaklaşımlarıyla kanserin tanısı, prognozu ve radyoterapiye yanıt için gen ekspresyon imzalarının tanımlanması
Cancer represents one of the leading causes of death worldwide. Despite the availability of anticancer therapeutic regimens, the incidence, prevalence, and mortality of cancer are increasing exponentially. The accurate diagnosis and prognosis of cancer, as well as assessment of patients' response to anticancer treatments, are of critical importance in clinical decision-making. Therefore, there is an emerging need for the identification of powerful molecular markers for the early detection and outcomes of cancer. Despite the exemplary efforts made to date, a comprehensive effort to determine potential diagnostic, prognostic, and radioresistance molecular signatures across human cancers is still lacking. The scope of our proposed studies was to identify diagnostic, prognostic, and radioresistance gene signatures for different types of human cancers, based on publicly available bibliographic and high-throughput data. To this end, systematic reviews and meta-analyses, gene expression profiling, and transcriptome-wide association analyses were performed in diverse cancers through integrative in silico approaches. The findings of those studies could be potentially taken into consideration in the clinical setting for the accurate and timely diagnosis of cancer, monitoring cancer patients, and the administration of appropriate antineoplastic therapy.
2-Hidroksiglutarat Onkometabolitinin Kolon Kanseri Metabolizması Üzerindeki Etkisinin CRISPR/Cas9-Tabanlı Gen Terapisi ile Oluşturulan Hücre Modelleri ve In Vivo Modeller Üzerinde İncelenmesi
The normal concentration of D-2-hydroxyglutarate (D-2HG) is quite low but it is generated at a high level and role in colorectal carcinogenesis. This oncometabolite is generated by various cell-type-specific enzymes in addition to wild-type or mutant isocitrate dehydrogenase (IDH). This thesis aims to examine the D-2HG generation pathways and the impact of this oncometabolite on colon cancer metabolism. Firstly, the level of some intermediates in the TCA and Cori cycles, glutaminolysis, and glycolysis were determined in cell lines and xenograft models. The D-2HG has significantly been generated in both colon adenocarcinoma cell lines (Caco-2 and SW620), but it could not be detected in the colon epithelial cells (CCD-18Co). The Sanger results showed that there was no mutation in the IDH1/2 gene in SW620. Then, D-2HG generation was almost 2.5-fold decreased in wild-type IDH1 knockout cells (IDH1 KO) compared to the control, but still it generated. The mRNA level of the malate dehydrogenase (MDH2) enzyme which role in the L/D-2HG generation was considerably increased in IDH1 KO. After treatment with MDH and lactate dehydrogenase (LDH) enzyme inhibitors, the D-2HG could not be detected. Similar findings were obtained in the patient-derived xenograft (PDX) models. Finally, the R132H mutation was generated using the CRISPR/Cas9 tool to examine the effect of mutant IDH1 enzyme on D-2HG generation, and it was revealed that the D-2HG level did not change. In conclusion, the D-2HG generation pathway has been determined and a new therapeutic approach to colon cancer by inhibiting this oncometabolite generation is provided.
Protein-protein arayüzlerini yeni yaklaşım PROT-ON algoritması ile yeniden tasarlanması
Many biological activities in the body are mediated through protein-protein interactions (PPI). Understanding the PPIs is crucial for developing vaccines and drugs. Therefore, it is of utmost importance to understand how interfacial mutations change the nature of protein-protein interactions. To understand this phenomenon, several computational approaches such as FoldX and EvoEF have been developed. These tools estimate the change in the interaction energy by using different mathematical algorithms. In this thesis, by making use of these programs, we developed PROT-ON, which can scan all the interfacial mutations to explore the mutational landscape of a protein-protein interface. PROT-ON then classifies the mutations as most depleting or enriching, based on several metrics. We tested PROT-ON on MDM2-p53 and AXL-GAS6 complexes. For these cases, our approach was able to predict mutations that are critical to the vitality of the complex. The standalone version of PROT-ON can be cloned for Linux and macOS systems from GitHub (https://github.com/CSB-KaracaLab/prot-on) or can be accessed through a user-friendly web server (http://proton.tools.ibg.edu.tr:8001).
M2 polarize mikroglia kökenli eksozomal miR-191-5p'nin oksidatif stres aracılı nöronal hasar üzerindeki nöroprotektif etkilerinin incelenmesi
Microglia, as resident cells of the brain, are involved in the maintenance of the neuronal environment by activating the response mechanism during brain damage. There are two types of microglial activation: "classically activated" M1 or "alternatively activated" M2 polarization. M2 polarization is described as the "curative" phenotype. M2 polarized microglial cells exert their neuroprotective roles by phagocytosis of neuron debris and secretion of trophic factors. However, the mechanism by which M2 microglia perform its neuroprotective function is largely unknown. Exosomes are extracellular vesicles that are released into the intercellular environment by different cell types and can cross the blood-brain barrier. Exosomes play a role in cell-cell communication and that exosome cargo can contain microRNAs (miRNAs), proteins, and mRNAs (messenger RNAs), which can be stably transferred to the recipient cell. It has been revealed that exosomal miRNA may have a neuroprotective role during injury. Hydrogen peroxide (H2O2) is encountered in the central nervous system as a reactive oxygen species (ROS). In case of excessive storage in the cell, it causes oxidative stress. Neuronal cells are prone to oxidative stress due to their high oxygen metabolism. Therefore, ROS-induced damage is encountered in the pathogenesis of many neurodegenerative diseases. The aim of this thesis study is to examine the neuroprotective effects of M2 microglia-derived exosomal miR-191-5p on the H2O2-induced neuron damage model in SH-SY5Y cells. As a result of the study, it was determined that the neuroprotective effects of M2 microglia-derived exosomes on neuronal cells under oxidative stress were mediated by miR-191-5p.
Ölüm reseptörü aktivasyonunun primer insan monositlerinin M1 makrofajlarına dönüşmesine etkisinin transkriptomik analizi
TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a member of the TNF family and induces either apoptosis or survival. Inducing apoptosis selectively in malignant cells without affecting normal cells makes TRAIL a promising agent for cancer therapy. Macrophages play key roles in both innate immune response and tissue homeostasis. Monocytes differentiate into unpolarized macrophages (M0) which are polarized into M1 (pro-inflammatory) or M2 (anti-inflammatory) macrophages depending on the stimuli. The effect of TRAIL on monocytes/macrophages is poorly understood. In this study, the transcriptional effect of TRAIL signaling on the differentiation of primary human monocytes to M0 and M1 macrophages is investigated. Primary human monocytes were either treated or untreated during differentiation into macrophages then the cells were either polarized to M1 macrophages or kept as unpolarized. To uncover the transcriptional differences in the TRAIL-treated macrophage group, RNA-sequencing was employed and differentially expressed genes were validated by qPCR. In addition, the level of CXCL11 and TNF in the cell supernatant was analyzed by ELISA. TRAIL stimulation during macrophage differentiation increased the expression of CXCL9 and TNF, whereas it decreased the expression of CXCL8 and CXCL5 in M0 macrophages. Moreover, the expression of HGF and PACERR was decreased in M1 macrophages, whilst both mRNA and protein levels of TNF and the protein level of CXCL11 were enhanced. In summary, our results show that TRAIL-DR4/5 signaling activation during macrophage differentiation drives monocytes to differentiate into M1-like macrophages. Our study sheds new light on mechanisms of monocyte-to-macrophage differentiation by defining TRAIL as a new modulator. Keywords: Monocytes, macrophages, TRAIL, death receptorsDR4/5
Nötrofilik (Th1-kaynaklı) astım endotipinde doğal öldürücü invariyant T (iNKT) hücrelerinin rolü
Asthma is a common chronic lung disease. It is categorized into two main endotypes called eosinophilic and neutrophilic asthma. The majority of asthma patients suffer from eosinophilic asthma and respond well to current treatments. However, 5-20% of patients with neutrophilic asthma respond poorly. Invariant Natural Killer T (iNKT) cells have been described to enhance airway inflammation in an eosinophilic animal model of asthma. However, their role in neutrophilic asthma has not been clarified so far. We established mouse models to compare neutrophilic and eosinophilic asthma side-by-side. Using 19 parameter-flow cytometry, we analyzed cell frequencies, transcription factor expressions, and cytokine secretions of cell populations recruited to the inflamed lung and its draining lymph nodes. We compared lung inflammation in wild-type and iNKT cell-deficient (Jα18-/-) mice and found that iNKT cells do not affect the disease severity of neutrophilic asthma. Furthermore, we discovered that the composition of macrophage and DC subsets in the airways allows the distinction of the two asthma endotypes. In particular, interstitial macrophages dominated the lungs of eosinophilic airway inflammation, whereas exudate macrophages and plasmacytoid DCs were more abundant in neutrophilic asthma. Moreover, the IL-10 secreting T cells, B cells, iNKT cells, and innate lymphoid cells (ILCs) populations were comparable between the two endotypes. However, we found a unique subpopulation of neutrophils that expresses high levels of MHC class II molecule and could produce IL-10. These neutrophils were abundant in the lung during neutrophilic airway inflammation.
Vagus sinirinin optik uyarımı
The Vagus nerve, the longest cranial nerve, innervates to the neck, abdomen, and colon. The vagus nerve is also a clinically significant nerve that controls parasympathetic actions in visceral organs like the heart, lungs. Moreover, electrical nerve stimulation of the vagus nerve is a treatment methodology for epilepsy. Optical nerve stimulation is an alternative technique that uses infrared light to stimulate nerve cells. The relatively new technique has three main advantages over conventional electrical nerve stimulation: (1) a non-contact method of nerve stimulation; (2) improved spatial selectivity; (3) elimination of stimulation artifacts. Sciatic nerve and cavernous nerve are some examples of optical nerve stimulation. Despite all of the neural targets, optical vagus nerve stimulation has not been investigated in a rat model. This thesis investigates the effect of optical vagus nerve stimulation in an in-vivo rat model. An infrared diode laser was used to stimulate the vagus nerve at a wavelength of 1505 nm in continuous-wave mode. Arterial pressure and electrocardiography signals were obtained to understand nerve stimulation's effectiveness using laser radiation on the vagus nerve. Successful optical nerve stimulation of the rat vagus nerve was observed in terms of arterial pressure. Arterial pressure was significantly decreased during optical vagus nerve stimulation after the nerve surface reached a temperature of ~42 °C. However, optical nerve stimulation had no side effects on electrocardiogram signals, despite electrical nerve stimulation having side effects on the heart like bradycardia and arrhythmia. Histological analysis also showed that optical nerve stimulation is safe until ~46 °C.
Fasl uyarımının primer insan makrofajlarının M1, M2A, ve M2C polarizasyonuna etkisi
Macrophages, the body's first line of defense, play a pivotal role in inflammation. With the plasticity ability, macrophages can be polarized into classically-activated (M1) or alternatively-activated (M2) phenotypes with appropriate signals. While M1 macrophages are responsible for generating a pro-inflammatory response against pathogens or tumors, M2 macrophages induce the anti-inflammatory response such as tissue regeneration and angiogenesis. Death receptor Fas is a member of the TNF receptor superfamily. Binding of Fas Ligand (FasL) to its receptor Fas can initiate apoptosis or non-apoptotic mechanisms. Previous studies have shown that Fas/FasL interaction enhances the expression of pro-inflammatory factors by inducing non-apoptotic mechanisms rather than causing cell death in macrophages. However, there is no comprehensive study in the literature investigating the effect of Fas activation on human primary macrophage polarization. To investigate this effect primary human macrophages were polarized into M1, M2a, and M2c phenotypes in the presence or absence of soluble FasL. The effect of FasL stimulation on macrophage phenotype was analyzed by qPCR and flow cytometry. In conclusion, our results demonstrated that FasL stimulation did not alter M0 macrophage response. In M1 macrophages, while FasL stimulation increased the expression of proinflammatory markers at mRNA level, but not at protein level. FasL stimulation significantly reduced the expression of the M2a surface marker CD206 at protein level in M2a polarized macrophages. Finally, M2c polarization was not affected by FasL stimulation. Our findings suggest that FasL, whose expression increases in inflammatory diseases such as cancer, has no functional effect on primary human macrophage polarization.
Matriks metalloproteinaz -1 ve -13'ün maküler kornea distrofisi tedavisi için rekombinant üretimi ve karakterizasyonu
Macular corneal dystrophy (MCD) is a rare hereditary disease characterized by the accumulation of insoluble aberrant substances in the corneal stroma. MCD may result in a decrease of visual acuity that can lead to blindness. There is still no cure for the disease, and corneal transplantation is possible but it can lead to likelihood of dystrophy recurrence and graft-related risks. Matrix metalloproteinases -1 and -13, which are necessary for corneal reshaping, have been reported to be decreased in MCD. The goal of this study is to provide a new treatment method for MCD by topical application of MMP-1 and MMP-13 to the cornea. MMP-1 and MMP-13 enzymes were being produced using recombinant DNA technology as a preliminary step in this research. Human MMP-1 and MMP-13 genes were cloned into pET-17b plasmid for E.coli expression. Auto-induction media wass used for bacterial expression (E. coli). Using a novel auto-induction methodology, our data indicated that active MMP-1 and MMP-13 enzymes may be generated in E. coli periplasm and released into production media. Promising protein yields were found, and production parameters were further optimized. Purified MMP-1 and MMP-13 enzymes were characterized by biophysical and biochemical tests. Protein thermal shift assay and enzyme kinetics assay were used to examine the profiles of recombinant enzymes. For MMP-1 and MMP-13 enzymes, this work presents a unique autoinduction recombinant production and characterization approach. These enzymes are expected to be used as a treatment method for MCD after completion of proof-of-concept studies.
Beyin rejenerasyonu ve glioma moleküler mekanizmalarının zebrabalığı modeli kullanılarak gliomalarda terapötik yaklaşımlar geliştirilmesi için karşılaştırmalı olarak analizi
Studies have shown that events such as proliferation, renewal of cells and differentiation are shared between cancer and regeneration. However, while these events are terminated properly in regeneration, they cannot be halted in cancer and the cells undergo proliferation consistently resulting with abnormal tissue integrity and abnormal tissue mass. Unlike mammals, zebrafish has the ability to regenerate many organs and tissues, including brain tissue. This feature has made zebrafish a suitable model organism for vertebral regeneration studies. This study aims to investigate the mechanisms involved in regeneration in early wound healing, early proliferation and differentiation stages in telencephalon tissue at the whole transcriptome level and to elucidate the relationship between cancer and regeneration in brain tissue by comparing these results with human brain cancers obtained from cancer databases. In this study, various molecular biology techniques such as micro-manipulation techniques, histological techniques, qPCR and RNA-sequencing were used. Bioinformatics analyses, including quality control, mapping to the reference genome, read counting, detection of differentially expressed genes, and comparison of results with cancer data from cancer databases were performed to analyse RNA-sequencing data. As a result, (i) the transcriptome of three phases of brain regeneration shows different characteristics; (ii) early wound healing stage is similar to the brain cancers in terms of protein translation, cell development, neurogenesis and synaptic signaling pathways; (iii) early cell proliferation stage and brain cancers are similar each other in terms of cell division and DNA replication; (iv) the differentiation stage and brain cancers resembles each other in terms of nervous system development, vascular development and organ morphogenesis. This study is a resource that investigates three different stages of brain regeneration and two different brain cancers at the whole transcriptome level for the first time. The results will be able to contribute to the literature on the development of new approaches in the treatment of brain cancers, neurodegenerative diseases and brain injury.
Mesane tümör oluşumunda görev alan moleküler mekanizmaların deneysel ve hesaplamalı yaklaşımlar ile anlaşılması
It is known that genes involved in chromatin regulation are highly mutated in bladder cancer. For this reason, it is very important to understand the molecular mechanisms that play a role in the epigenetic regulation of bladder cancer and that may cause tumor formation. The primary goal in this thesis is to decipher the epigenetic mechanisms deregulated in bladder cancer using both experimental and computational methods. For this aim, first regulatory landscapes of bladder cancer molecular subtypes have been investigated using published data which showed active chromatin regions in bladder cancer using ATAC-seq. Our results showed upregulation of ß-catenin targets regulated by neuronal regulatory elements in three different cohorts, implicating ß-catenin signature in neuronal bladder cancer. Further, integration with mutation data revealed significantly higher oncogenic exon 3 ß-catenin mutations in neuronal bladder cancer compared to non-neuronal. Secondly, we aimed to understand the epigenetic deregulation in bladder cancer via employing experimental techniques. For this purpose, we focused on KDM6A, which is among the top frequently mutated chromatin modifiers in bladder cancer. To investigate how KDM6A depletion affects phenotypic and epigenomic profile of bladder cancer, we knock-out KDM6A in a muscle invasive bladder cancer cell line, 5637. No significant viability changes between 5637 and KDM6A-null 5637 have been detected in long term growth of the cells. Genes marked with top H3K4me3 peaks were enriched for chromatin organization pathway, including the chromatin modifier, HDAC1. Our findings suggest that in the absence of KDM6A chromatin modifier, repressive chromatin states might be abundant, which will be further investigated in future.
Kasa invazif olan ve olmayan mesane kanserihücre hatlarını karakterize eden transkripsyonel regülasyon ağlarının belirlenmesi
Bladder cancer is divided into muscle invasive and non-muscle invasive bladder cancer (MIBC and NMIBC) histopathologically however their prognosis and treatment options are different. In this thesis, the transcriptional regulatory mechanisms characterizing MIBC and NMIBC are aimed to be identified. H3K27ac chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) was used to identify group specific enhancers specific to MIBC (5637, HT1376, J82, T24) and NMIBC (RT112, RT4) cell lines. Transcription factor motifs on differential active regulatory regions are identified and possible gene targets were found. Selective Isolation of Chromatin Associated Proteins (ChIP-SICAP) method was used to find co-partner proteins of the transcription factors. FLI1 and FRA1 ChIP-Seq experiments are also done and the target genes were filtered accordingly. Finally, knockdown of the transcription factors characterizing MIBC group was performed. FLI1 and FRA1 transcription factors are determined to be enriched at MIBC specific enhancers and GRHL2, Tp63 and PPARg transcription factors are found at NMIBC specific enhancers. Predicted target genes of MIBC group were mostly involved "epithelial cell migration" however NMIBC group's target genes are mainly consisting transcription factors. Integrative analysis of FLI1 and FRA1 ChIP-SICAP and ChIP-Seq and FLI1 and FRA1 knockdown experiments showed that MAP4K4 and FLOT1 genes are the two key target genes regulated by these transcription factors. Collectively our results uncovered the regulatory landscapes characterizing MIBC and NMIBC. FLI1 and FRA1 are determined as the two prominent transcription factors regulating the genes involved in gain of invasive characteristics. Key Words: Bladder cancer, epigenetics, gene regulation, invasion
Cerulenin uygulanmış U87 glioblastoma hücre hattında endoplazmik retikulum stresinin araştırılması
Glioblastoma, yüksek malignansi özelliği, tıbbi yöntemlerle saptanmasının zor ve tedavi başarısının düşük oranda olması nedeniyle en ölümcül kanser türlerinden biri olarak kabul edilmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, glioblastomadaki moleküllerin ve/veya hücresel yolakların karsinojenez sürecindeki değişimleri ve bunların anlatımlarındaki değişimler, glioblastomanın hem tanı hem tedavisi için çeşitli hedeflerin belirlenmesine olanak sağlayabilmektedir. Buna örnek olarak, kanser hücrelerinde yüksek oranda anlatımı yapılan yağ asit sentaz ve onun inhibitörü Cerulenin verilebilir. Cerulenin maddesi bir antifungal ajan olup lipit biyosentez yolağında yağ asit sentaz enzimini inhibe ederek malonil koenzim A'nın palmitik aside dolayısıyla yağ asitlerine dönüşümünü engeller. Yağ asitlerinin oluşamadığı bir hücrede stres durumu gelişir ve stresin önlememesi durumunda ölüm mekanizmaları aktifleşerek hücre ölebilir. Yapılan tez çalışmasında; Cerulenin'in U87MG hücre hattına çeşitli dozlarda uygulanmasıyla hücre canlılığındaki değişim, MTT testiyle belirlenip sonraki deneyler için iki doz grubu seçilmiştir. MTT testinden elde edilen verilerden sonucunda seçilen ilk grubun (IC20) konsantrasyonu 3.6 μg/mL; ikinci grubun (IC50) konsantrasyonu ise 5.55 μg/mL olarak belirlendi. Sitotoksik dozları belirlenmiş hücrelerde Cerulenin'in neden olabileceği stres koşulunda endoplazmik retikulumun (ER) ne düzeyde etkilendiği, ER'nin hücresel strese ve/veya ölüm mekanizmalarının işlemesinde nasıl katkı sağladığı ve Cerulenin'in veya ER stresinin gen düzeyindeki etkileri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve Western blot teknikleri ile incelenmiştir. RT-PCR sonucunda; TMED4 geninin anlatımı, madde uygulanmamş kontrol grubuna kıyasla IC20 ve IC50 grubunda sırasıyla 0.31 ve 0.48 kat azalmıştır. Protein ekspresyonunda ise TMED4 proteininde kontrole göre 1.26 ve 1.38 kat artış saptanmıştır. Endoplazmik retikulum proteinlerinde ise, ER şaperonu olarak bilinen Grp78 proteininde kontrole kıyasla IC20 grubunda 1.5 kat; IC50 grubunda ise 1.12 kat artış; IRE1α'nın IC20 ve IC50 gruplarında sırasıyla 1.04 ve 1.22 kat artış; ATF6'nın doz gruplarında sırasıyla 0.91 ve 0.84 kat azalış ve fosforile PERK proteininde ise kontrole oranla 1.32 ve 1.16 kat artış gözlenmiştir. ER proteinlerinin yanı sıra, hücre ölümünde görev alan proteinlerden biri olan Bax'ın ekspresyonu, kontrole göre sırasıyla 1.09 ve 1.35 kat artmıştır. ER stresini görüntülemek için Tiyoflavin T adlı floresan boya ile boyanan U87MG hücrelerinde, dozun öldürücülüğü ile floresan ışımanın pozitif korelasyon gösterdiği saptanmıştır. Çalışmadan elde edilen verilerin, glioblastoma ile ilgili tanı ve tedaviye yönelik strateji geliştirilmesinde veri bakımından katkı sağlaması hedeflenmektedir.
Madımak bitkisindeki fenolik asit ve flavonoidlerin HPLC-DAD yöntemiyle tayini, biyolojik aktivitelerinin belirlenmesi
Polygonaceae ailesine ait Madımak (Polygonum cognatum Meissn.) ülkemizde kendiliğinden yetişen çok yıllık bir bitkidir. Bu bitki fenolik içerik bakımından zengindir. Fenolik bileşikler, bitkilerin en önemli sekonder metabolit grubunu oluştururlar ve bu bileşiklerin antioksidan, antimikrobiyal ve antikanserojen aktivitelerinin olduğu bilinmektedir. Hassasiyeti, doğruluğu ve kısa analiz süresinden dolayı yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC), fenolik bileşiklerin kalitatif ve kantitatif tayininde kullanılan en popüler analitik yöntemlerdendir. Bu tez çalışmasında farklı zamanda ve farklı bölgelerden hasat edilen madımak bitkisinin antioksidan, antimikrobiyal ve sitotoksik aktiviteleri incelenmiştir. Bitkideki 10 fenolik bileşiğin (protokateşik asit, kateşin, gentisik asit, kafeik asit, p-kumarik asit, polidatin, kumarin, resveratrol, ellajik asit, kuersetin) eş zamanlı kalitatif ve kantitatif tayini için yeni bir HPLC-DAD yöntemi geliştirilmiş ve valide edilmiştir. Sivas (A bitkisi) ve Ordu (B bitkisi) illerinden toplanan ve soxhlet yöntemiyle ekstrakte edilen madımak bitkilerinin antioksidan aktivitesi DPPH yöntemiyle belirlenmiştir. Bitki ekstraktların IC50 değerleri A ve B bitkisi için sırasıyla, 0,781 mg/mL ve 0,657 mg/mL olarak saptanmıştır. Antimikrobiyal aktivite difüzyon ve dilüsyon yöntemiyle araştırılmıştır. Nokta-damlatma ekim yönteminde ham ekstrakt mikroorganizmalara karşı inhibisyon zonu oluşturmamıştır. Metanol ekstraktı en güçlü antibakteriyal aktiviteyi Gram negatif bakterilerden 23 mm inhibisyon zonu ile Escherichia coli bakterisine; 20 mm inhibisyon zonu ile Gram pozitif bakterilerden Vankomisin dirençli Enterococcus faecium (VRE) bakterisine; en güçlü antimikrobiyal aktiviteyi 25 mm inhibisyon zonu ile Candida albicans mantarına karşı göstermiştir. Ham ekstraktın tüm derişimlerinde üreme görülmüş, metanol ekstraktında MİK değerleri tüm mikroorganizmalar için 4,75 mg/mL olarak saptanmıştır. MBK değeri Vankomisin dirençli Enterococcus faecium (VRE) bakterisi için 5,00 mg/mL, diğer tüm mikroorganizmalar için için 4,75 mg/mL olarak belirlenmiştir. Sitotoksik aktivitenin tayinini L929 ve SAOS-2 hücre hatları üzerinde MTT yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. L929 hücre hattında A ve B bitkisinin % hücre canlılığı sırasıyla, %160,182-%121,992 ve %156,997-135,546 aralığında tespit edilmiştir. A ve B bitki ekstraktlarının negatif kontrole göre proliferatif etkisi gözlemlenmiştir. SAOS-2 hücre hattında A ve B bitkisinin % hücre canlılığı sırasıyla, %111,341-63,492 ve %137,141-%99,483 aralığında saptanmıştır. A bitki ekstraktının negatif kontrole göre antiproliferatif etkisi gözlemlenirken; B bitki ekstraktının ise sadece 10 mg/mL derişimde antiproliferatif etkisi gözlemlenmiştir. Fenolik bileşiklerin eş zamanlı tayini için yeni bir HPLC-DAD yöntemi geliştirilmiştir. Kromatografik tayinler SUPELCOSIL LC-18 (25cm x 4,6mm, 5µm) kolonunda gradient program ile gerçekleştirilmiştir. Mobil faz, akış hızı ve kolon sıcaklığı optimize edilmiştir. Geliştirilen yöntemin validasyonunda sistem uygunluğu araştırılmış ve geliştirilen yöntemin önerilen değerlere uygun olduğu saptanmıştır. LOD ve LOQ değerleri sırasıyla, 0,051- 0,188 µg/mL ve 0,169- 0,628 µg/mL aralığında hesaplanmıştır. Gün içi analizlerde % geri kazanım 99,273-101,032 ve %RSD 0,090-0,652; günler arası analizlerde % geri kazanım 99,017-101,983 ve %RSD 0,059-0,697 aralığında tespit edilmiştir. A ve B bitkilerinde en yüksek miktarda resveratrol; en düşük miktarda kafeik asit tayin edilmiştir. Her iki bitki ekstraktında gentisik asit bileşiğine rastlanmamıştır.
Ko-kültür sistemiyle antimikrobiyal peptid eldesi üzerine çalışmalar
Doğal ekosistem şaşırtıcı derecede çeşitliliğe sahip mikrobiyal türler barındırır. Mikroorganizma popülasyonları besinler ve çevredeki diğer kaynaklara ulaşma bakımından bir ortak yaşam alanı içerisinde bulunur. Mikroorganizmaların ideal laboratuvar koşullarında üretilmesi, onların doğal ekosistem şartlarından uzaklaştırır ve onları kendi mikrobiyal dünyalarından, özellikle de rakiplerinden izole eder. Laboratuvarlarda kullanılan geleneksel saf kültürleme teknikleriyle küçük moleküllerin aracılık ettiği etkileşimler hesaba katılmaz, bu da etkileşimlerin kesin yapısının büyük ölçüde bilinmemesine neden olmaktadır. Ko-kültür sistemleri iki ya da daha fazla sayıda farklı hücre popülasyonunun bir arada üretildiği sistemlerdir. Bu şekilde popülasyonlar arasındaki doğal etkileşimlere ilişkin çalışmalar yapılabilmekte ve doğada gözlenmeyen sentetik etkileşimler sağlanabilmektedir. Bu sistemlerle doğal ürün keşfi, mikrobiyal ekoloji, evrim ve patogenez çalışmaları yapılmaktadır. Ayrıca endüstriyel, çevresel ve tıbbi çalışmalarda ko-kültür sistemlerinin kullanımı karşımıza çıkmaktadır. Bu tez çalışmasında kendi laboratuvarlarımızda bulunan Schizosaccharomyces pombe'nin yabani ırkıyla Escherichia coli'nin DH5α ırkı kendilerine özgü besi yerlerinde çoğaltıldıktan sonra farklı hücre sayısı kombinasyonlarıyla %0,1 glikoz içeren besiyerlerine ekilerek 48 saat ve 72 saat boyunca kültürlenmiş ve hücrelerin besiyerine saldıkları proteinlerdeki farklılaşma SDS poliakrilamid jellerde gözlemlenmiştir. Ko-kültür koşullarında kontrol koşullarından farklı olarak ortaya çıkan yeni protein bantları saptanmış ve bu bantların iki tanesi kütle spektrometresi (MS) yöntemiyle analiz edilmiştir. MS sonucunda 110 tane protein elde edilmiştir. Bu proteinler; çeşitli karbonhidrat bağlayıcı proteinler, çeşitli sinyal moleküllerinin ve antibiyotiklerin tanımlanmasında görevli membran proteinleri ve çeşitli hücresel süreçlerde yer alan diğer proteinler olarak karşımıza çıkmıştır. Sonuç olarak elde edilen proteinlerin kalori kısıtlaması ve rakip popülasyonun varlığında artış gösterdiği görülmüştür.
Propolis yüklü polimerik nanopartiküllerin hazırlanması ve karakterizasyonu, immünomodülatör etkilerinin makrofaj hücrelerinde incelenmesi
Hücre kültürlerinde ve hayvan modellerinde yapılan çalışmalar, çeşitli arı ürünlerinin (bal, propolis, arı poleni vb.) ve içerdikleri bazı bileşiklerin önemli farmakolojik aktivitelere sahip olduklarını göstermiştir. Bu nedenle arı ürünleri, sağlıklı beslenme, apiterapi ve biyokozmetik üretimi gibi çeşitli alanlarda yoğun kullanım alanı bulmaktadır. Önemli bal arısı ürünlerinden biri olan ve 300'den fazla biyoaktif madde içeren propolis (arı tutkalı), içinde bulunduğumuz yüzyılda keşfedilen mükemmel doğal ilaç özellikleri ile daha da önem kazanmaktadır. Propolis, menşeine bağlı olarak şekerler, amino asitler, flavonoidler, fenolik asitler, yağ asitleri, alkoller, aldehitler ve steroidler gibi çeşitli bileşikler içerir. Propolisin biyolojik aktiviteleri genellikle zengin fenolik içeriğiyle ilişkilidir. Propolis ile içerdiği flavonoidlerden biri olan kuersetin, anti-alerjik, anti-mikrobiyal, anti-enflamatuvar, anti-kanser, anti-oksidan gibi çeşitli biyolojik özellikler taşır. Güçlü yapışkan davranışı, keskin tadı ve suda az çözünmesi propolisin sağlığı destekleyici ürün olarak kullanımını sınırlandırmaktadır. Bu dezavantajları ortadan kaldırmak ve biyoyararlanımı artırmak için, nanoteknolojik kapsülleme teknikleri kullanılabilir. Bu tezde, propolis etanolik ekstresi, ticari kuersetin ve bunların polikaprolakton (PCL) ile kapsüllenmiş formlarının, immün yanıtla ilişkili bazı sitokinler (IL-4, IFN-γ ve IL-1β) ve nitrik oksit (NO) düzeyleri üzerindeki etkileri J774 makrofaj hücre hattında incelendi. Öncelikle yerli propolisten etanolik bir ekstre hazırlandı ve deneylerde Propolis örneği olarak bu ekstre kullanıldı. Daha sonra, ikili emülsiyon çözücü buharlaştırma yöntemi kullanılarak propolis ekstresinin ve kuersetinin PCL ile enkapsüle edilmiş nanoformları (Propolis-PCL ve Kuersetin-PCL) üretildi. Nanopartiküllerin yapısı UV-VIS spektrofotometri, zeta potansiyeli ölçümü, FTIR, SEM ve XRD analizleri ile karakterize edildi. Çalışmanın sonraki aşamasında hazırlanan örneklerin (Propolis, Kuersetin, Propolis-PCL ve Kuersetin-PCL) J774 makrofaj hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri MTT yöntemi ile incelendi ve toksik olmayan konsantrasyonları belirlendi. J774 makrofaj hücrelerinde sitokinlerin anlatımı ve NO salınımı, Escherichia coli (serotype O111:B4) kaynaklı lipopolisakkaritin (LPS) toksik olmayan dozu uygulanarak indüklendi. Son olarak, Propolis, Kuersetin, Propolis-PCL ve Kuersetin-PCL uygulanmış ve uygulanmamış hücrelerde immün yanıtla ilişkili sitokinlerin (IL-4, IFN-γ ve IL-1β) sitokinlerin düzeyleri ELISA yöntemiyle saptandı. Ayrıca, immün yanıtın belirteçlerinden biri olan nitrik oksit (NO) salımı Griess reaksiyonu ile analiz edildi. Propolis-PCL ve Kuersetin-PCL nanoformülasyonları başarılı bir şekilde üretilerek karakterize edildi ve immünmodülatör etkileri Propolis ve Kuersetinin etkileriyle karşılaştırıldı. Test edilen konsantrasyonlarda (5, 25, 50 ve 100 µg/mL) tüm örneklerin LPS ile indüklenmiş J774 hücrelerinde NO salımını inhibe ettiği belirlendi. Tüm örneklerin 100 µg/mL konsantrasyonları IL-4 düzeyini artırırken nanoformların, en çok da Propolis-PCL'nin indüktif etkisi daha yüksekti. Propolis-PCL'nin sadece 50 µg/mL konsantrasyonu IFN-γ düzeyini artırdı. Ayrıca, IL-1β düzeyini düşüren tek örneğin 100 µg/mL Propolis olduğu belirlendi. Sonuç olarak, bu çalışmada propolis ve içeriğindeki bileşenlerden biri olan kuersetin ile bu maddelerle yüklü polimerik nanopartiküllerin immünomodülatör etkilerine ilişkin önemli verilere ulaşıldı. Bu veriler gelecekte, immün yanıtla ilişkili sitokinlerin anlatımını ve NO salımını hedef alan, biyoyararlanımı daha yüksek propolis nanoformülasyonlarının ve yeni arı ürünlerinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.
Farklı kaynaklardan elde edilen bakteri izolatlarının metagenomik analizi
Mikroorganizmalar, Dünya üzerinde en çok sayıda bulunan biyolojik varlıktır ve en büyük biyolojik ve genetik çeşitliliğini sağlar. Bu çok sayıda mikroorganizma, tüm yaşamı sürdüren enerji ve madde döngülerinde önemli rol oynarlar. Yakın geçmişe kadar bu geniş mikrobiyal dünya çoğunlukla klasik mikrobiyoloji ve kültüre bağlı yöntemlerle araştırılmıştır. Doğrudan çevreden izole edilen büyük rastgele nükleik asit dizileri örnekleri olan metagenomların üretilmesindeki son gelişmeler, mikrobiyal toplulukların bileşimi, yapısı ve işleyişinin kapsamlı portrelerini sunmaktadır. Metagenomik çalışmalar, bir organizmadaki toplam genetik materyalleri ve hücresel fonksiyonların korunmasında kilit rol oynayan deoksiribonükleik asit ve riboz nükleik asit gibi tüm genetik materyalleri tanımlayan yeni ortaya çıkan bir alandır. Bu teknolojinin en iyi yanı, mikrobiyal toplulukların muazzam genetik değişkenliğine anında öncülük etmek için çevresel mikrobiyologlara daha fazla esneklik sağlamasıdır. Bu tez kapsamında İstanbul Üniversitesi Biyoloji Bölümü, Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı (TEMA) Laboratuvarı tarafından Küçükçekmece Gölü, Manyas Gölü ve Batı Karadeniz gibi farklı kaynaklardan alınarak oluşturulmuş bakteri izolatlarının metagenomik analizi yapılmıştır. TEMA Laboratuvarı tarafından ticari olarak mevcut API 20E test sistemi kullanılarak standart biyokimyasal yöntemlerle fenotipik olarak tanımlanan izolatlar, genotipik olarak, 16S bakteriyel rRNA geni, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edildi ve sekanslandı. PCR ürününün dizisi, SILVA ( Version 99) veri tabanındaki bilinen 16S rRNA gen dizileri ile çoklu dizi hizalaması ile karşılaştırıldı. Bu çalışma, klasik yöntemler kullanılarak yapılan fenotipik tanımlamaların hatalara yol açabileceğini ve dolayısıyla daha güvenilir, ucuz ve hızlı tanımlama yöntemlerinden olan Metagenomik analizlerin önemini gösteren örnek bir çalışma olarak değerlendirilebilir.
Genetik olarak değiştirilmiş soyada omik analizler
Mutasyon ıslahı ve genetik mühendisliğinden yararlanan moleküler ıslah, klasik bitki ıslahına destek olarak istenilen karakterleri taşıyan bitkilerin daha kısa süre içerisinde geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Özellikle genetik mühendisliği ile geliştirilen genetiği değiştirilmiş (GD) transgenik bitkiler biyogüvenlik, etik, çevresel değerlendirme ve risk yönetimi ile ilgili tartışmaları da beraberinde getirmiş, GD bitkiler için beklenen ve olası beklenmeyen değişikliklerin belirlenmesi biçimindeki risk değerlendirmeleri önem kazanmıştır. GD ürünlerinin güvenlik testleri için genel kabul görmüş 'temel eşdeğerlik' kavramı kullanılmakta olup son yıllarda bu kapsamda profil tabanlı genomik ve proteomik yaklaşımlar, güvenlik değerlendirmesindeki gücü ve doğruluğu nedeniyle sıklıkla tercih edilmektedir. Bu tez çalışmasında temel eşdeğerlilik kapsamında, transgenik, transgenik olmayan, mutant, mutantın kökenlendiği Ataem-07 soya bitkileri ve bu çeşitten elde edilmiş transgenik saçak köklerde transgenesiz ve mutagenesizin neden olduğu beklenmeyen etkilerin karşılaştırmalı olarak incelenmesi amacıyla genomik, gen anlatımı ve proteomik çalışmaları yürütülmüştür. Bu karşılaştırmalar sonucunda deney grupları arasında genom, gen anlatımı ve proteom düzeyindeki farklılıklar belirlenmiştir. Transgenik, mutant, mutantın kökenlendiği Ataem-07 soya bitkilerinin kökleri ve transgenik saçak kökler kullanılarak gerçekleştirilen genomik kapsamlı IRAP analizlerinde, hem Bagy2 hem de Nikita retrotranspozonunun deney grupları arasında polimorfizm gösterdiği saptanmıştır. Ataem-07 ile karşılaştırıldığında Bagy2 için polimorfizm oranı, deney grupları arasında en yüksekten en düşüğe olacak şekilde saçak kök, %0-69; transgenik, %20-42; mutant, %0-25 olarak belirlenmiştir. Nikita için ise bu değerler sırasıyla %0-71, %18-42, %0-36 olarak tespit edilmiştir. Bagy2 ve Nikita retrotranspozları için en yüksek polimorfizm oranları sırasıyla transgenik saçak örneklerinde %56-69 (kök-5) ve %62-71 (kök-5) olarak saptanmıştır. Ataem-07 ile yapılan bu karşılaştırmalar, transgenesizin Bagy2 ve Nikita ile ilişkili genom değişimleri bakımından mutasyona ıslahına göre daha fazla etki yarattığını düşündürmüştür. Transgenik, transgenik olmayan, mutant ve Ataem-07 soya çeşidi bitkilerinin hem gelişim ile ilişkili genlerinin anlatım profilleri belirlenmiş hem de proteomik analizleri gerçekleştirilmiştir. Gen anlatım analizleri için, deney grupları arasında fide boyu ve çiçeklenme zamanı bakımından belirgin farklılıklar gözlendiğinden (beşinci üçlü yaprak evresinde Transgenik, 43 cm ve çiçeklenme yok; Transgenik olmayan, 61 cm ve çiçeklenme var; mutant, 18 cm ve çiçeklenme yok, Ataem-07, 22 cm ve çiçeklenme yok) gelişim ile ilişkili dt1, e1, elf3, luxb, luxc ve sız1a genleri seçilmiştir. Ataem-07 bitkilerinde, mutantlara göre sız ve elf3 genlerinin, transgenik olmayan bitkilerde ise transgeniklere göre dt1, e1, luxb ve luxc genlerinin anlatımlarının istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı belirlenmiştir. Bu durum, transgenesizin, gelişim ile ilişkili incelenen 6 gen bakımından gen anlatım profillerindeki farklılığa daha fazla neden olabileceğini düşündürmüştür. Deney gruplarında protein profillerindeki farklılıkları değerlendirmek için yapılan 2-D elektroforez analizi sonuçları, protein spot sayılarının 533 ile 674 arasında değiştiğini ortaya koymuştur. Mutant bitkilerdeki toplam protein spotlarının %25,7'sinin kökenlendiği bitkilerde bulunmadığı, transgenik bitkilerdeki toplam protein spotlarının ise %11'inin transgenik olmayan bitkilerde yer almadığı saptanmıştır. Mutant ve transgenik bitki gruplarının sırasıyla Ataem-07 ve transgenik olmayan bitkilere göre anlatım düzeyi farklılık gösteren protein spotlarında yapılan dağılım grafiği analizleri sonucunda, anlatım düzeyi 2, 3, 4 ve 5 kat artan ve azalan proteinlerin dağılımının mutant bitkilerde transgenik bitkilere göre daha geniş bir yayılım gösterdiği belirlenmiştir. Mutant bitkilerde anlatımı artan proteinlerin gelişim, stres tepkisi, fotorespirasyon ve ribozomal alt birim, mRNA işlenmesi, karbonhidrat metabolizması, homeostaz, kromozomal kararlılık ve transkripsiyon regülasyonu gibi biyolojik süreçlerle ilişkili oldukları saptanırken, transgenik bitkilerde anlatımı artan proteinlerin ribozomal alt birim, elektron taşınması, amino asit-nükleik asit ve karbonhidrat metabolizması, sinyal yolakları ve hücre duvarı biyogenezi ile ilgili sınıflarda yer aldığı belirlenmiştir. Proteomik analiz sonuçları, hem anlatımı yapılmayan hem de anlatımları değişen protein sayısının, mutantlarda transgeniklere göre daha fazla olduğunu göstermiştir. Bu durum, gama radyasyonunun genomda rastgele biçimde neden olduğu değişimlerin, transgen insersiyonu etkisine göre proteoma yansımasının daha fazla olduğunu düşündürmüştür. Anlatım artışı gösteren proteinlerin her iki grupta da temel biyolojik yollarla ilişkili oldukları belirlendiğinden, mutasyonun proteomda yaratmış olduğu etkilerin transgenesize göre, incelenen protein çeşitleri bakımından önemli farklara neden olmadığı sonucuna varılmıştır. Sonuç olarak, bu çalışmada Bagy2 ve Nikita bakımından retrotranspozon hareketliliği, dt1, e1, elf3, luxb, luxc, sız1a gelişim genleri ve 674 adet proteinin anlatım analizleri kapsamında elde edilen bulgular ile, transgenesizin genomdan proteoma giden yoldaki değişimleri mutagenesize göre, mutagenesizin ise gen anlatımının son kademesi olan proteomdaki değişimleri transgenesize göre daha fazla etkilediği gösterilmiştir. Farklı ıslah yöntemlerinin bitkilerde beklenmeyen değişiklilikleri meydana getirme potansiyeli ve buna bağlı olarak risk oluşturmaları üzerindeki tartışmalar GD organizmalara odaklanma eğilimindedir. Ancak, yapılageldiği gibi yeni özellikler kazandırılan bitkilerin herbirinin ayrı ayrı karakterize edilmesinin yanında, risk değerlendirmesi kapsamında bitki ıslahı için kullanılan mutasyondan, yeni nesil ıslah yöntemlerine kadar farklı yaklaşımların tümünün bu etkiler bakımından değerlendirilmesinin yararlı olacağı düşünülmektedir. Bitki ıslah yöntemleri ile meydana gelebilecek varyasyonların omik teknolojilerle karakterizasyonu bitki ve gıdaların bileşimi hakkında daha derin bilgi sağlayacak, üreticileri, tüketicileri, biyogüvenlik ve risk değerlendirmesine yönelik olarak yasa düzenleyicilerini ve diğer paydaşları bilgilendirmeye yardımcı olacaktır.
Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe'de antifungal ilaçların etkin kullanım için araştırılması
Fırsatçı mantar patojenlerinin neden olduğu fungal enfeksiyonlar insan ölümlerinin önde gelen nedenlerinden biridir. Patojenik mantarlardan Candida, Aspergillus, Cryptococcus ve Pneumocystis türlerinin neden olduğu invaziv fungal enfeksiyonların dünya çapında yol açtığı morbidite ve mortalite oranı ciddi bir tehlike oluşturmaktadır. Sistemik mantar enfeksiyonlarını tedavi etmek için başlıca üç sınıf antifungal ilaç kullanılmaktadır. Bunlar ergosterol biyosentezini hedefleyen azoller, mantar hücre duvarı biyosentezini engelleyen ekinokandinler ve mantar hücre zarında hücre parçalanmasına yol açan ve ergosterole bağlanan polienlerdir. Son yıllarda bu ilaçların düzensiz, uzun süreli ve dikkatsiz kullanımı, söz konusu patojenlerin zaman içinde direnç kazanmasına yol açmıştır. Antifungal ilaç direncinin altında yatan nedenler olarak, ilaç hedef değişikliği veya aşırı ekspresyonu, çoklu ilaç taşıyıcılarının yukarı regülasyonu ve stres tepkilerinin aktivasyonu gibi çok sayıda adaptif mekanizma bulunmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında 19 yeni aday gen ve literatür taramasından flukonazol hedefi erg11 geni dahil flukonazole direnç ile ilişkili 5 genin antifungal ilaç direncindeki rolleri araştırıldı. Bu amaçla, patojenik fungilerle çok fazla ortak özellik paylaşan fisyon mayasının (Schizosaccharomyces pombe) ED666 yabani suşu ve ele alınan genler bakımından delesyonlu 21 suĢ (SPAC22H10.09, bun107, mug166, nnt1, nas2, yih1, hrk1, SPAC4H3.06, msh1, rpb9, qcr8, rsv2, srp14, clp1, bgs4 ve plh1, rhp18, SPCC338.06c, SPBC27B12.05 phb2 ve erg31) çalışma materyali olarak kullanıldı. Bu kapsamda, S. pombe ED666 ırkında, üç farklı antifungal ajanın (flukonazol, tetrakonazol ve tiyabendazol) ayrı ayrı ve flukonazol ve tetrakonazol kombine şekilde kullanılarak minimum inhibe edici konsantrasyonları (MĠK) hesaplandı. Hücrelerin bu ajanlar arasında flukonazole karşı MİK'in üzerindeki değerlerde hücre duvarı içeriğini değiştirerek üremeye devam ettiği paradoksiyal etki gözlendi. Bu tez kapsamında gerçekleştirilen ileri analizlerde sadece flukonazolün üremenin seyrinin değişime başladığı konsantrasyonlar olan IC5 ve IC10 değerleri S. pombe yabani suşunda kullanıldı. Buna göre, bazı genlerin (SPAC22H10.09, bun107, mug166, nnt1, nas2, yih1, SPAC4H3.06, msh1, rpb9, qcr8, rsv2, erg6 ve erg9) transkripsiyon seviyeleri IC5 dozunda artarken, IC10 dozunda azaldığı gözlendi. Buna karşın, diğerlerinin her iki dozda azalan (srp14, clp1, bgs4 ve phb2) ve artan (plh1, erg11 ve erg31) seviyeleri tespit edildi. Parental ve mutant suşlarda kayda değer bir ROT artışı gözlemlenmedi. Bu sonuç, dirençli suşlarda ROT seviyesinin düşük olmasıyla uyumludur. Sonuç olarak, SPAC22H10.09, bun107, mug166, nnt1, nas2, yih1, SPAC4H3.06, msh1, rpb9, qcr8, rsv2, srp14, clp1, bgs4, plh1 ve phb2 genlerinin ilk defa bu tez çalışmasında ilaç direnci ile ilişkisi ortaya konurken, dirençte bu genlerin aşağı düzenlenmiş olmalarının da rolü olduğu önerilmektedir.
Asetik asit uygulamasının arpa (Hordeum vulgare L.) kromozomlarına etkileri
Bitkiler büyüme ve gelişme döneminde biyotik ve abiyotik streslere maruz kalmaktadır. Özellikle kuraklık gibi abiyotik stresler bitkilerin hücre, doku ve organ seviyesinde değişikliğe neden olmaktadır. Bu durum bitki verimini düşürmekle birlikte ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Literatürde, asetik asidin, bitkilerde kuraklık gibi abiyotik (kuraklık, tuzluluk vb.) strese dayanıklılığı arttırdığı gösterilmiştir. Asetik asit (AA), geleneksel tedavi ve gıda gibi çok yaygın kullanım alanı bulunan, kolay elde edilebilen ucuz bir maddedir. Bu çalışmada, AA konsantrasyonlarının arpa (Hordeum vulgare ¬L. cv. Bornova-92 çeşidi arpa tohumu) bitkisinin taze ağırlığını, kuru ağırlığını, su içeriğini, sürgün uzamasını, kök uzunluğu ve hücre bölünmesini hangi yönlerde etkileyeceği ve bunun hücre bölünmesi ve kromozom yapısına etkisi araştırılmıştır. İki gün çimlenmiş olan arpa bitkilerine 0 mM (kontol), 10 mM, 20 mM ve 30 mM olmak üzere üç farklı konsantrasyonda AA uygulanmış ve bitki büyütme kabininde karanlık ortamda 1 gün bekletilmiştir. Ardından AA'nın arpa tohumlarının kök-sürgün uzunluklarına, taze-kuru ağırlık miktarlarına ve su içeriğine, mitotik indeksi ve anormallik indeksi üzerine olan etkisi analiz edilmiştir. Daha sonra tohumlar 1 gün boyunca recovery (REC) uygulaması için distile su içerisinde bekletilmiştir. REC uygulamasından (48 saat) sonra da arpa tohumlarının fizyolojik ölçümleri ve hücre fazları sayımı, mitotik indeksi ve anormallik indeksi istatistiksel analizler yapılarak, asetik asit ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra da etkilerinin devam edip etmediği incelenmiştir. Çalışmamızda tüm deneyler 3 tekrar olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Her analiz için 3 değerin istatistiksel farklılıkları ANOVA programı ile hesaplanmıştır. Analiz edilmiş ve ortalamalar arasındaki farklılıkların önemlilik düzeyi P< 0.05 olan değerler istatistiksel bakımdan anlamlı kabul edilmiştir. Çalışma sonunda, asetik asidin kısa sürede, düşük (10mM) konsantrasyonda bitki gelişimini, özellikle su içeriğini, sürgün uzamasını ve hücre bölünmesini kontrol gruplarına göre arttırdığı ve bu etkilerin madde uzaklaştırıldıktan sonra da devam ettiği tespit edilmiştir. Bununla beraber, kromozom yapısına anlamlı etkileri 10mM konsantrasyonda olumlu bir artış gözlemlenmiştir. En fazla kromozom anormalleri anafaz evresinin kromozom köprülerinde olduğu görülmüştür Çalışma sonunda, asetik asidin kısa sürede, düşük (10mM) konsantrasyonda bitki gelişimini, özellikle taze ağırlığı, kuru ağırlığı, su içeriğini, kök uzunluğu, sürgün uzamasını ve mitotik indeks ve kromozom anormalleri kontrol gruplarına göre arttırdığı ve bu etkilerin madde uzaklaştırıldıktan sonra da devam ettiği tespit edilmiştir. Bununla beraber, kromozom yapısına anlamlı etkileri 10mM konsantrasyonda olumlu bir artış gözlemlenmiştir. 20mM konsantrasyonda, taze ağırlığı, su içeriğini, kök uzunluğu, sürgün uzamasını ve mitotik indeks değerlerinde azalma; kuru ağırlığın ve kromozom anormallerin kontrol gruplarına göre artma tespit edilmiştir. 30mM konsantrasyonda, taze ağırlığı ve mitotik indeks artma; su içeriğini, kök uzunluğu, sürgün uzamasını ve kuru ağırlığın ve kromozom anormallerinde azalma tespit edilmiştir. Rec uygulamalarındada bu etkinin devam ettiği gözlenmiştir. En fazla kromozom anormalleri anafaz evresinin kromozom köprülerinde olduğu görülmüştür. Analizlerimiz sonucunda AA'nın kısa zamanda düşük konsantrasyonlarda dahi bitki büyüme döneminde dışardan uygulanmasının bitkinin büyüme ve gelişme döneminde olumsuz koşulları azaltabileceği ve kuraklık dönemlerinde bitkilerde kullanılmasının bitki verimine ve ülkemiz ekonomisine olumlu yönde etkisi olacağı düşünülmektedir.
Kemirgen sıtma parazitlerinde endoplazmik retikulum stresi ile indüklenen hücresel ölüm yolaklarının karakterizasyonu
İnsan kanser hücrelerinde tedavi amaçlı kullanılan çeşitli kimyasallara karşı geliştirilen çoklu ilaç direnci "Multiple Drug Resistance, MDR", kanser tedavisinde başarıyı sınırlayan faktörlerin başında gelmektedir. Bu nedenle, kanser hücrelerinde programlı hücre ölümünü hedefleyen ilaçların geliştirilmesini amaçlayan çalışmalar hız kazanmıştır. Çoklu ilaç direncinin sıtmaya karşı kullanılan ilaçlara karşı da gözlemlenmiş olması göz önünde bulundurularak; bu çalışmada ER stresi ile tetiklenen hücre ölüm yolaklarının moleküler mekanizmasının anlaşılması hedeflendi. Bu amaçla kemirgen sıtma paraziti olan Plasmodium berghei'de, ER stresini tetikleyen tunikamisin, sıtma ilacı olarak kullanılan klorokin ve kanser ilacı olarak kullanılan 5-Florourasil ilaçlarının hücre canlılığı ve üreme profiline etkileri sorgulandı. Ayrıca apoptoz ve otofaji süreçlerinde rol oynayan hedef genlerin anlatım profilleri transkript düzeyinde araştırıldı. BIP ("Immunoglobulin Heavy Chain Binding Protein") geninin anlatımındaki değişim seviyelerine bakıldığında, Plasmodium berghei türü kemirgen sıtma parazitlerinde; tunikamisin, 5-fluorourasil ve klorokin ilaçları uygulanmasında güçlü bir ER stresinin tetiklendiği kesin olarak gösterilmiştir. 5-fluorourasil ve klorokin uygulamasında, otofaji ilişkili genlerin aktivasyonuna rağmen hücrelerin apoptoza yöneldikleri; tunikamisin uygulamasında ise hücrelerin doğrudan apoptoza yöneldiği düşünülmektedir.
Çölyak hastalığı ile immün yanıt arasındaki ilişkinin meta analizi
Çölyak hastalığı; buğday, arpa, çavdar gibi tahıllarda bulunan glutenin tetiklediği, genetik olarak yatkın bireylerde kronik bağırsak iltihabı ve villusların körelmesi ile karakterize otoimmün bir hastalıktır. İnsidansı coğrafi koşullardan ve toplumların etnik yapısından etkilense de dünya genelinde görülme sıklığı %1 ile %2 arasındadır. Hastalar genellikle karın ağrısı, ishal, kusma gibi tipik belirtiler gösterdiği gibi, büyümede gerilik, anemi, yorgunluk, sinirlilik, cilt problemleri gibi atipik belirtiler de gösterebilir. Hasta profilindeki çeşitlilik ve standardize edilmemiş serolojik testler klinik uygulamalarda oldukça zorlayıcı olmaktadır. Hastalık immün sistem ile yakından ilişkilidir. İmmün sistemin glutene karşı oluşturduğu tepki, ilk olarak kanda ilgili otoantikorların saptanmasıyla belirlenir. Gluten yoluyla tetiklenen immün sistem mekanizmalarının ince bağırsakta oluşturduğu tahribatın bir sonucu olarak körelen villuslardaki histolojik değişimlerin derecesine bakılarak hastalığın kesin tanısı konur. ÇÖLYAK HASTALIĞI ile İMMÜN YANIT ARASINDAKİ İLİŞKİNİN META ANALİZİ xii Tanının ilk aşamasında serolojik testler kullanılır. Serolojik testlerin pozitif çıkması durumunda hasta ince bağırsak biyopsisine yönlendirilir. Bu yüzden serolojik testlere ait duyarlılık, özgüllük ve prediktif değerler gibi tanısal doğruluk parametreleri biyopsi kararında çok önemlidir. Buna rağmen çoğu klinik çalışmada bu değerler verilmemektedir. Bu eksik parametreler serolojik testlerin standardizasyonunu ve tanıyı güçleştirmektedir. Literatürde çölyak serolojik testlerinin tanısal doğruluğunu inceleyen geleneksel meta analiz çalışmaları olmasına rağmen, çölyak hastalığı ile bağışıklık sistemi arasındaki ilişkiyi makine öğrenmesi algoritmaları kullanarak değerlendiren bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu tezin amacı, hastalığın immün göstergelerinden biri olan otoantikorların ölçümünde kullanılan serolojik testlerin tanısal doğruluk parametrelerini makine öğrenmesi algoritmalarıyla tahmin eden farklı bir meta analiz yaklaşımı geliştirmektir. Bu amaçla, anti-gliadin antikoru (AGA), anti-endomisyum antikoru ve anti doku transglutaminaz antikoruna ait veri setlerine karar ağaçları, rastgele orman, gradyan artırma ('gradient boosting') ve naive Bayes sınıflandırması olmak üzere dört farklı makine öğrenmesi algoritması uygulanmıştır. Çölyak tanısında kullanılan immünolojik testlerin duyarlılık parametrelerini en başarılı tahmin eden makine öğrenme algoritmasının, %88.7 doğrulukla karar ağaçları algoritması olduğu bulunmuştur. Bu algoritma ile tahmin edilen tanısal doğruluk parametrelerinin serolojik testlerin standardizasyonuna katkı sağlayacağı, ayrıca epidemiyolojik çalışmalarda ve meta analizlerde eksik verileri tolere edebileceği düşünülmektedir.
Aort dıseksiyonu olan hastalarda MMP2 ve TIMP2 genlerinin anlatım analizi
Torasik Aort Diseksiyonu (TAD) aort damarında meydana gelen son derece ölümcül bir hastalıktır. İnsan vücudunda bulunan en büyük atar damar olan aortun iç tabakasında başlayan bir yırtığın, damar boyunca uzanarak tabakaları birbirinden ayırması ile karakterizedir. Ayrılan tabakalar arasında gerçek damar boşluğuna paralel olarak yalancı bir lümen oluşumu gözlenir. Aort damarının orta tabakası olan medya tabakasında aort damarına dayanıklılığını ve esnekliğini veren hücreler arası matriks (ECM) bulunur. Elastik fiberler ve peptidoglikan yapılar ECM'nin bileşenleridir. TAD vakalarında aort damarında bulunan hücreler arası matriks parçalanmış durumdadır. TAD patogenezinde damarın esnekliğini sağlayan liflerin yapısı ve miktarlarında değişim, hücreler arası matriks proteinlerini parçalayan enzimlerin ve regülatörlerinin arasındaki dengenin bozulması ve bunlara bağlı olarak hücredeki parçalanma faaliyetlerinde artış görülmektedir. Matriks metalloproteinazlar (MMP) aktif bölgelerinde Zn2+ bulunan geniş bir endopeptidaz ailesidir. Endotel hücre, düz kas hücresi, vasküler düz kas hücresi, fibroblast, enflamatuvar hücreler ve aort damar duvarı gibi birçok hücre çeşidinde üretilebilirler. MMP'lerin hücreler arası matriks proteinlerinin yıkılması, ECM devamlılığının sağlanması, kontrolü ve sinyal iletiminin regülasyonu gibi görevleri vardır. MMP'ler dokuda kendi doğal inhibitörleri ile eşzamanlı olarak bulunurlar. Metalloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP) MMP'lerin hem aktivasyon hem de inhibisyonlarında aktif bir şekilde rol alırlar. Bu tez çalışmasındaki ilk amacımız 10 adet TAD hastası ve 10 adet sağlıklı bireyden elde edilen aort damar dokusunda TAD patogenezinde önemli rolü olduğu düşünülen MMP2, MMP9, TIMP2 ve TIMP3 genlerinin mRNA düzeyinde anlatım farklılıklarını belirlemektir. İkinci amacımız, çalışma gruplarından elde edilen periferik kan kökenli monosit hücrelerinde MMP2, MMP9, TIMP2 ve TIMP3'ün gen anlatım analizlerini aort damar dokusundaki gen anlatımı ile karşılaştırmaktır. Üçüncü amacımız ise hedef genlerin promotör bölgelerindeki metilasyon düzenlerinin metilasyon sensitif yüksek çözünürlüklü erime (MS-HRM) yöntemi ile belirlenerek aynı genlerin aort damar dokusundaki gen anlatım miktarları ile olan ilişkisini araştırmaktır. MMP2, MMP9, TIMP2 ve TIMP3 genlerinin gen anlatımı analizleri damlacıklı dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPZR) yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçların TAD hastası ve kontrol grupları arasındaki değişimlerinin istatistiksel anlamlılık düzeyleri parametrik olmayan "Mann Whitey U" testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Hasta ve kontrol grubu arasında duyarlılık ve özgüllük kontrolü için "Receiver Operating Characteristics" (ROC) eğrisi analizi kullanılmıştır. Gerçekleştirilen analizler sonucunda MMP2'nin gen anlatımının (p=0.85) TAD hastalarının aort damar dokularında kontrol grubuna göre değişmediği, MMP9'un (p=0.043), TIMP2'nin (p=0.0089) ve TIMP3'ün (p=0.028) anlamlı düzeyde azaldığı bulunmuştur. Monosit hücrelerde gerçekleştirilen MMP2 (p=0.15), MMP9 (p=0.11), TIMP2 (p=0.25) ve TIMP3 (p=0.37) gen anlatımı analizinde TAD hastalarında, kontrol grubuna göre anlamlı bir değişikliğin gözlenmediği bulunmuştur. Ayrıca aort damar dokusu ve monosit hücrelerde MMP/TIMP oranları da incelenmiştir. Aort damar dokusunda MMP2/TIMP2 oranı (p=0.063) artış göstermiştir ancak istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. MMP2/TIMP3 oranı (p=0.012) TAD örneklerinde kontrollere göre anlamlı düzeyde farklı bulunurken MMP9/TIMP2 (p=0.25) ve MMP9/TIMP3 (p=0.80) oranlarında anlamlı bir artış gözlemlenmemiştir. Monosit hücrelerde ise MMP2/TIMP2 (p=0.45), MMP2/TIMP3 (p=0.68), MMP9/TIMP2 (p=0.80) ve MMP9/TIMP3 (p=0.28) olarak bulunmuştur. Hedef genlerin promotör bölgelerindeki metilasyon düzeninin araştırılması için kullanılan MS-HRM yöntemi sonucunda MMP9 geninde hedeflenen bölgede TAD hastalarında ve kontrol grubunda metillenme yüzdesi %0 olarak belirlenmiştir. TIMP3 geninde ise TAD hastalarında promotör bölgesinin ortalama metillenme düzeyi %10 olarak bulunurken kontrol grubunda %12.5 olarak belirlenmiştir. Ek olarak hedef genlerin metilasyon düzenleri ile ilgili TAD hastası ve kontrol grubu arasında anlamlı bir fark olmadığı (p=0.91) bulunmuştur. Yapılan tez çalışması sonucunda TAD hastalarında kontrol dokulara kıyasla elde edilen istatistiksel olarak anlamlı bir düzeyde anlatımı azalmış MMP9, TIMP2 ve TIMP3 genleri ve istatistiksel anlamlılık düzeyinde artış göstermiş MMP2/TIMP3 ve istatistiksel anlamlılık düzeyine çok yakın olarak artış göstermiş olan MMP2/TIMP2 oranları, seçilen hedef genlerin TAD patogenezinde önemli olduğunu düşündürtmektedir. Ek olarak istatistiksel anlamlılık düzeyine ulaşamasa da monosit hücrelerde azalan MMP9 ve TIMP3 gen anlatımı ve aort damar dokusunda artmış MMP9/TIMP2, MMP9/TIMP3 gen anlatımı oranları da TAD tablosu ile uyumludur. Ayrıca yapılan metilasyon analizinde TAD vakalarında MMP9 ve TIMP3 genlerinin gen anlatımlarının düzenlenmesinde DNA metilasyonunun katkısının olmadığı söylenebilir.
Pseudomonas syringae ve Pseudomonas savastanoi'deki mate ve IAAL proteinlerin in siliko karakterizasyonu
Three bacterial species from the Pseudomonas genus, Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 and Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi, are recognized as disease-causing agents. Recent analyses show a high correlation between both virulence and disease occurrence versus the expression of matE and iaaL genes and the corresponding MatE and IaaL proteins. These proteins are part of the Type 3 Secretion System bacterial machinery responsible for the delivery of the virulence factors of bacteria into the plant cell and are connected with the auxin hormone production, which in turn has a role in the plant disease. As MatE protein of Pseudomonas syringae pv. actinidiae is one of the main parts of the membrane transport machinery, its characterization helps us to determine the possible role of the protein in toxicity induction. We used different tools for the aforementioned analyzes. Using BLAST, we identified the full sequences of homologous MatE and IaaL proteins in all species containing them. Multiple sequence alignment helped us to identify the conservation level amongst proteins, polymorphisms, and similarities. The phylogenetic tree confirmed the MSA analysis results. Our protein of interest from three species has a positive phylogenetic distance from other species, and between each other. The 3D model of the MatE proteins from different species shows a tube-like structure made of alpha-helices interconnected by loops. The main differences between the studied proteins are the residue sequence in their loops. We found deletions and polymorphisms in the loop regions that may cause different folding patterns in the MatE proteins from the three species we analyzed, especially in the P. syringae pv. actinidiae. We found only one ligand, the "OLC" ligand interacting with MatE of P. syringae pv. actinidiae. It binds the inner part of the tube-like structure of MatE. According to STRING analysis, MatE interacts with only two other proteins, while IaaL has a wide network of interactions. All the MatE proteins have two MatE domains of the same size. The intergenic region of matE genes is highly conserved amongst the species. We found differences in the promoter regions. Polymorphisms in the promoter region might be one extra indicator of the particular characteristics of these proteins in Pseudomonas syringae pv. actinidiae and their influence on its toxicity in tomatoes and kiwi. Polymorphisms in the loop structures of MatE proteins and promoter regions might be the reason for the protein influence on the toxicity in the tomatoes and kiwi.
WNT/beta-catenin sinyal yolağında makine öğrenmesi ile hedef genler belirlenmesi
The Wnt signalling pathway is a driving force of proliferation and differentiation. Aberrant behaviour in this pathway may lead to several types of cancers and Alzheimer's disease. This pathway controls the transcription of target genes via modulating the presence of Betacatenin in cytosol, which triggers the TCF/LEF transcription factor. We found 93 target genes identified experimentally in the colorectal cancer context, and new target genes are constantly being discovered. This study aims to identify novel target genes of the Wnt/Beta-catenin signalling pathway using a machine learning approach. We analysed several publicly available Microarray and RNA-seq experiments and used the differential gene expression data to represent the genes. We used the experimentally validated target genes as "positive" examples in training. We chose the "negative" examples randomly from the rest of the genes. We trained pools of 1000 independent classifiers using the Classification and Regression Tree (CART) method. Then each trained classifier was used to assign a "positive" or "negative" label for each gene. The number of times each gene is classified as "positive" is a score that can be tested using the Fisher method. Thus, we found a set of putative target genes having an expression pattern very similar to known target genes. The pool of trained classifiers predicted 144 putative novel target genes. Some of the highest scoring genes are PTCH1, GLI3 and SOX4. The first two predictions, PTCH1 and GLI3, are important components of the Hedgehog Signalling. This suggests a possible interplay between Wnt and Hedgehog signalling in colorectal cancer. In parallel to our study, experimental researchers have reported that PTCH1 is a colon specific Wnt target. We present a bioinformatic method that can be used to predict target genes of the canonical Wnt signalling pathway, and eventually other pathways, based only on gene expression data and a sample of experimentally validated targets. This method narrows the set of genes that should be experimentally validated. Moreover, some of our predictions have already been validated by other studies.
Camponotus floridanus'ta BMP sinyalizasyonu ve zorunlu endosimbiyont varliğinda değişimi
Birbiriyle etkileşen genlerden oluşan Gen Düzenleyici Ağlar (GRN'ler, Gene Regulatory Networks), çok çeşitli gelişimsel bağlamlarda patern oluşumundan sorumludur. Tüm iki taraflı simetrik hayvanlar, embriyogenez sırasında gelişimsel patern oluşumu yoluyla simetri eksenlerini kurma sorunuyla karşı karşıyadır. GRN'ler bu gelişimsel patern oluşumu ve morfogenetik süreçlerin temelinde yer alır ve bu etkileşimlerdeki değişiklikler fenotipte değişikliklere neden olur. En kapsamlı şekilde karakterize edilen GRN'lerden biri, birçok böcekte Kemik Morfogenetik Protein (Bone Morphogenetic Protein, BMP) sinyal yolu tarafından yönlendirilen dorsoventral (DV) patern oluşum sistemidir. DV ekseninin oluşumu Drosophila melanogaster'da iyi çalışılmış olsa da, karıncalar söz konusu olduğunda bu süreçler büyük ölçüde bilinmemektedir. Ayrıca, hücresel endosimbiyontlara ev sahipliği yapan böcekler söz konusu olduğunda, konak gelişimsel GRN'lerin, endosimbiyont ve kendi hücreleri arasındaki sinyallerle etkileşimleri nedeniyle ek zorluklarla karşılaşılır. Bu tezde, endosimbiyont varlığının, konağın DV ekseninin oluşumuna etkisi araştırılmıştır. Endosimbiyontun mevcudiyeti durumunda DV ekseninin kurulmasının nasıl değiştirilebileceğini anlamak için, bu süreçler marangoz karınca Camponotus floridanus'ta karakterize edilmiştir. Bu amaçla hayvanlarda DV paternini temel olarak kontrol eden BMP sinyali karakterize edilmiştir. Moleküler klonlama, in situ hibridizasyon, RNA İnterferans gibi moleküler teknikler özellikle DV ekseni oluşumunda yer alan gelişimsel genlerin ekspresyonunu ve işlevini incelemek için kullanılmıştır. Sonuçlar, BMP sinyal yolunun C.floridanus'un erken gelişimi sırasında aktif olduğunu ortaya koymuştur. Gen ekspresyonu çalışmaları göstermiştir ki ligandlar decapentaplegic (dpp), glass-bottom boat (gbb); metalloproteaz tolloid (tld); antagonistler twisted gastrulation (tsg), short gastrulation (sog); tip I reseptör thickveins (tkv) and tip II reseptör punt embriyo ve germline kapsülünde eksprese edilirken dpp ve sog hariç serosa ya da amniyonda eksprese edilmezler. dpp ve sog amniyonda sog ise serosa da ekprese edilir. dpp, gbb ve tkv erken aşamalarda bakteri bölgesinde, tld, sog ve tkv ise daha sonraki aşamalarda yumurtadaki bakteriyosit bölgesinde eksprese edilir. Gen fonksiyonu çalışmaları, BMP sinyalinin azalmasının veya kaybının, üç embriyonik germ tabakasının - ektoderm, mezoderm ve endoderm - kimliğini etkilediğini ortaya koymuştur. Ek olarak, ekstraembriyonik serosanın oluşumu, BMP sinyalinin azalmasından etkilenirken, amniyonun kimliği bu yoldan bağımsız olabilir.
TP53 META: TP53 modülatörleri ve mutasyonlarının meme kanseri odağında gen ifade profillerine etkilerini görselleştiren bir web aracı
Belirli bir tedavi ile ilişkili veri setlerinin derlenmesi ve karşılaştırılması, bilimsel bir soruya ilişkin anlayışımıza katkıda bulunabilir. Transkripsiyon faktör protein 53 (TP53), diğer adıyla "Genomun Gardiyanı", sporadik meme kanserinde en çok mutasyona uğrayan transkripsiyon faktörlerinden biridir. TP53 hedef genlerini derleyen, açıklayan ve listeleyen birçok web aracı bulunsa da, bu gen listeleri önemli derecede farklılık gösterebilmekte ve bu listelerin görselleştirilmesini ve meta analizinin yapılmasını sağlayan bir web aracı bulunmamaktadır. Bu bağlamda, R Shiny tabanlı, TP53 META adında, iki koşullu RNA Dizileme veri setlerinden dört farklı setin eş zamanlı karşılaştırılmasına kadar çıkabilen analizlere ve bu analizlerin görselleştirilmesine olanak sağlayan bir araç geliştirdim. TP53 META, seçilen veri setlerinin normalizasyonunu ve limma veya DESeq2 ile diferansiyel ekspresyon analizini bir arada yapabilmektedir. Dahası, bu araç kullanıcıların kümeleme, gen seti zenginleştirme ve transkripsiyon faktörü-hedef zenginleştirme analizleri yapabilmelerini sağlamakta ve bunun yanı sıra ilgili tekli veya kombinasyon tedavilerine ilişkin anlayışımızı güçlendirebilecek hastalık-gen ve tedavi-gen bipartit yapı ağlarının görselleştirmesini yapabilmektedir. TP53 META'nın modülleri transkriptomun yalnızca belirli bir alt kümesine, örneğin TP53 proteininin özelleşmiş hedef genlerinden DREAM hedef genleri listesine, sınırlı tutularak da kullanılabilmektedir. Bir diğer yandan TP53 META, mevcut meta-analiz istatistiksel metotlarından yararlanarak meta-p değeri hesaplamaktadır ve çoğunluğu TP53 ifadesinin; siRNA tedavileri, nutlin ve doxorubicin gibi indükleyiciler ile tedavileri, CHRNA5 deplesyonu ve stabil homozigot veya heterozigot mutasyonlar üzerine modüle olmuş olduğu meme kanseri hücre hatlarına ait verilerden oluşan hem genel kullanıma açık hem de Konu Lab'a ait veri setlerini içermektedir. Genel kullanıma açık veri setleri GEO veri tabanından alınarak, Konu Lab'a ait veri setleri de fastq okuma dosyalarından ham sayma verilerine çevrilerek TP53 META web aracına entegre edilmiştir ve akabindeki hipotezler bu web-aracının işlevselliğini gösterebilmek için test edilmiştir: 1) Literatürde TP53 indükleyicisi olarak bilinen CHRNA5'in deplesyonu MCF7 hücre hattında DREAM hedef genlerinin ilerleyen kaybına yabanıl TP53 varlığında mı yoksa heterozigot TP53 mutasyonları varlığında mı yol açmaktadır?; 2) TP53 indükleyicileri TP53 hedef genlerini yabanıl ve mutant kanser hücre hatlarında eş seviyelerde mi indüklemektedir? Bu tezde aynı zamanda mevcut ve özgün metotları genlerin iki tedavi, örneğin tekli doxorubicin tedavisi ile CHRNA5 deplesyonu durumundaki doxorubicin tedavisi, etkisindeki sinerjistik veya antagonistik ilişkilerinin saptanabilmesi için kullandım. Çıkan sonuçlar MCF7 hücrelerinde yabanıl homozigot TP53 yüksek ifadesinin, heterozigot mutant (R175H, R273H mutasyonlarını içeren bir kopyalı) TP53'ün ifade edildiği koşula kıyasla DREAM hedef genlerini daha çok azalttığını göstermektedir. CHRNA5 deplesyonunun doxorubicin tedavisi ile kombinasyonunda TP53 hedef genlerinin daha çok etkilendiği de gösterilmiştir.
Metabolik disfonksiyon ilişkili yağlı karaciğer hastalığı (MASLD) için çok türlü scrna-seq atlasının geliştirilmesi
Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) affects a significant portion of the human population, potentially leading to severe secondary conditions. Despite extensive research on patients and animal models to understand the disease's initiation and progression, and the development of various therapeutic strategies, current non-invasive techniques remain inefficient, and only one drug has been approved. This underscores the critical need to elucidate the cellular mechanisms driving MASLD to develop new diagnostic and therapeutic approaches. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) enables the investigation of transcriptomic profiles at the cellular level. Various studies have utilized scRNA-seq to explore MASLD in patient samples and animal models. Although there are numerous publicly available scRNA-seq datasets from these studies, no comprehensive tool exists to explore and analyse them collectively. In this study, publicly available scRNA-seq datasets related to MASLD were collected and reanalysed, adhering to best practices suggested in the literature, and a web tool was developed for their visualisation and custom downstream analyses. Thirteen datasets obtained from the livers of human MASLD spectrum patients, and three datasets different animal models, two mouse and one zebrafish, were uniformly preprocessed. The two human datasets containing cirrhotic samples and two fibrotic datasets, one from mouse and another from zebrafish models, were integrated to reveal the conserved mechanisms of liver fibrosis among human patients and animal models. A web tool was developed in R Shiny to enable visualizations, cell cluster selection, differential expression analysis and gene set enrichment of genes and gene sets. The utility of the app was demonstrated by conducting a case study with the integrated dataset. The results included an endothelial cluster that had cells from each of the four datasets, and differential gene expression analysis on the integrated dataset provided significantly modulated known, e.g., SYNPO and TIMD4 liver fibrosis-associated genes across the three species. As a result, the custom analysis workflow provided in this thesis can allow the detection of conserved markers in different MASDL stages by further analysing this and other integrated datasets in the future.
Antiapoptotik protein inhibitörü yüklü nanopartiküllerin kanser hücreleri üzerindeki etkileri
Apoptozdan kaçınma, kanser hücrelerinin ayırt edici bir özelliğidir. Miyeloid lösemi hücre farklılaşma proteini (MCL-1), hücresel apoptozu düzenleyen B-hücreli lenfoma 2 (BCL-2) ailesinin anti-apoptotik bir proteinidir. MCL-1 ekspresyonu, kanser hücrelerinin hayatta kalmasında anahtar bir rol oynamaktadır ve bu nedenle kanser tedavisinde umut verici bir hedeftir. MCL-1 ve diğer antiapoptotik BCL-2 proteinlerinin korunmuş BH3 domenlerini hedef alan BH3 mimetik peptidler oldukça spesifik MCL-1 inhibitörleridir. Ancak peptidlerin, metabolik olarak kararsızlıkları, hücresel proteazlara bağlı bozunmaları, hücresel zarlardan geçişlerinin zor olması gibi nedenlerle kullanımları sınırlıdır. Bu çalışmada, antiapoptotik protein MCL-1'in seçici inhibitörü MS1 peptidinin hücresel alımının ve stabilitesinin artırılması hedeflenmiş ve bu doğrultuda, nanobiyoteknolojik yöntemler kullanılarak MS1 peptidini içeren nanoyapılar oluşturulmuş ve bu yapıların kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik ve apoptotik etkileri araştırılmıştır. Bu kapsamda, Bim BH3 mimetiği MS1 peptidi, mNeonGreen floresan proteini ve polihistidin ile füzyona uğratılmış şekilde rekombinant olarak üretilmiştir. Bu rekombinant protein kullanılarak iki nanopartiküler sistem hazırlanmıştır. Birincisi, rekombinant protein temelli kendiliğinden kurulan (self-assembly) nanopartiküler sistemlerdir. İkincisi ise bu füzyon proteinin enkapsüle edildiği polimerik nanopartiküller sistemlerdir. Nanopartiküllerin serviks kanseri (HeLa), akciğer kanseri (A549) ve meme kanseri (MDA-MB-231) hücre hatları ile sağlıklı hücre hattı (HUVEC) üzerindeki sitotoksik etkileri MTT testi ile analiz edilmiştir. Ayrıca, nanopartiküllerin apoptotik etkileri, uygulandıkları hücrelerdeki antiapoptotik ve apoptotik proteinlerin ekspresyon seviyeleri RT-PCR ve Western blotlama ile belirlenerek incelenmiştir. Sonuç olarak, kanser hücrelerine karşı spesifik olarak sitotoksik etki gösteren ve bu hücrelerde apoptozu indüklediği ortaya koyulan hedefli ilaç adayı yeni nanopartiküller geliştirilmiştir. Elde edilen veriler gelecekte, terapotik peptidlerin klinik uygulamalarda başarısını artırabilecek biyoteknolojik ilaç formülasyonlarının geliştirilmesine katkıda bulunabilir.