Theses supervised by Prof. Dr. Hüseyin Basım
10 theses · Akdeniz University
Domates bakteriyel kanser etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ve domates bakteriyel yaprak lekesi etmeni Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria' nın LNA probe'a dayalı real time PCR ile tanısı ve saptanması
Bu çalışmada, Domates Bakteriyel Solgunluk ve Kanser hastalık etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) ve Domates ve Biber Bakteriyel Yaprak Lekesi hastalık etmeni Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav)' nin Real-Time PCR ile tanısı ve Real-Time Bio-PCR ile tohumdan ve hastalıklı bitki dokulardan tespitini gerçekleştirmek için hassas ve seçici bir Real-Time PCR yöntemi geliştirilmiştir.Geliştirilen Real-Time PCR yöntemine uygun yeni primer ve probe setinin hassasiyeti farklı Cmm ve Xav strainlerine, farklı cins ve türe ait bitki patojeni bakterilere ve domates ve biber genomik DNA' sına karşı test edilmiştir. 73 bp' lik PCR ürünü tüm Cmm strainlerinden, 69 bp'lik PCR ürünü ise tüm Xav strainlerinden çoğaltılabilirken, Cmm ve Xav olmayan diğer bakteri strainlerinden ve domates ile biber genomik DNA' sından çoğaltılamamıştır. Geliştirilen TaqMan Real-Time PCR yönteminin Cmm ve Xav için direkt bakteriyel süspansiyondan tespitindeki hassasiyet limitleri sırası ile 1 cfu/ml ve 2 cfu/ml , saf genomik DNA' dan ise her iki patojen için 10 pg olarak bulunmuştur. Real-Time PCR yönteminin Cmm ve Xav' nin tohumdan tespitindeki hassasiyet limitleri ise sırası ile 1 cfu/ml ve 2 cfu/ml olarak bulunmuştur. Cmm ve Xav' nin içsel dizi kontrolünün sağlanması için LNA probu kullanılarak geliştirilen bu Real-Time PCR yöntemi seçici hassas ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu yöntem Cmm ve Xav' nin hastalıklı bitki dokularından ve tohumlardan hızlı ve hassas bir şekilde tanısında ve tespitinde yaygın olarak kullanılabilecektir.ANAHTAR KELİMELER: Domates, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Xav), RealTime PCR (RT-PCR), Real-Time Bio-PCR, Tespit, Tanı
Akdeniz bölgesi' nde örtüaltı domates üretiminde kullanılan yaygın domates çeşitlerinin domates bakteriyel solgunluk ve kanser hastalık etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis' e karşı dayanıklılık reaksiyonlarının belirlenmesi
Bu çalışmada, Akdeniz Bölgesi' nde örtü altında yaygın olarak yetiştirilen bazı domates çeşitlerinin bakteriyel Solgunluk ve Kanser hastalık etmeni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis' e karşı dayanıklılık reaksiyonları belirlenmiştir. Araştırmada bitki materyali olarak Antalya İlindeki ticari domates fidesi üreten firmalardan temin edilen 93 farklı yerli domates çeşidine ait fideler kullanılmıştır. Fideler geliştirme odasında 18 saat ışıklanma süresi ile 8 hafta süresince gündüz sıcaklığı 25 0C, gece sıcaklığı ise 18 0C sıcaklıkta geliştirilmiştir. İnokulasyona hazır hale gelen bitkilere, Antalya' nın Aksu ilçesinden izole edilen Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 10 straini (1x108 cfu/ml) petiol kesilerek insulin iğnesi ile inokule edilmiştir. Bitkiler, hastalığın düzgün seyri için geliştirme odalarına (Bitki Koruma Bölümü Kontrollü İklim Odaları) aktarılarak gündüz-gece sıcaklığı 26/18 0C' de gelişmeye bırakılmıştır. Hastalık şiddetinin belirlenmesinde Bakteriyel Solgunluk ve Kanser Hastalık etmeninin tipik simptomu olan solgunluk ölçüt alınmıştır. Hastalığa ait simptomlar 17. günden itibaren gözlenmeye başlanmıştır. Yapılan çalışmada hastalığın bitki çeşitlerindeki seyri inokulasyon sonrası 28' inci günde yapılan kontrolle 1-5 skalasına göre analizi yapılmıştır. Elde edilen veriler 1-5 skalasına göre değerlendirilmiştir. Çeşitlerin tamamında büyüme ucu öldüğü için değerlendirme skalasında 1. skala değerinde yer almıştır. Araştırma sonucuna göre test edilen 93 farklı domates çeşidinin tamamının Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis' e karşı dayanıksız olduğu tespit edilmiştir.
Ateş yanıklığı hastalık etmeni Erwinia amylovora' nın LNA probe kullanılarak kantitatif real-time PCR ile tanısı ve tespiti
Yumuşak çekirdekli meyve ağaçlarında önemli kayıplara neden olan Ateş Yanıklığı Hastalık etmeni Erwinia amylovora' nın LNA prob kullanılarak Kantitatif Real-Time PCR ile hassas ve kısa sürede tanısı ve tespiti yapılmıştır. Bakteriyel patojen, Erwinia amylovora' nın Real-Time PCR yöntemiyle tanısı için, patojenik bakterinin polisakkarit üretiminden sorumlu ve kromozomal ams gen' inin 1,6 kb' lik internal diziliminden prob ve primerler dizayn edilmiştir. Geliştirilen prob ve primerler ile Erwinia amylovora genomundan, planlandığı gibi 63 bp' lik PCR ürünü çoğaltılmıştır. Prob ve primerlerin spesifikliğinin belirlenmesi amacıyla farklı Erwinia amylovora strainleri ve farklı türlere ait bakteriyel izolatlar kullanılmıştır. Farklı bitki patojeni bakterilerin genomlarından hiçbir amplifikasyon tespit edilememesine rağmen, test edilen tüm yerli ve yabancı farklı Erwinia amylovora strainlerinden 63 bp' lik amplifikasyon elde edilmiştir. Geliştirilen primer ve probun hassasiyet limiti direkt bakteriyel süspansiyondan 6 cfu/2 ? , genomik DNA' dan 10 pg olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada geliştirilen prob ve primer kullanılarak gerçekleştirilen Kantitatif Real-Time PCR metoduyla, hastalıklı ve sağlıklı yaprak, sürgün ve çiçeği içeren bitki materyallerinden E. amylovora' nın tespiti yapılarak, hastalık etmeninin çiçeklenme döneminden üretim sezonunun sonuna kadar epifitik populasyonlarının değişimlerinin tespit edilmesine olanak sağlanmıştır.
Domates (Solanum lycopersicum L.) bakteriyel öz nekrozu hastalık etmenleri Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea ve Pseudomonas viridiflava'nın lna probe kullanılarak real-tıme pcr ile tanısı ve hastalıklı bitki dokularından tespiti
Bu çalışmada domates yetiştiriciliğinde önemli kalite ve ekonomik ürün kayıplarına sebep olan domates öz nekrozu hastalık etmenleri Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea ve Pseudomonas viridiflava'nın LNA (Locked Nucleic Acid) probu kullanılarak Real-Time PCR yöntemi ile hassas ve seçici olarak tanıları ve tespitleri yapılmıştır. Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea ve Pseudomonas viridiflava etmenlerin her birine özel hassas primer ve prob setleri geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob setlerinin spesifikliğinin belirlenmesi amacıyla farklı Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea, Pseudomonas viridiflava strainleri ve farklı bitki patojeni bakteriyel izolatlar kullanılmıştır. Farklı bitki patojeni bakterilerin genomlarından hiçbir amplifikasyon tespit edilmemesine rağmen, test edilen tüm yerli ve yabancı Dickeya chrysanthemi strainlerinden 65 bp, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum strainlerinden 63 bp, Pseudomonas cichorii strainlerinden 73 bp, Pseudomonas corrugata strainlerinden 70 bp, Pseudomonas fluorescens strainlerinden 70 bp, Pseudomonas mediterranea strainlerinden 73 bp ve Pseudomonas viridiflava strainlerinden 77 bp'lik amplifikasyonlar elde edilmiştir. Bu çalışmada geliştirilen yöntemin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı Dickeya chrysanthemi için 2 hücre, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum için 4 hücre, Pseudomonas cichorii için 4 hücre, Pseudomonas corrugata için 4 hücre, Pseudomonas fluorescens için 5 hücre, Pseudomonas mediterranea için 5 hücre, Pseudomonas viridiflava için 2 hücre olarak tespit edilmiştir. Geliştirilen yöntemin DNA düzeyindeki hasasiyet sınırı ise Dickeya chrysanthemi için 12 pg, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum için 11 pg, Pseudomonas cichorii için 14 pg, Pseudomonas corrugata için 14 pg, Pseudomonas fluorescens için 14 pg, Pseudomonas mediterranea için 13 pg, Pseudomonas viridiflava için 12 pg olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak, Real-Time PCR yöntemini kullanarak her birine özel primer ve prob setleri geliştirilen domates bakteriyel öz nekrozu hastalığına sebep olan 7 farklı bakteriyel patojen; Dickeya chrysanthemi, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mediterranea ve Pseudomonas viridiflava'nın hem bakteriyel hücreden hem de hastalıklı bitki dokularından hızlı (17-27 dk) ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği ortaya çıkarılmıştır.
Asmada (Vitis vinifera) taç gali hastalık etmeni Rhizobium vitis'in LNA probe kullanılarak real-tıme PCR ile tanısı ve tespiti
Bu çalışmada, asmada (Vitis vinifera) önemli kayıplara neden olan Taç Gali hastalık etmeni Rhizobium vitis'in LNA (Locked Nucleic Acid) prob kullanılarak hem direkt bakteri hücresinden hem de hastalıklı bitki dokularından Real-Time PCR yöntemi ile hassas ve seçici olarak tanısı ve tespiti gerçekleştirilebilmiştir. Oktopin katabolize eden ve Rhizobium vitis strainlerine ait ocs (oktopin sentaz) geninin 475 bç'lik kısmı, nopalin katabolize eden nos (nopalin sentaz) geninin 394 bç'lik kısmı klasik PCR ile çoğaltılmış, PCR ürünlerinin dizi analizi gerçekleştirilerek Real-Time PCR için primer ve prob setleri geliştirilmiştir. Vitopin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerine spesifik primer ve prob setleri ise, vis (vitopin sentaz), vitopin iaaM (indol asetik sentaz) ve vitopin virD2 genlerine ait gen bankasındaki diziler kullanılarak geliştirilmiştir. Geliştirilen primer setleri ve probların spesifikliği, farklı Rhizobium vitis strainleri, farklı bitki patojeni bakteriler, asma genomik DNA'sı, baz materyal ve tümör dokularından hazırlanan süspansiyonlar kullanılarak test edilmiştir. Oktopin ve nopalin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerinde sırasıyla, 62 ve 78 baz çifti uzunluğunda DNA fragmentleri çoğaltılabilmesine rağmen, farklı bitki patojeni bakterilerde ve asma genomik DNA'sında hiçbir amplifikasyon meydana gelmemiştir. Oktopin ve nopalin katabolize eden Rhizobium vitis strainlerinin tanıları ve tespitleri, bu çalışmada geliştirilen primer ve prob setleri kullanılarak Real-Time PCR yöntemi ile 20-25 dakikada gerçekleştirilebilmiştir. Oktopin ve nopalin straini için geliştirilen Real-Time PCR yönteminin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı 1 bakteri hücresi olarak belirlenmiştir. Oktopin ve nopalin strainleri için DNA düzeyindeki hassasiyet sınırı ise 10 pg olarak tespit edilmiştir. Rhizobium vitis'in enfekteli asma baz materyalinden elde edilen bitki özsuyundan ve tümör dokularından hazırlanan süspansiyonlardan tanı ve tespiti gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak, Taç Gali hastalık etmeni, Rhizobium vitis'in oktopin, nopalin ve vitopin katabolize eden strainlerinin her birine özel geliştirilen primer ve prob setleri ve Real-Time PCR yöntemi kullanılarak hem direkt bakteriyel hücreden, hem asma bitki özsuyundan, hem de asma ve domates tümör dokularından hızlı ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği ortaya çıkarılmıştır.
Marul bakterı̇yel yaprak lekesı̇ hastalık etmenı̇ X. hortorum pv. vitians'a karşı bazı marul çeşı̇tlerı̇nı̇n dayanıklılıklarının ve hastalık etmenı̇nı̇n bakıra duyarlılığının araştırılması
Bakteriyel Yaprak Lekesi (BYL), X. hortorum pv. vitians'ın neden olan ve marul yetiştiriciliğinde önemli ürün kayıplarına yol açan önemli marul hastalıklarından biridir. Bu çalışmanın ilk bölümünde Carmesi RZ Lolo, Batraz, Melina, Cospirina, Presidential, Nun 06118, Boratal ve Green Moon olmak üzere sekiz marul çeşidinin X. hortorum pv. vitians'ın en virulent straina (HBXcv1 straini) karşı reaksiyonları, el püskürtücü ve iğneli şırınga ile inokulasyon olmak üzere iki farklı inokulasyon yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Püskürtme yöntemi kullanılarak gerçekleştirilen bakteriyel inokulasyonlardan on gün sonra marul bitkilerinde ortaya çıkan simptomlar değerlendirilmiştir. Carmesi RZ Lolo %5 önem düzeyinde 0.25'lik Duncan Mutiple Range Test (DMRT) ortalamasıyla en tolerant çeşit olurken, Cospirina %5 önem düzeyinde 216.55'lık en yüksek duyarlılık ortalamasını kaydetmiştir. İğneli şırınga kullanılarak yapılan bakteriyel inokülasyonlar sonucu marullarda püskürtme inokulasyonları sonucu elde edilen sonuçlara benzer reaksiyonlar kaydedilmiştir. Carmesi RZ Lolo, HBXcv1' strainın etkisine karşı en tolerant marul çeşidi olup inokulasyondan 10 gün sonra marul yapraklarında hiçbir simptomatik belirti tespit edilmemiştir. Öte yandan, Cospirina, Nun 06118 ve Presidential marul çeşitleri HBXcv1 straina karşı hassas çeşitler olarak belirlenmiştir. Tezinin ikinci bölümünde, HBXcv1 strainin farklı bakır sülfat konsantrasyonlarına karşı duyarlılık düzeyi Nutrient Agar ve Casitone Yeast Extract Agar kullanılarak araştırılmıştır. Bu çalışmada HBXcv1 strain, 50ppm CuSO4' a karşı dayanıklı, 100ppm ve 200ppm'e karşı ise hassas bulunmuştur. Bu bulgular, marul çeşitlerinin BYL'ye tepkilerinin anlaşılmasına ve X. hortorum pv. vitians enfeksiyonlarının kimyasal mücadeledesinde bakır içerikli karışımların etkili olabileceği ortaya çıkarmıştır.
Kantitatif real-time PCR ile karpuz bakteriyel meyve leke hastalık etmeni Acidovorax citrulli (Schaad vd. 2008)'nin tanısı, tespiti ve karpuz ve kavun çeşitlerinin hastalık etmenine karşı duyarlılık reaksiyonlarının araştırılması
Bu çalışmada, Karpuz Bakteriyel Meyve Leke hastalık etmeni Acidovorax citrulli (Acidovorax avenae subsp. citrulli)' nin Real-Time PCR ile hassas tanısı ve bitki dokularından tespiti için primer ve prob setleri geliştirilmiştir. Karpuz ve kavun çeşitlerinin hastalığa karşı duyarlılık reaksiyonları araştırılmıştır. Acidovorax citrulli'nin Real-Time PCR ile tanısı ve tespiti için hrpB2 gen dizisini ve ITS (Internally Transcribed Spacer) bölgesini kullanarak her iki bölgeye özel primer dizayn edilmiştir. 8 bazdan oluşan LNA (Locked Nucleic Acid) probe geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob setlerinin spesifikliği; farklı Acidovorax citrulli strainleri, farklı bitki patojeni bakteriler ve karpuz genomik DNA'sı kullanılarak test edilmiştir. Test edilen tüm yerli ve yabancı Acidovorax citrulli izolatlarında her iki primer-prob seti 88 bp'lik amplifikasyon gerçekleşirken, farklı bitki patojeni bakterilerde ve karpuz genomik DNA'sında hiçbir amplifikasyon tespit edilmemiştir. Bu çalışmada bakteriyel hücre hassasiyet sınırı 2 bakteriyel hücre ve DNA düzeyindeki hassasiyet sınırı ise 12 fg'dır. Hastalığa etki eden bakteri popülasyonlarının sayısını belirlemek için Kantitatif Real-Time PCR ve hastalıklı bitki materyali üzerinde yaşayan bakterilerin saptanması için Bio-PCR gerçekleştirilmiştir. Kantitatif Real-Time PCR sonucunda her iki primerprob seti için standart eğri elde edilmiştir. Kantitatif Real-Time PCR yönteminde kullanılan hrpB2 ve ITS primer-prob setlerinin etkinlikleri sırasıyla % 97.941 ve % 98.215 oranlarında yüksek güvenirlikte bulunmuştur. Bu çalışmada geliştirilen Real- Time PCR metotları bakteriyel patojenin varlığı açısından karpuz ve kavun tohumlarının taranmasına yardımcı olabilecektir. Ayrıca bu metot bakteriyel patojenin direkt hastalıklı bitki materyalinden ve direkt bakteriyel hücreden tanı ve tespitine yardımcı olabilecektir. Bu güvenilir, hassas ve tekrarlanabilir gerçek zamanlı PCR yöntemi, potansiyel inokulum kaynaklarının kontrol edilmesine ve alandaki bakteriyel patojenlerin yayılmasının önlenmesine yardımcı olabilecektir. Karpuz ve kavun çeşitlerinin Acidovorax citrulli'ye karşı duyarlılık reaksiyonları, dokuz farklı ölçeklendirmeye göre değerlendirilmiştir. Test edilen bitkilerin duyarlılık reaksiyonları istatistiki olarak anlamlı bulunmamıştır.
Domates bitkilerine potasyum mono-fosfat, potasyum silikat ve kitosan uygulamalarının, domates bakteriyel solgunluk ve kanser hastalığına karşı dayanıklılıklarının arttırılmasındaki etkilerinin araştırılması
Bu çalışma ile Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis'in sebep olduğu Domates Bakteriyel Solgunluk ve Kanser Hastalığına karşı dayanıklılığın arttırılmasında tarım ilaçlarına alternatif uyarıcılardan potasyum mono-fosfat (PMF) (10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM ve 30 mM), potasyum silikat (Psi) (2, 4, 6, 8 ,10 mL-1 ) ve kitosan (Ki) (0.05 mM, 0.10 mM, 0.15 mM, 0.20 mM ve 0.25 mM' ın farklı dozlarının etkileri araştırılmıştır. "Ömür" domates çeşidi üzerine uygulanan farklı PMP, PSi ve Ki'nin farklı konsantrasyonlarının dayanıklılığı arttırmadaki etkileri Peroksidaz (POK) Katalaz (KAT) Aktivitesi Tayini, Toplam Protein Tayini, Azot oranı (%N), Toplam Çözünür Şekerlerin Tayini, Yaprak Klorofili ve Karotenoidlerin Tahmini, Askorbik Asit Tayini (C Vitamini), Yaprak Prolinin Belirlenmesi, Yaprak Membran Stabilite İndeksi (MSI) (%) Tayini ve Göreceli Su İçeriğinin (GSİ%) Belirlenmesi testleriyle belirlenmiştir. PMF10 (10 mM) uygulamasında dayanıklılık en yüksek düzeyde sağlanmış ve hastalık oranı %41.4 olarak tespit edilen kontrol bitkileriyle karşılaştırıldığında hastalık oranı %0.7 olarak belirlenmiştir. PMF10 (10 mM) uygulamasında, peroksidaz, katalaz aktivitesi ve membran stabilite indeksi değerlerinin kontrolle karşılaştırıldığında sırasıyla %76.44'ten %85.92'ye, 4.2 mg-1 protein-1 'den 6.2 mg-1'ye ve 4.0 mg-1 protein-1 'den 6.2 mg-1 protein-1'ne kadar artış göstererek bitkinin direncinin artaması, hastalık oranının azalmasını açıklayabilir. PMF30 ve Psi2 uygulamalarında toplam klorofil oranı yüksek değer sahip olup kontrol bitkileriyle karşılaştrıldığında 8.48 mg/gFW'den 9.70 mg/gFW'ye kadar bir arış göstermiştir, Psi2 uygulamasında ise karotnoid oranının kontrol bitkileriyle karşılaştrıldığında 2.40mg/gFW'den 2.8mg/gFW'ye kadar artış gösterdiği kaydedilmiştir. Ki0.05 uygulamasında toplam erimiş şeker oranı en yüksek değer olup kontrol bitkileriyle karşılaştırıldığında 31.4 mg/g'dan 114.8 mg/g'a kadar artış göstermiştir. PMF10 uygulamasında domates bitkilerin yapraklarında C vitaminin oranı en yüksek değer olarak tespit edilmiş ve kontrol bitkileriyle karşolaştrıldığında 13,9'dan 23,0'a kadar artış gösterdiği tespit edilmiştir. En yüksek azot oranı PSi10 uygulamasında tespit edildi ve kontrol bitkileriyle karşılaştrıldığında bitkilerdeki azot oranı %3,64'den %5,39'e kadar artış göstermiştir. En yüksek protein oranı ise PSi10 uygulamasında elde edildi ve kontrol bitkileriyle karşılaştrıldığında protein oranının %22,77'den %33,6'ye kadar yükseldiği tespit edilmiştir.
Zeytin (Olea europaea L.) dal kanseri hastalık etmeni Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'nin kantitatif real-time membran bio-PCR ile tanısı ve epifitik popülasyonun tespiti
Bu çalışmada zeytin yetiştiriciliğinde ekonomik açıdan önemli kalite ve ürün kayıplarına neden olan Zeytin Dal Kanseri hastalık etmeni Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'ye özel dizayn edilen primer seti ve LNA (Locked Nucleic Acid) prob kullanılarak geliştirilen hassas ve seçici Real-Time PCR yöntemi ile tanıları ve tespitleri yapılmıştır. Real-Time PCR yöntemi için Indoleacetate-lysine ligase (iaaL) gen dizisi kullanılarak Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'ye özel primer seti ve prob geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob setlerinin spesifikliğinin belirlenmesi amacıyla Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatları ve farklı bitki patojeni bakteriyel izolatlar ve zeytin DNA'sı test edilmiştir. Test edilen tüm yerli ve yabancı Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi izolatlarında 69 bp'lik amplifikasyon gerçekleşirken, farklı bitki patojeni bakterilerin genomlarında ve zeytin genomik DNA'sında hiçbir amplifikasyon tespit edilmemiştir. Bu çalışmada geliştirilen yöntemin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı 2 hücre ve DNA düzeyindeki hasasiyet sınırı ise 11.8 pg olarak tespit edilmiştir. Epifitik populasyon içerisindeki sadece canlı Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'leri tespit etmek ve değişimleri kantitatif olarak belirlemek amacıyla Kantitatif Real-Time Membran Bio-PCR yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntem ile Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'nin zeytin ağaçları üzerindeki epifitik popülasyon oranı tespit edilebilmiştir. Yöntemin, farklı bölgelerde veya aynı bölgede farklı zamanlarda uygulanmasıyla epifitik popülasyonlarının değişim oranlarının tespit edilebilmesine olanak sağlamıştır. Sonuç olarak, Kantitatif Real-Time Membran Bio-PCR yöntemini kullanarak Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi'nin hem bakteriyel hücreden hem de hastalıklı bitki dokularından hızlı (24 dk) ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği, epifitik popülasyonun ve bu popülasyonun içierisindeki sadece canlı bakterilerin kantitatif olarak tespit edilebileceği ortaya konulmuştur.
Kasava (Manihot esculenta C.) bakteriyel yanıklık hastalık etmeni Xanthomonas axonopodis pv. manihotis' in real-tıme pcr ile tanısı, tespiti ve pulsed-fıeld jel elektroforezis ile moleküler karakterizasyonunun yapılması
Kasava (Manihot escualanta Crantz) Gana' da önemli bir kültür bitkisidir. Bu çalışmada, Gana'nın 8 farklı bölgesinden toplanan, Kasava Yanıklık Hastalığı simptomları gösteren örnekler izole edilmiş ve besi ortamında- Nütrient Agar (NA, Acumedia, USA) ve X. axonopodis pv. manihotis (Xam) yarı seçici ortam, Cefazolin Trehalose Agar (CTA) üzerinde geliştirilmiştir. İzolatların duyarlı kasava Esam çeşidindeki patojenisite test sonucunda, izolatların (toplam 32 adet) hepsi Xam simptomları göstermiş ve inoküle edilen kasava bitkilerinden izole edilerek Koch postulatları tamamlanmıştır. Klasik PCR' da, Xanthomonas spesifik primer, RST2/RST3 ve Xam spesifik Değişken Numara Tandem Tekrarlama (VNTRs) lokus primeri, XaG1_67F/R, farklı bitki patojeni bakterilerin genomlarından hiçbir amplifikasyon tespit edilmemesine rağmen, test edilen tüm Gana ve referans Xam strainlerinden 840 ve 446 ba'lik amplifikasyonlar elde edilmiştir. Ortaya çıkan PCR ürünleri, GenBank nükleotit veri tabanından alınan Xam strainleri ile %93 ile %100 arasında homoloji gösterdiği BLASTn programı kullanılarak ortaya çıkarılmıştır. Kasava yetiştiriciliğinde önemli ürün kayıplarına sebep olan Kasava Bakteriyel Yanıklık etmeni Xam' in Real-Time PCR yöntemi ile kısa sürede, hassas bir şekilde tanısını yapmak amacıyla primer ve prob (LNA, Locked Nucleic Acid) setleri geliştirilmiştir. Geliştirilen primer ve prob setlerinin spesifikliği; farklı Xam strainleri, farklı bitki patojeni bakteriler ve kasava genomik DNA'sı kullanılarak test edilmiştir. Xam izolatların LNA probu kullanılarak Real-Time PCR yöntemi ile hassas ve seçici olarak tanıları ve tespitleri yapılmıştır. PCR analiz sonuçlarına göre, Kasava Bakteriyel Yanıklığı Hastalığın Ganadaki yaygınlığı en yüsek Ashanti (%70) bölgesinde olup, Volta (%60), Brong-Ahafo (%40), Eastern (%40) ve Greater Accra (%20) şekilde sıralamıştır. Bu çalışmada geliştirilen yöntemin bakteriyel hücre hassasiyet sınırı X. a. pv. manihotis 1 hücre olarak tespit edilmiştir. Geliştirilen yöntemin DNA düzeyindeki hassasiyet sınırı ise, 13 pg olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak, Real-Time PCR yöntemini kullanarak her birine özel primer ve prob setleri geliştirilen Kasava Bakteriyel Yanıklık Hastalığına sebep olan X. a pv. manihotis'nin hem bakteriyel hücreden hem de hastalıklı bitki dokularından hızlı (20-25 dk) ve hassas bir düzeyde tanı ve tespitlerinin yapılabileceği ortaya çıkarılmıştır. Pulsed-Field Jel Elektroforezis (PFGE) yöntemi ile Gana'da yaygın kasava üretimi yapılan beş farklı bölgeden izole edilen Xam izolatları arasındaki genotipik farklılıkları az sıklıkla kesen restriksiyon enzimleri kullanılarak ortaya çıkarılmıştır. Gana'dan toplanan 32 izolat arasındaki genetik farklılıklar PFGE tarafından SpeI enzimi kullanılarak belirlenmiştir. PFGE sonuçlarına göre tüm izolatların iki farklı haplotip oluşturmuştur.