Theses supervised by Prof. Dr. Tülin Aydemir
12 theses · Manisa Celal Bayar University
Farklı taşıyıcılar üzerine serine proteaz subtilisin carlsberg immobilizasyonu, karakterizasyonu, hidroliz ve transesterifikasyon reaksiyonlarındaki kinetik özelliklerinin incelenmesi
Subtilisin Carslberg (SC) Bacillus licheniformis'ten fermantasyonla elde edilen alkali serin endoproteaz ailesine ait bir enzim olup alkali koşullar altında doğal veya denatüre proteinleri hidroliz etmektedir. Subtilisin Carslberg disülfit bağı içermeyen tek bir polipeptid zincirinden oluşmaktadır. Ayrıca izolelektrik noktası 9,4 olup bazı organik çözücülerde aktivitesini sürdürebilmektedir. Proteolitik aktivitesinin yanında esteraz aktivitesine de sahiptir. Bu çalışmada Subtilisin Carlsberg iki farklı çapraz bağlayıcı: glutaraldehit ve genipin kullanılarak manyetik kitosan (MK), perlit ve β-siklodekstrin ile modifiye edilmiş perlit (Perlit-CD) üzerine immobilize edildi. İmmobilize Subtilisin Carlsberg in hidroliz aktivitesi ve kinetik özellikleri çalışıldı. Hazırlanan taşıyıcıların yapısı ve yüzey morfolojisi SEM, TGA ve EDX ile karakterize edildi. Serbest Subtilisin Carlsberg aktivitesinin optimum sıcaklık ve pH değeri sırasıyla 50oC ve pH 8,0 olarak belirlendi. Genipin ve glutaraldehit ile aktive edilmiş taşıyıcılar üzerine immobilize edilmiş Subtilisin Carlsberg in aktivitesi için optimum pH ve sıcaklıkta serbest enzime benzerlik gösterdi. Subtilisin Carlsberg in hidroliz aktivitesinin bir uygulaması olarak yapılan enzimatik kıl giderimi çalışmalarında enzimatik ve kimyasal yöntemle gerçekleştirilen kıl giderimi çalışmaları karşılaştırıldı. Enzimatik kıl giderimi ile daha yumuşak ve pürüzsüz bir deri yüzeyi elde edildi. Subtilisin Carlsberg in organik çözücü ortamındaki transesterifkasyon aktivitesi ve kinetik özellikleri araştırıldı Ayrıca liyofilizasyon ortamına metal iyonu ve tuz ilavesinin transesterifikasyon aktivitesi üzerine etkisi incelendi.
Horseradish peroxidase-inorganik hibrit nano yapıların (nanoflowers) hazırlanması, katalitik aktiviteleri ve stabilitelerinin incelenmesi
Enzimlerin devamlı olarak kullanılabilmesi için, aktivitelerinin, kararlılıklarının ve geri kazanımlarının arttırılması gerekmektedir. Serbest enzimlerin, reaksiyon ortamından ayrılmalarının ve tekrar kullanılmalarının zor olması gibi dezavantajlarından dolayı uygulamaları sınırlıdır. Tüm bu sınırlamaları gidermek için enzim immobilizasyonu, kullanılan pek çok yöntemden biri olmuştur. Bu çalışmada, yaban turbu peroksidaz (HRP) enzimi ile Cu2+, Ca2+ ve Mn2+ iyonları kullanılarak hibrit nanoçiçek yapıları sentezlendi. Sentezlenen hibrit nanoçiçekler glutaraldehit ile çapraz bağlandı ve tüm hibrit nanoçiçeklerin optimum pH, sıcaklık, boya gideriminde tekrar kullanılabilirlikleri, substrat spesifikllikleri ve enzim kaçış oranları belirlenerek kinetik parametreleri tayin edildi. Sentezlenen hibrit nanoçiçeklerin karakterizasyon çalışmalarında SEM, FTIR, XRD ve EDX analizleri yapıldı. SEM görüntüleri incelendiğinde; çiçek şekilli CuNF-HRP, CaNF-HRP ve MnNF-HRP hibrit nanoçiçek yapılarının oluştuğu gözlemlendi. Glutaraldehit ile çapraz bağlanan hibrit nanoçiçek yapıları incelendiğinde; normal hibrit nanoçiçek yapılarına göre boyutlarının küçüldüğü, gözeneklerinin sıkılaştığı tespit edildi. Sentezlenen hibrit nanoçiçek yapılarının immobilizasyon verimleri CuNF-HRP için %91, CaNF-HRP için %88 ve MnNF-HRP için %85 olarak bulundu. Yapılan optimizasyon çalışmalarında, serbest ve immobilize nanoçiçek yapılarının optimum sıcaklık değeri 40oC, optimum pH değeri ise 6,0 olarak bulundu. Serbest enzimin KM ve Vmax değerleri sırasıyla 25,16 mM ve 22,27 U/mL olarak saptandı. Hibrit nanoçiçek yapılarında ise CuNF-HRP için KM ve Vmax değerleri 30,53 mM ve 5,63 U/mg, CaNF-HRP için KM ve Vmax değerleri 34,24 mM ve 5.51 U/mg, MnNF-HRP için KM ve Vmax değerleri 31,83 mM ve 4,95 U/mg bulundu. Çalışmanın ikinci kısmında elde edilen hibrit nanoçiçek yapılarının katalitik performanslarını incelemek amacı ile boya giderimi ve fenolik bileşik oksidasyonu yapıldı. Boya giderim çalışmaları için Amarant, Tartrazin ve Kristal Viole model boyalar olarak kullanıldı. Fenol oksidasyonu için Katekol, Pirogallol, L-Tirozin, Fenol ve Gayakol fenolik bileşikleri kullanıldı. Sentezlenen immobilize enzimler %80-96 aralığında boya giderimi, %65-91 aralığında ise fenolik bileşik oksidasyonu sağladığı tespit edildi.
Selülaz enziminin immobilizasyonu, karakterizasyonu ve uygulamaları
Lignoselülozik biyokütle, monomerik şekerlerin selülotik enzimle hidrolizi ile üretiminde, potansiyel yenilenebilir kaynaklardır. Endoglukanaz, ekzoglukanaz ve β-glikozidaz enzim karışımlarından oluşan selülaz enzimi, bu enzimlerin sinerjik etkileriyle selülozu glikoza parçalar. Bu enzimler başta mantarlar olmak üzere çok çeşitli mikroorganizmalar ile üretilebilmektedir. Bu çalışmada Trichoderma reesei ATCC 26921'den saflaştırılan ticari selülaz, iki farklı çapraz bağlama maddesi: glutaraldehit ve genipin kullanılarak sentezlenen kitosan ve manyetik kitosan boncukları üzerine immobilize edildi. İmmobilize selülazın fiziksel, kimyasal ve biyokimyasal özellikleri ve bunun lignoselülozik biyokütle sakkarifikasyonunda kullanımı kapsamlı bir şekilde araştırıldı. Sentezlenen kompozit boncukların yapısı ve morfolojisi SEM, TGA, FTIR ve VSM analizleriyle karakterize edildi. Serbest ve immobilize selülazın optimum sıcaklık ve pH değeri sırasıyla 50oC ve pH 5.0 olarak bulundu. Genipin ve glutaraldehit ile aktive edilmiş kompozit boncuklar üzerine immobilize edilmiş selülazın pH ve sıcaklıktaki değişikliklere karşı daha yüksek tolerans gösterdiği gözlendi. Aynı zamanda kompozit boncuklar üzerine immobilize edilen selülaz, serbest selülaza göre daha iyi depolama stabilitesi gösterdi. Optimizasyon çalışmalarında en yüksek aktivitenin gözlendiği optimum konsantrasyon genipin ve glutaraldehit için sırasıyla % 0.6 (w/v) ve % 4 (v/v) olarak belirlendi. Yüzde geri kazanılan enzim aktivitesi, genipin ve glutaraldehit ile aktive edilmiş manyetik kitosan boncuklar için sırasıyla % 82 ve % 76 olarak bulundu. İmmobilize enzimlerin katalitik performansınn tahlil edilmesi için yapılan sakkarifikasyon çalışmasında genipin ve glutaraldehit ile aktive edilen boncukların 5 kullanımdan sonra aktivitesi sırasıyla % 78 ve %74 olarak belirlendi ve taşıyıcı morfolojisi değişmediği gözlendi. Sakkarifikasyon işlemi sonrası yapılan hesaplamalar neticesinde mısır yapraklarının, enginar yapraklarının ve çam ağacı kabuklarının sakkarifikasyon oranının sırasıyla % 92, % 79, % 68 olduğu belirlendi. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar enzim immobilizasyonunda çapraz bağlayıcı olarak çok sık kullanılan glutaraldehit yerine alternatif bir çapraz bağlanma eko-dostu olarak genipinin kullanılabileceğini desteklemekte ve her iki immobilize enzimin sakkarifikasyon işleminde kullanılabilirliğini göstermektedir.
Modifiye kitosan türevlerinde immobilize edilen lakkaz ile boya gideriminin incelenmesi
Sentetik boyalar yaygın olarak tekstil, kâğıt, kozmetik, deri boyama, renkli fotoğraf, ilaç ve gıda endüstrisinde renk verici maddeler olarak kullanılmaktadır. Sentetik boyaların doğal boyalar ile karşılaştırıldığında ışığa ve sıcaklığa karşı yüksek stabilite göstermesi, sentezinin kolay olması ve uygun maliyet sağlaması gibi özelliklerinden dolayı boya ve tekstil sanayinde kullanımı önemli ölçüde artmıştır. Bu boyaların toksik, mutajenik ve kanserojen etkileri olduğu bilinmektedir. Bunun yanı sıra sentetik boyalar ciddi çevre kirliliğine neden olmaktadır. Atık sulardan boya giderimi için pek çok fiziksel ve / veya kimyasal yöntemler bulunmaktadır, fakat piyasadaki mevcut yöntemlerin çoğunun pahalı olması bu yöntemlerin uygulamasını kısıtlar. Ayrıca bu yöntemlerde aşırı kimyasal kullanımı ikincil bir çevre kirliliği problemine neden olmaktadır. Bu nedenle araştırmacılar, daha ekonomik ve etkili yollar incelemektir ve bu yöntemlere alternatif olarak enzimatik boya giderimi uygulamaları son yıllarda büyük ilgi görmüştür. Enzimlerin aktivitesinin, kararlılığının ve seçiciliğinin arttırılması için, genellikle enzimin katı bir destek üzerine immobilizasyonu çalışmalarına yoğunlaşılmıştır. Lakkaz enziminin hem spesifikliğinin yüksek olması hem de geniş bir substrat aralığına sahip olması boya ve fenol giderimi, ağartma gibi biyoteknolojik uygulamalarda biyokatalizör olarak kullanımına yol açmıştır. Bu çalışmada, üç sentetik tekstil boyası, Metil Kırmızısı (MR), Metilen Mavisi (MB) ve Kristal Viyole (CV) `nin immobilize lakkaz ile tekstil boyası içeren sulu çözeltilerden giderimi incelendi. MWCNT-kitosan kompozit lakkaz (benzendiol: oksijen oksidoredüktaz, EC 1.10.3.2) immobilizasyonu için taşıyıcı olarak kullanılmıştır. Serbest enzim ve MWCNT-CS boncuk üzerine immobilize edilen lakkazın karakterizasyon ve optimizasyon çalışmaları sonucunda, serbest lakkaz için optimum pH 4.0, immobilize lakkaz için optimum pH 5.0 ve sıcaklık 40 °C olarak saptandı. Depolama çalışmalarında ise serbest lakkaz ve immobilize lakkaz enzimleri 4°C ve 25 °C? de depolanarak belirli aralıklarla aktiviteleri ölçüldü. Depolama çalışmaları sonucu immobilize lakkazın serbest lakkaza göre 4°C ve 25°C? de daha kararlı olduğu saptandı. Etkili bir boya giderimi için pH, sıcaklık, süre, başlangıç boya konsantrasyonu, boncuk miktarı gibi farklı parametrelerde enzimatik boya giderimi incelendi. Boya giderimi çalışmalarında optimum pH MR boyası için pH 6.0, MB boyası için pH 5.0 ve CV boyası için pH 4.0 olarak belirlendi. Yüzde boya giderimi 120 dakika sonunda MR boyası için %64.2, MB boyası için %72.3 ve CV boyası için %40.2 olarak bulundu. Optimum deney koşulları altında 35 °C? de 130 rpm? de 24 saat inkübasyon sonucu toksik azo boyası MR için % 96.9, bazik boya MB için % 93.1 ve katyonik bazik boya CV için %79.5 giderim gerçekleşti.
Modifiye kitosan kompozitleri üzerinde lakkaz immobilizasyonu, karakterizasyonu ve immobilize enzim ile tekstil boyalarının giderim kinetiğinin incelenmesi
Reaktif boyalar; tekstil endüstrisinde parlak renkleri, mükemmel sabitlik dereceleri ve kolay uygulanabilirlikleri nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda, atıksulardan boyar madde gideriminde biyolojik olarak arıtılmasına ilişkin araştırmalar artmıştır. Bu çalışmada kitosan (Kit), indirgenmiş grafen oksit (RGO), manyetit (Fe3O4), glutaraldehit ile modifiye edilerek Kit-RGO ve Kit-RGO-Fe3O4 boncukları elde edildi. Kitosan kompozit boncukların IR, SEM, XRD, TGA ve VSM cihazları kullanılarak karakterizasyon çalışmaları yapıldı. Trametes versicolor (EC 1.10.3.2.) lakkaz enzimi kitosan kompozit boncuklar üzerine immobilize edildi ve immobilizasyonunda en iyi aktivite gösterdikleri koşullar belirlenerek kinetik parametreleri bulundu. İmmobilize lakkaz örneklerinin termal kararlılıkları, depolama kararlılıkları, inhibitör etkisi ve organik solventlere karşı stabilitesi araştırıldı ve sentetik tekstil boyası olan Reaktif Mavi 21 (RM 21)' i içeren sulu çözeltiden giderimi incelendi. İmmobilizasyon verimleri ve gram taşıyıcı başına elde edilen enzim aktiviteleri, taşıyıcı olarak Kit-RGO kullanıldığında sırasıyla % 55.29 ve 2.372 U g-1, Kit-RGO-Fe3O4 kullanıldığında ise % 57.07 ve 2.50 U g-1 olarak hesaplandı. Serbest lakkaz için optimum pH 4.0, immobilize enzimleri için optimum pH 5.0 ve optimum sıcaklıklar ise 40 °C olarak belirlendi. Organik solvent, inhibitör, termostabilite ve depolama çalışmaları sonucunda immobilize enzimlerin serbest enzime göre daha kararlı ve daha az inhibe olduğu bulundu. Çalışmada, etkili bir boya giderimi için pH, reaksiyon süresi, enzim immobilize boncuk miktarı, iyonik şiddet etkisi, boya konsantrasyonu ve sıcaklık gibi farklı parametrelerde enzimatik boya giderimi incelendi. Ayrıca muamele edilmiş boya çözeltileri ile fitotoksisite çalışmaları yapıldı.
Bor stresine maruz kalmış buğday bitkisine eksojen nitrik oksit (NO) ilavesinin fizyolojik etkilerinin incelenmesi
Türkiye, özellikle Batı Anadolu Bölgesi, dünyadaki Bor (B) rezervlerinin % 61'ine sahiptir ve bu bölgedeki B toksisitesi tarım alanlarını etkileyen önemli bir problemdir. Türkiye'de önemli bir tarım ürünü olan buğday da bu bölgelerde yetişmekte ve B toksisitesinden oldukça etkilenmektedir. Nitrik oksit (NO), bitki büyümesi, gelişmesi ve farklı hücre içi süreçlerde rol alan önemli bir sinyal molekülüdür. Bu tez çalışmasında, 10 mM B stresi uygulanan Bezostoya (B hassas) ve Kutluk 94 (B dayanıklı) buğday türlerine farklı konsantrasyonlarda Sodyum Nitroprussid (SNP) (NO donörü) eklenerek, NO'nun iyileştirici etkileri araştırıldı. Bunun için her iki buğday türünde; gövde ve kök uzunlukları, ağırlıkları, % elektrolitik iletkenlik (%EL), Malondialdehit (MDA), Prolin, Hidrojen Peroksit (H2O2) içerikleri, Glutatyon Peroksidaz (GPX), Glutatyon Redüktaz (GR), Glutatyon S Transferaz (GST), Nitrat Redüktaz (NR) enzim aktiviteleri, Düşük Molekül Ağırlıklı Organik Asit içerikleri (LMWOA), metal içerikleri, Poliamin (PA) içerikleri, Sistein, Redükte Glutatyon (GSH), Okside Glutatyon (GSSG), Fitoşelatin (PC2) içerikleri ve Nitrat Redüktaz enzimine ait gen ekspresyon düzeyleri analiz edildi. Bor stresiyle birlikte buğday bitkisinin her iki türünde de gövde, kök ağırlıklarında azalmalar elde edildi. On mM bor derişimine 0,2 mM SNP ilave ettiğimizde Bezostoya ve Kutluk 94 buğday gövde ağırlıklarında sırasıyla %64 ve %103 oranlarında artışların olduğu gözlendi. Bezostoya ve Kutluk 94 buğday gövdelerinde H2O2 içeriğinde 10 mM bor stresinde kontrol grubuna göre sırasıyla %102 ve %70 oranında artış elde edildi. On mM bor derişimine 0,2 mM SNP ilave edildiğinde Bezostoya ve Kutluk 94 buğday türlerinde H2O2 içeriğinde sırasıyla %13 ve %23 oranında azalmalar elde edildi. GPX aktivitesi Bezostoya ve Kutluk 94 buğday türü gövdelerinde 10 mM bor konsantrasyonuyla birlikte kontrol gruplarına göre sırasıyla %33 ve %14 oranında azaldı. Bor stresine 0,2 mM SNP ilave edildiğinde enzim aktivitesinde sırasıyla %32 ve %9,8 oranında artışlar elde edildi. Bezostoya ve Kutluk 94 buğday gövdelerinde 10 mM bor stresinde NR enzim aktivitelerinde kontrol grubuna göre sırasıyla %57,43 ve %25,76 oranında azalmalar gözlendi. 10 mM bor konsantrasyonuna 0,2 mM SNP ilave ettiğimizde NR enzim aktivitesi Bezostoya ve Kutluk 94 buğday türlerinde sırasıyla %220,67 ve %70,33 oranında arttı. Bezostoya gövdelerine 10 mM bor uyguladığımızda kontrol gurubuna göre benzoik, malik, oksalik asit içeriklerinde sırasıyla %49, %36, %40 oranında, Kutluk 94 türünde ise %19, %16, %23 oranında azalmalar elde edildi. Ortama ilave edilen SNP konsantrasyonlarından 0,2 mM'da benzoik, malik, oksalik asit düzeyleri Bezostoya türünde %118, %42, %90, Kutluk 94 türünde ise %22, %54, %39 oranında arttı. Hem Bezostoya hem de Kutluk 94 buğday türlerinin kök ve gövdelerinde 10 mM bor ilavesiyle bor içeriklerinde artış gözlendi. Kutluk 94 buğday gövdelerinde 10 mM bor stresli ortama 0,1, 0,2 ve 0,5 mM SNP ilave edildiğinde bor içerikleri %12, %40 ve %32,5 oranında azaldı. Poliamin içeriklerinde 10 mM bor stresinde kontrol grubuna göre Bezostoya buğday türünün gövdelerinde putresin, spermidin ve spermin içeriklerinde sırasıyla %60,47, %27,24 ve %68,57, Kutluk 94 buğday türünde ise %46,94, %24,27 ve %37,39 oranında artışlar elde edildi. Bor stresi ortamına ilave edilen SNP, stresten dolayı artan poliamin miktarlarını azalttı. Ancak en iyi cevap 0,2 mM SNP konsantrasyonundan elde edildi. Kutluk 94 türü köklerinde, sistein, GSH ve GSSG oranları 10 mM bor konsantrasyonunda kontrol grubuna göre %38,80, %31,06 ve %52,87 oranında azalırken Bezostoya buğday türünde ise %39,60, %41,87 ve %56,89 oranında azaldı. Bezostoya buğday türü gövdelerinde 10 mM bor stresinde kontrol grubuna göre PC2 içeriği %94,49 oranında artış gösterdi. Bu artış Kutluk 94 buğday türünde %80,44 olarak bulundu. On mM bor stresine 0,1, 0,2 ve 0,5 mM SNP uyguladığımızda Bezostoya türünde PC2 içeriklerinde sırasıyla %19,02, %36,42 ve %51,60 oranında azalmalar elde edilirken Kutluk 94 türünde bu oranlar %22,98, %39,35 ve %45,08 olarak bulundu. NR enzimine ait RT- PCR sonuçlarına göre enzimin ekspresyon oranı, gövdelerde kontrol grubuna göre değişim, 10 mM bor ilavesiyle Bezostoya türünde 4,5 kat, Kutluk 94 türünde 2,6 kat oranında azaldı. Ortama 0,2 mM SNP ilave edilmesiyle NR enzim ekspresyonunda 10 mM bor stresine göre Bezostoya ve Kutluk 94 gövdelerinde sırasıyla 10,57, 6,65 kat oranında artışlar elde edildi. Bu sonuçlar, NO'nun, B stresine karşı buğday bitkisinin büyümesi ve gelişmesinde hayati önem taşıyan birçok metabolik süreçte iyileşmelere neden olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, B toksisitesinin problem oluşturduğu buğday tarımının yapıldığı alanlarda, NO'nun bitkiye dışarıdan uygulaması ile bitkideki stresin negatif etkileri ortadan kaldırılabilir.
Mangan ve demir stresi uygulanmış roka (Eruca sativa) bitkisinde bazı antioksidan enzim aktivitesindeki ve lipid peroksidasyon düzeylerindeki değişimlerin incelenmesi
ÖZETYedi gün çimlendirilmi roka (Eruca sativa) bitkisi 16 saat k- 8 saat karanl k büyümeçemberinde 0-5000 µM aras nda de i en Mn+2 ve Fe+2 içeren besi ortam nda strese maruzb rak ld . Mangan toksisitesi uygulanan roka yapraklar nda kontrol grubuna göre süperoksitdismutaz (p 0.05), guasikol peroksidaz (p 0.01) aktiviteleri ve lipid peroksidasyon seviyeleri(p 0.05) daha yüksek, askorbat peroksidaz aktivitesi (p 0.05) ise daha dü ük bulundu. Artanmangan konsantrasyonuna ba l olarak yapraklardaki klorofil içeri inde azalma gözlendi(p 0.01). Stres uygulanan roka yapraklar n n 6. gününde yapraklarda kahverengibeneklenmeler, relatif büyüme h z nda ve gövde (yaprak+sap) uzunlu unda azalmalarbelirlendi.15 günlük muamele periyodunda 3.45-5000 µM aral nda mangan toksisitesiuygulanan roka köklerinde ise kontrol grubuna göre Mn art na ba l olarak süperoksitdismutaz (p 0.05), askorbat peroksidaz (p 0.05), guasikol peroksidaz (p 0.01) aktivitelerindeve lipid peroksidasyon seviyelerinde (p 0.05) artma saptand . Bitki büyüme parametreleriincelendi inde ise roka bitkisinin kök uzunluklar nda artan mangan konsantrasyonuna ba lolarak azalmalar gözlendi.0-3.45 µM mangan eksiklik stresi uygulanm roka yapraklar nda 15. günün sonundakontrol grubuna göre süperoksit dismutaz (p 0.01), guasikol peroksidaz (p 0.01)aktivitelerinin ve lipid peroksidasyon düzeylerinin (p 0.05) artt , askorbat peroksidazaktivitesinin (p 0.05) ve klorofil içeri inin azald belirlendi. Mn eksikli i uygulanan rokayapraklar nda 6. günün sonunda relatif büyüme h z nda ve gövde (yaprak+sap) uzunlu undas ras yla % 2.15 ve %10 azalma ve yapraklarda sararmalar gözlendi.Fe+2 toksisitesi uygulanm roka yapraklar nda 15. gün sonunda kontrol grubuna göreyapraklardaki süperoksit dismutaz (p 0.01), askorbat peroksidaz (p 0.05), guasikolperoksidaz (p 0.05) aktiviteleri ve lipid peroksidasyon seviyelerinin (p 0.05) belirgin olarakartt belirlendi.15 günlük muamele periyodunda artan demir konsantrasyonuna ba l olarakklorofil içeri inde(p 0.05) azalmalar belirlendi. 6. günde relatif büyüme h z nda ve gövde(yaprak+sap) uzunlu unda azalmalar ve gözlendi.Artan Fe+2 konsantrasyonuna ba l olarak stres uygulanan roka köklerinin süperoksitdismutaz (p 0.01), guasikol peroksidaz aktivitesi (p 0.05) ve lipid peroksidasyon düzeyleri(p 0.01) kontrol grubuna göre artt , askorbat peroksidaz (p 0.05) aktivitesinin azaldbelirlendi. Roka bitkisinin kök uzunluklar n n kontrol grubuna göre azald ve köklerdesaçaklanmalar n oldu u gözlendi.0-34.7 µM Fe+2 aral nda 15 gün eksiklik stresi uygulanan roka yapraklar nda,kontrol grubuna göre süperoksit dismutaz (p 0.05) ve lipid peroksidasyon düzeylerinde(p 0.01) artma askorbat peroksidaz ve guasikol peroksidaz aktivitelerinde ise kontrolgrubuna göre azalmalar gözlendi (p 0.05) Demir eksikli i uygulanm roka yapraklar ndakontrol grubuna göre toplam klorofil içeri inde % 31 oran nda (p 0.01) azalma gözlendi. 6.günde demir miktar n n azal na ba l olarak yapraklarda sararmalar, büyümeparametrelerinde % 15 oran nda azalma belirlendi.Anahtar Kelimeler: Antioksidan enzimler, lipid peroksidasyonu, metal stresi, oksidatif stres,roka (Eruca sativa)
Bakır (Cu) çinko (Zn) ve tuz stresi uygulanmış mercimek yapraklarında (Lens Esculenta) bazı antioksidan enzim aktivite değişimlerinin ve lipid peroksidasyon düzeylerinin incelenmesi
Bu çalışmada, mercimek bitkisinin tuz, bakır, çinko stresi uygulanmışantioksidan enzim aktivite değişimleri incelenmiştir. On gün çimlendirilmişmercimek (Lens esculenta) bitkisi 16 saat ışık- 8 saat karanlık büyümeçemberinde değişik konsantrasyonlarda NaCl, Cu+2 ve Zn+2 içeren besiortamında strese maruz bırakıldı.Tuz stresi uygulanan mercimek yapraklarında kontrol grubuna göreaskorbat peroksidaz (p<0.05) aktivitesinin düşük, süperoksit dismutaz (p<0.01),guasikol peroksidaz (p<0.01) aktiviteleri ve lipid peroksidasyon seviyelerinin(p<0.05) ise daha yüksek olduğu bulundu. Klorofil içeriğinde ise toksisitearttıkça kontrol grubuna göre azalma belirlendi (p<0.05). Relatif büyüme hızındave gövde (yaprak+sap) uzunluğunda azalmalar belirlendi.Bakır stresinin mercimek bitkisi üzerindeki etkileri yaprak ve kök olarakincelendi. Bakır toksisitesi uygulanan mercimek yapraklarında kontrol grubunagöre süperoksit dismutaz (p<0.01), guasikol peroksidaz (p<0.05) aktiviteleri velipid peroksidasyon seviyeleri (p<0.05) daha yüksek, askorbat peroksidazaktivitesi (p<0.01) ise daha düşük bulundu. Artan bakır konsantrasyonuna bağlıolarak klorofil içeriğinde (p<0.05) azalma gözlendi.21 günlük muamele periyodunda bakır toksisitesi uygulanan mercimekköklerinde ise kontrol grubuna göre Cu artışına bağlı olarak süperoksit dismutaz(p<0.01), guasikol peroksidaz (p<0.05) aktivitelerinde ve lipid peroksidasyonseviyelerinde (p<0.01) artma, askorbat peroksidaz aktivitesinde (p<0.01) iseazalma saptandı.Bakır eksiklik stresi uygulanmış mercimek yapraklarında 21. gününsonunda kontrol grubuna göre süperoksit dismutaz (p<0.05), guasikolperoksidaz (p<0.05) aktivitelerinin ve lipid peroksidasyon düzeylerinin (p<0.01)arttığı, askorbat peroksidaz aktivitesinin (p<0.01) ve klorofil içeriğinin azaldığıbelirlendi. Cu eksikliği uygulanan mercimek yapraklarında 7. günün sonundarelatif büyüme hızında ve gövde (yaprak+sap) uzunluğunda azalma gözlendi.Çinkonun mercimek bitkisi üzerindeki etkileri kök ve yapraklardaincelendi. Çinko toksisitesi uygulanan mercimek yapraklarında 21. gün sonundakontrol grubuna göre yapraklardaki süperoksit dismutaz (p<0.01), guasikolperoksidaz (p<0.05) aktiviteleri ve lipid peroksidasyon seviyelerinin (p<0.05)arttığı, askorbat peroksidaz aktivitesinin ise azaldığı belirlendi. 21 günlükmuamele periyodunda artan çinko konsantrasyonuna bağlı olarak klorofiliçeriğinde(p<0.01) azalmalar belirlendi. 7. günde relatif büyüme hızında vegövde (yaprak+sap) uzunluğunda azalmalar gözlendi.Artan Zn+2 konsantrasyonuna bağlı olarak stres uygulanan mercimekköklerinde süperoksit dismutaz (p<0.01), askorbat peroksidaz (p<0.05) ve lipidperoksidasyon düzeylerinin (p<0.01) kontrol grubuna göre arttığı, guasikolperoksidaz (p<0.05) aktivitesinin azaldığı gözlendi. Mercimek bitkisinin kökuzunluklarının kontrol grubuna göre azaldığı gözlendi.21 gün eksiklik stresi uygulanan mercimek yapraklarında, kontrolgrubuna göre süperoksit dismutaz (p<0.05) ve lipid peroksidasyon düzeylerinde(p<0.01) artma askorbat peroksidaz (p<0.01) ve guasikol peroksidaz (p<0.01)aktivitelerinde ise kontrol grubuna göre azalmalar gözlendi. Çinko eksikliğiuygulanmış mercimek yapraklarında kontrol grubuna göre toplam klorofiliçeriğinde (p<0.05) azalma gözlendi. 7. günde çinko miktarının azalışına bağlıolarak büyüme parametrelerinde azalma belirlendi.Anahtar Kelimeler: antioksidan enzimler, lipid peroksidasyonu, Mercimek (lensesculenta), metal stresi, oksidatif stres, tuz stresi.
Tuz stresi altındaki yeşil ve kırmızı mercimek bitkisinde fizyolojik ve enzimatik arametreler üzerine farklı konsantrasyonlarda ilave edilen kalsiyum ve borun etkisinin incelenmesi ve karşılaştırılması
Bu çalışmada, kırmızı ve yeşil mercimek bitkilerine 50 ve 200 mM tuz stresi uygulandı. On gün çimlendirilmiş kırmızı ve yeşil mercimek (Lens esculenta) bitkisi 16 saat ısık- 8 saat karanlık büyüme çemberinde değişik konsantrasyonlarda NaCl, B ve Ca içeren besi ortamında strese maruz bırakıldı.Daha sonra bazı enzim aktiviteleri ve büyüme parameterleri incelendi
Bor stresi uygulanmış bitkilerde (kırmızı mercimek ve arpa) farklı azot kaynaklarının ve bazı nutrient ilavelerinin büyüme ve stres parametreleri üzerine etkisinin incelenmesi ve karşılaştırılması
Bu çalışmada, kırmızı mercimek ve arpa bitkilerine 5 ve 10 mM bor stresi uygulanması üzerine değişik azot kaynaklarının ve kalsiyumun etkisini inceledik. On gün çimlendirilmiş kırmızı mercimek(yerli) ve arpa(tokak) bitkileri 16 saat ışık-8 saat karanlık büyüme çemberinde 7 gün boyunca bor stresi ile farklı azot kaynaklarına(10 mM azot içeren NH4 Cl, KNO3, Üre) ve değişik konsantrasyonlarda (8 ve 10 mM) kalsiyuma maruz bırakıldı.Bor stresi uygulanan kırmızı mercimek bitkilerinin azot kaynaklarının değiştirilmesi sonucunda filizlerinde(yaprak+gövde) ve köklerinde kontrol gruplarına göre askorbat peroksidaz ve katalaz aktivitelerinin düştüğü (p<0,05) belirlendi. Arpa bitkilerinin filiz ve köklerinde ise katalaz ve askorbat peroksidaz aktivitelerin artış olduğu tespit edildi, süperoksit dismutaz, guasikol peroksidaz, lipoksigenaz aktivitelerinin ise her iki bitkinin filiz ve köklerinde bor stresi ile arttığı belirlendi (p<0,01). MDA, H2O2, prolin miktarlarında da artış (p<0,05) gözlenmiştir. % Relatif büyüme hızında da bor stresine bağlı olarak azalmalar (p<0,05) belirlendi. Fotosentetik pigmentlerde ise bor stresine bağlı olarak azalmalar(p<0,01) belirlendi. Kırmızı mercimek bitkisinde ki değişimler arpa bitkisine göre daha yüksek düzeyde belirlenmiştir. Ayrıca NH4+ azot kaynaklı örneklerde ki değişimin diğer gruplara göre daha düşük seviyede olduğu tayin edilmiştir.Bor stresi uygulanan kırmızı mercimek ve arpa bitkilerinin azot kaynaklarının değiştirilmesi üzerine kalsiyum ilavesinin incelenmesinde ise filizlerinde ve köklerinde kontrol gruplarına göre askorbat peroksidaz ve katalazda aktivitelerinde artışlar(p<0,05), süperoksit dismutaz ve guasikol peroksidaz aktivitelerinde azalmalar gözlendi. MDA, H2O2, prolin miktarlarında da azalmalar (p<0,05) belirlendi. % Relatif büyüme hızında ve toplam klorofil miktarında kalsiyum konsantrasyonuna bağlı olarak artışlar (p<0,05) belirlendi. İki bitkiyi kıyaslayacak olursak mercimek bitkisindeki değişimler arpa bitkisine göre daha yüksek düzeyde belirlendi. Ayrıca azot kaynakları açısından değerlendirecek olursak KNO3 kullanılan örneklerde ki değişimin diğerlerine oranla daha yüksek düzeyde (p<0,05) olduğu tespit edilmiştir.Sonuç olarak, Bor toksisitesinin yüksek olduğu topraklarda NH4+ azot kaynaklı gübrelerin kullanılması ya da kalsiyum ilaveli KNO3 azot kaynaklı gübrelerin kullanılması, yapılan denemeler sonucunda daha uygun bulunmuştur.
Kitosan türevlerinde immobilize edilen lakkazın aktiviteleri, stabiliteleri ve reaksiyon kinetiklerinin incelenmesi
Spektroskopik olarak farklı olan 3 tip bakır iyonuna sahip olmaları nedeniyle lakkaz enzimleri (EC 1.10.3.2; p-difenol:dioksijen oksidoredüktazlar), çoklu-bakır içeren mavi proteinler sınıfına dâhil edilmektedirler. Lakkaz enzimleri, çeşitli substitiye fenolik bileşikleri, aromatik aminleri ve hatta bazı inorganik bileşikleri dahi elektron akseptörü olarak moleküler oksijeni kullanarak oksitleyebilmektedirler. Lakkaz enzimlerinin oldukça geniş bir çeşitlilikteki substratlar üzerinde aktivite gösterebilme yeteneği, son zamanlarda bu enzimlerin tekstil boyalarının renk giderimleri, kâğıt hamurunun biyolojik olarak ağartılması ve biyoremidasyon gibi farklı biyoteknolojik uygulamalarda biyokatalizör olarak kullanılmalarına yol açmıştır.Bu çalışmada kitosan glutaraldehit (GA), dopamin (DA), kil, Fe3O4, Epikolorohidrin (ECH) ve histidin ile modifiye edilerek kitosan-GA-DA, kitosan-kil-GA-DA, kitosan-Fe3O4-GA-DA, kitosan-Fe3O4-kil-GA-DA ve kitosan-ECH-histidin kitosan boncukları elde edildi. Daha sonra modifiye kitosan boncuklar taşıyıcı olarak lakkaz (benezenediol:oxygen oxidoreductase EC 1.10.3.2) immobilizasyonunda kullanıldı. % immobilizasyon verimleri ve gram taşıyıcı başına elde edilen enzim aktiviteleri, taşıyıcı olarak kitosan-GA-DA kullanıldığında sırasıyla % 82 ve 2,63 U/g, kitosan-kil-GA-DA kullanıldığında sırasıyla % 72 ve 2.89 U/g, kitosan-Fe3O4-GA-DA kullanıldığında sırasıyla % 86 ve 2.73 U/g, kitosan-Fe3O4-kil-GA-DA kullanıldığında sırasıyla % 75 ve 3.01 U/g, kitosan-ECH-histidin kullanıldığında ise %59 ve 2.84 U/g olarak hesaplandı.Serbest enzim ve modifiye kitosan boncuklar üzerine immobilize edilen lakkazın karakterizasyon ve optimizasyon çalışmaları sonucunda, serbest lakkaz için optimum pH 4.0, tüm taşıyıcılarda immobilize edilen lakkaz için optimum pH 5.0 ve optimum sıcaklık ise 40 oC olarak saptandı. Sıcaklık stabilitesi çalışmalarında ise immobilize enzimin serbest enzime oranla sıcaklık değişimlerine karşı dayanıklılığının daha iyi olduğu gözlemlendi.ABTS substrat olarak kullanıldığında serbest lakkazın KM ve Vmax değerleri sırasıyla 0,297mM ve 26,96 U/mg olarak bulundu. Aynı substrat ile İmmobilize enzimin KM ve Vmax değerleri taşıyıcı olarak Kitosan-GA-DA kullanıldığında 0,397 mM ve 11,24 U/mg, kitosan-kil-GA-DA kullanıldığında 0,410 mM ve 12,03 U/mg protein, kitosan-Fe3O4-GA-DA kullanıldığında 0,365 mM ve 11,76 U/mg, kitosan-kil-Fe3O4-GA-DA kullanıldığında 0,426 mM ve 12,26 U/mg, kitosan-ECH-histidin kullanıldığında 0,382 mM ve 10,89 U/mg olarak hesaplandı.Depolama çalışmalarında ise serbest lakkaz ve immobilize edilen lakkaz enzimleri 16 hafta boyunca 4 ve 25 oC'de depolanarak belirli aralıklarla aktiviteleri ölçüldü. Depolama çalışmaları sonucunda immobilize lakkazın serbest lakkaza göre 4 ve 25 oC'de daha kararlı olduğu saptandı. Farklı taşıyıcılar üzerine immobilize edilen lakkazın tekrar kullanılabilirliğini belirlemek için aynı boncuklarda 100 defa tekrarlanan aktivite ölçümleri sonucunda başlangıç aktivitelerinin % korunduğu görülmüştür.
Modifiye edilmiş kitosan boncuklar üzerine katalaz enziminin immobilizasyonu
Enzime immobilizasyon teknikleri enzimin tekrar kullanımına ek olarak, üretim ortamından ayrılması ve sürekli üretime olanak vermesi gibi avantajlar sağlar. İmmobilize biyokatalizörün başarılı bir şekilde uygulanması ve geliştirilmesi için, enzim taşıyıcısı genellikle en önemli bileşen olarak göz önünde bulundurulur. İmmobilize enzim reaktörlerinin kolaylık sağlamasına rağmen taşıyıcı materyallerin pahalılığı yüzünden hala immobilize enzimlerin geniş uygulama alanları az bulunmaktadır. Bundan dolayı, enzim immobilizasyonu için ideal bir taşıyıcı olarak bilinen kitosan gibi ucuz taşıyıcılar üzerine enzim immobilizasyon teknikleri geliştirilmesi gerekir. Kimyasal olarak kitinin deasetilasyonuyla türeyen kitosan metal iyonları ve organik maddelerin uzaklaştırılması için ucuz ve çok yönlü bir polimerdir.Bu çalışmada kitosan ve modifiye kitosan boncuklar üzerine kovalent bağlama yöntemiyle katalaz enziminin immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Kitosanın, kil ve Fe3O4 ile fiziksel modifikasyonu, L-lizin ile kimyasal modifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Kitosan, kitosan-kil(1:1) ve kitosan-Fe3O4(1:0,2) asetik asit çözeltisi içinde çözüldü ve enjektör yardımıyla TPP çözeltisi içine damlatıldı. Belli bir süre olgunlaşması için bekletildi. Lizin modifiye kitosan boncukların hazırlanması için öncelikle kitosan boncuklar hazırlandı ve daha sonra bu boncuklar L-lizin ile kimyasal olarak modifiye edildi. Kitosan ve modifiye kitosan boncuklar üzerine immobilize edilen katalazın karakterizasyon ve optimizasyon çalışmaları (optimum glutaraldehit konsantrasyonu, optimum çapraz bağlama süresi, optimum immobilizasyon süresi) gerçekleştirildi. Çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehit kullanıldı ve uygun glutaraldehit konsantrasyonu kitosan, kitosan-kil ve magnetik Fe3O4 modifiye kitosan boncuklar için % 3 bulunurken lizin modifiye kitosan boncuklar için % 2 olarak belirlendi. Taşıyıcı üzerine bağlanan protein miktarını belirlemek için Bradford yöntemine göre serbest enzim, filtrat ve yıkama sularında protein tayini yapıldı. Kitosan, kitosan-kil, kitosan-Fe3O4 ve kitosan-lizin boncuklar üzerine bağlanan protein miktarı sırasıyla % 57.14, % 60.71, % 78.57 ve % 73.21 olarak hesaplandı. İmmobilize katalazın aktivitesi gram taşıyıcı başına düşen aktivite olarak hesaplandı. Kitosan, kitosan-kil,Fe3O4 modifiye kitosan ve lizin modifiye kitosan boncukların aktiviteleri sırasıyla 60.83 U/g, 79.07 U/g, 88.50 U/g ve 121.19 U/g olarak ölçüldü. Serbest ve immobilize katalazın optimum pH çalışmalarında pH 4.0-9.0 arasında değişen pH'larda aktivite ölçümleri yapıldı. Farklı taşıyıcılar üzerine immobilize edilen katalazın optimum pH'ı serbest katalaza göre değişmediği ve pH 7.0 olarak kaldığı belirlendi. Optimum sıcaklık çalışmalarında 5 0C-60 oC arasında değişen sıcaklıklarda serbest ve immobilize katalazın aktiviteleri ölçüldü. Optimum sıcaklık, serbest ve immobilize katalaz için 35 oC olarak saptandı. Sıcaklık ve pH stabilite çalışmalarında immobilize ve serbest katalaz farklı pH ve sıcaklıklarda 1 saat bekletilerek 1 saat sonrasında geri kalan aktiviteleri ölçüldü. İmmobilize enzimin serbest enzime oranla pH ve sıcaklık değişimlerine dayanıklılığının daha iyi olduğu gözlemlendi. Kitosan, kitosan-kil, Fe3O4 modifiye kitosan, lizin modifiye kitosan boncuklar ve serbest enzimin KM değerleri sırasıyla 33,76 mM, 30,33 mM, 26,66 mM, 27,0 mM ve 14,28 mM olarak hesaplanmıştır. Kitosan, kitosan-kil, Fe3O4 modifiye kitosan, lizin modifiye kitosan boncukların ve serbest enzimin Vmax değerleri 141,92 U/mg protein dk, 176,6 U/mg protein dk, 195,04 U/mg protein dk, 197,5 U/mg protein dk ve 3076,92 U/mg protein dk olarak hesaplandı. Elde edilen sonuçlardan immobilize katalazın KM değerinin serbest enzime göre arttığı Vmax değerinin ise azaldığı belirlenmiştir. Depolama çalışmalarında ise serbest katalaz ve immobilize katalaz 70 gün boyunca 4 oC ve 25 oC'de depolanarak belirli aralıklarla aktiviteleri ölçüldü. Depolama çalışmaları sonucunda immobilize katalazın serbest katalaza göre 4 oC ve 25 oC'de daha karalı olduğu saptandı. Farklı taşıyıcılar üzerine immobilize edilen katalazın tekrar kullanılabilirliğini belirlemek için aynı boncuklarda 100 defa tekrarlanan aktivite ölçümleri sonucunda hala aktivite gösterebildikleri tespit edildi.