Theses supervised by Prof. Dr. Zihni Demirbağ
13 theses · Karadeniz Technical University
Amsacta moorei entomopoxvirus muhtemel glikozil transferaz geninin (AMV248) yapısal ve fonksiyonel analizi
Amsacta moorei entomopoxvirus (AMEV), gen terapi, ifade vektörü ve biyopestisit olarak kullanılma potansiyeli olan önemli bir böcek virüsüdür. DNA dizi ve biyoinformatik analizler sonucu genomunda belirlenen amv248 kodlu ORF'nin muhtemel bir glikozil transferaz kodladığı önerilmiştir. Böylece amv248'in konak seçiciliğinde rol oynayan, virüs replikasyonunun için zorunlu bir yapısal protein kodladığı düşünülmektedir. Tez çalışmasında AMEV glikozil transferaz geninin yapısı ve virusün konağa tutunmasındaki rolünün aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda amv248'in transkripsiyonunun AMEV enfeksiyonunu takiben 3 ila 6 saatler arasında başlayan ara gen sınıfına ait bir gen olduğu; 126 baz 5' ve 50-84 baz aralığında 3' translasyona uğramayan bölge içerdiği belirlenmiştir. AMV248 proteininin 3 boyutlu yapısı tahmin edilerek muhtemel konak bağlanma aminoasitleri belirlenmiş ve 30 kDa'luk rekombinant protein üretilip heparine bağlandığı gösterilmiştir. Proteine özgü antikor hizmet alımı ile ürettirilmiş ve bu antikor ile virüsün immün nötralizasyonu gösterilmiştir. Ayrıca virüsün hücre yüzey matriks bileşenlerinden heparine bağlandığı, enfeksiyonun çözülebilir glikozaminoglikanlar ile inhibe edilebildiği ve yüzey GAG'ları çıkarılan hücrelerin enfeksiyonunda azalma görüldüğü belirlenmiştir. Son olarak amv248 genini içermeyen rekombinant virüs üretilmiş ve kontrol virüs ile replikasyon, enfeksiyon özellikleri, protein profili ve yavru virüs üretimi bakımından fark gözlenmezken, gen ifade seviyesinde fark olduğu qPCR metodu ile belirlenmiştir. Sonuç olarak virüsün konak hücreye tutunma ve enfeksiyon başlama mekanizmasıyla ilgili önemli bulgular elde edilmiştir.
Chilo iridescent virüs 458R açık okuma zincirinin moleküler karakterizasyonu
Chilo iridescent virüs (CIV), Iridoviridae familyasının Iridovirus cinsine ait biyokontrol ajanı olarak kullanım potansiyeline sahip bir böcek virüsüdür. Ayrıca, aşı geliştirme ve teröpatik ajan olarak kullanılabilme potansiyeline sahipir.. Virüsün bu alanlarda verimli şekilde kullanımı ise moleküler olarak aydınlatılması ile gerçekleştirilebilir. Bu tez kapsamında yapılan biyoinformatik analizler ve literatür araştırması sonucunda, CIV 458R geninin virüsün hücreye tutunma, hücreye giriş, viral replikasyon ve/veya viriyon inşası süreçlerinden biri ya da birkaçında görev yapıyor olabileceği düşünülmüştür. Genin fonksiyonel analizine yönelik planlanan çalışmalara temel oluşturması bakımından bu tezde ilk adım olarak 458R'nin transkripsiyonel analizi yapıldı, genin transkripsiyonu sonucu oluşan mRNA'nın translasyon olmayan uç bölgeleri belirlendi. Bu çalışmalar sonucunda, 458R'nin geç gen olduğu ve enfeksiyonu takiben 12 ila 24. saatler arasında transkripsiyonun başladığı belirlendi. mRNA'nın başlangıç kodonunun hemen yukarısındaki 53 nükleotidlik kısımın 5', stop kodonunun hemen aşağısındaki 40 nükleotidlik kısmın ise 3' translasyon olmayan bölgeleri oluşturduğu tespit edildi. Bu çalışmada, CIV enfeksiyonunda ve/veya yeni viriyon oluşumunda görevli olması muhtemel bir açık okuma zincirinin transkripsiyonel analizi yapılmıştır.
Amsacta mooreı entomopoksvirüs'e ait AMV197'nin trans-aktivasyonu ve konak seçiciliğindeki rolü
Daha önce yapılan çalışmalarda Amsacta moorei entomopoksvirüs'e ait AMV197 kodlu açık okuma zincirinin serin/treonin protein kinaz (pk) kodladığı belirlenmiştir ve virüs genomundaki bu gen yeşil floresan protein (GFP) geni ile yer değiştirilerek rekombinant virüs (Am-pk/gfp) oluşturulmuştu. Bu çalışmalara dayanılarak PK'ın virüsün replikasyonunda ve gen regülasyonunda rol oynadığı düşünülmüştür. Konak hücrenin ve virüs proteinlerinin virüs replikasyonundaki rolünü anlayabilmek için bu yüksek lisans tezinde protein kinaz (pk) geninin trans-aktivasyonunda rol alan proteinlerin belirlenmesi ve rekombinant virüs ve yaban tip virüsün enfeksiyonlarının farklı konaklarda karşılaştırılması hedeflenmiştir. pk geninin trans-aktivasyonunda rol oynayan proteinlerin belirlenmesi için South-Western Hibridizasyon deneyi gerçekleştirildi. Çalışma sonucunda işaretli proba bağlanabilen beş farklı protein bandı (50, 38, 35, 27 ve 16 kDa) belirlendi. Sonuçlar, pk'nın transa-ktivasyonunda rol oynayan proteinlerin virüs kökenli değil hücre kökenli olduğunu gösterdi. pk geninin virüs genomundan silinmesinin farklı konaklarda replikasyonu nasıl etkilediğini belirlemek için rekombinant virüs ve yaban tip virüsün farklı böcek hücrelerindeki (Lymantria dispar, Ld652 (kontrol); Bombyx mori, Bm; Spodoptera frugiperda, Sf9) DNA replikasyonları Slot-Blot Hibridizasyon yöntemiyle ve enfektivitesi End Point Dilution Assay (EPDA) ile karşılaştırıldı. Yapılan çalışmalar sonucunda, konak faktörlerinin pk genini kontrol ederek virüs replikasyonun da etkili olduğu sonucuna varıldı.
Entomopatojen funguslara ait hidrofobin genlerinin araştırılması, hidrofobin-infektivite ilişkisinin belirlenmesi ve in vitro sistemde ifadesi
Hidrofobinler, moleküler kütlesi yaklaşık 10 kDa olan filamentli funguslarda üretilen sistein açısından zengin, amfipatik proteinlerdir. Bu özelliklerinden dolayı yüzey kaplamaları, biyosensörler, rekombinant proteinlerin saflaştırılması ve kendi kendini temizleyen yüzeyler gibi birçok endüstriyel uygulamada önemli rol oynarlar. Bu tezde, entomopatojenik funguslarda (EPF) bulunan hidrofobin genlerinin belirlenmesi, hidrofobin özellikleri ile insektisidal özelliklerin karşılaştırılması ve seçilen hidrofobin geninin Pichia pastoris maya sisteminde ifade edilerek endüstriyel kullanıma hazırlanması amaçlanmıştır. Bu amaçla Karadeniz Teknik Üniversitesi fungus koleksiyonundan elde edilen 20 adet entomopatojenik fungus izolatında hidrofobin geninin varlığı araştırılmış ve bu izolatların 14'ünde hidrofobin geni (hyd) tespit edilmiştir. hyd taşıyan tüm izolatların sınıf I hidrofobin grubuna ait oldukları belirlenmiştir. Hidrofobin geni ihtiva eden entomopatojenik funguslar değerlendirildiğinde, insektisidal aktivite, morfolojik özellikler, hızlı büyüme, konak spektrumu, konak yüzeylerindeki adhezyon derecesi ve yüksek mortaliteye sahip olma özellikleri göz önünde bulundurulduğunda Beauveria bassiana KTU-57 izolatına ait hidrofobin geninin P. pastoris maya sisteminde ifade edilmesine karar verildi. Bu doğrultuda fungal genomdan ribozomal RNA elde edilerek revers transkriptaz enzimi ile cDNA'sı oluşturuldu. RT-PCR (Reverse Transcriptase-Ters Transkriptaz) ile elde edilen hidrofobin geni, pPICZC vektörüne klonlandı ve rekombinant maya vektörünün (pPICZC+hyd) P. pastoris X-33 gen ifade konağında ifadesi sağlandı. Önemli miktarda protein ifadesi gerçekleştirilmiş olmakla birlikte hidrofobin proteinin endüstriyel amaçlı kullanılması için üretim kapasitesinin arttırılmasına yönelik optimizasyon çalışmaları devam etmektedir.
The effects of Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus origin of chitinase and catepsin proteins on virulance of Chilo iridescent virus
Chilo iridescent virus (CIV) is of particular economic and ecological importance as it infects some pests in agriculture. However, it causes low virulence in CIV-infected hosts. Accordingly, it was determined that baculovirus chitinase and cathepsin proteins could be used to increase the virulence of CIV. Chitinase in baculoviruses is expressed together with cathepsin in the late phase of virus replication. It is known that cathepsin is effective on the insect by destroying the structure of the peritrophic membrane, and chitinase is effective on the insect by destroying the chitin layer. In the light of this information, in this study, it was aimed to increase the virulence of CIV by using chitinase and cathepsin proteins belonging to baculoviruses. Accordingly, it is primarily aimed to produce chitinase and cathepsin proteins in the bacterial expression system and to investigate the effects of the obtained proteins on CIV virulence after ingestion of the insect. Chitinase and cathepsin genes from the baculovirus genome were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using appropriate primers. The amplified genes were cloned into the pJET1.2 vector. After the necessary validations were made, both genes were transferred separately into the pET28a+ expression vector to ensure their expression in Escherichia coli BL21(DE3) cell. After the chitinase (64 kDa) and cathepsin (43 kDa) proteins were determined by SDS-PAGE and western blot analysis methods, they were purified by nickel affinity chromatography. They were infected with CIV after feeding to Galleria mellonella larvae at concentration of 500 ng, 1000 ng, 1500 ng, 2000 ng, 2500 ng, 5000 ng from the obtained proteins. As a result of this study, it was determined that the chitinase and cathepsin proteins of baculovirus increased the virulence of CIV by 23%. Accordingly, it was determined that baculovirus chitinase and cathepsin proteins could be used to increase the virulence of CIV.
Chilo iridescent virus (CIV) 118 L geninin bakülovirüs vektör sisteminde ifadesi ve antikor geliştirilmesi
Chilo iridescent virus (CIV), Iridoviridae familyasına ait bir böcek virüsüdür. CIV, tarımda önemli zararlara neden olan çeşitli otçul böceklerde enfeksiyon oluşturduğu için ekolojik ve ekonomik öneme sahiptir. Şu ana kadar yapılan çalışmalar sonucunda, CIV yapısında 54 farklı protein olduğu tespit edilmiştir. Bu yapısal proteinlerden biri virüs replikasyon döngüsü için hayati öneme sahip olabilecek potansiyel zarf proteini olan 118L açık okuma zinciri tarafından kodlanmaktadır. 118L, tüm iridoviridlerde homologları olan bir gendir. Ancak CIV'de bu gen tarafından kodlanan proteinin fonksiyonu bilinmemektedir. 118L geninin fonksiyonun aydınlatılması için genin ifadesinin gerçekleştirilmesi ve hedef proteine karşı antikor geliştirilmesi önemli bir basamağı oluşturmaktadır. Bu tezde, polimeraz zincir reaksiyonu ile 118L geni virüs genomundan çoğaltıldıktan sonra gen ifade sistemlerinden biri olan bakülovirüs ekspresyon vektör sisteminde genin ifadesi gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, saflaştırılan rekombinant protein kullanılarak antikor geliştirilmiştir. Sonuç olarak virüs yapı ve replikasyonunda 118L proteinin fonksiyonunun aydınlatılmasında kullanılabilecek 118L proteini ve bu proteine karşı kullanılabilecek antikor başarıyla elde edilmiştir.
Doğu Karadeniz bölgesinden entomopatojenik fungusların izolasyonu, karakterizasyonu ve virülanslarının belirlenmesi
Bu doktora tez çalışmasında, Doğu Karadeniz Bölgesi'nde yayılış gösteren zararlı böceklere karşı etkili ve güvenli biyolojik mücadele etmenleri bulmak için, toplam 301 toprak örneği alındı ve bu örneklerden Galleria tuzak yöntemi ile 62 adet entomopatojenik fungus izole edildi. Ayrıca, Thaumetopoea pityocampa (Schiff.) (çam kese böceği) ve Rhynchites baccus (L.) (çivi böceği) örneklerinden de birer adet fungus izolasyonu yapıldı. Elde edilen fungal izolatlar morfolojik ve moleküler teknikler kullanılarak ayrıntılı bir şekilde karakterize edildi. Karakterizasyon çalışmaları sonucunda, izolatlar Metarhizium anisopliae var. anisopliae, Metarhizium sp., Beauveria bassiana, Beauveria cf. bassiana, Isaria fumosorosea ve Evlachovaea sp. olarak tanımlandı. M. anisopliae var. anisopliae 34 lokaliteden izole edilmiş olup, en fazla tespit edilen fungusdur. Ayrıca, bu bölgeden izole edilen 13 adet B. bassiana ve 33 adet M. anisopliae var. anisopliae izolatlarının Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Polimorfizmi (AFLP) analizi kullanılarak genetik çeşitliliği belirlendi. B. bassiana izolatları arasında yüksek düzeyde genetik çeşitlilik belirlendi ve bu çeşitliliğin coğrafik lokalite ile ilişkili olduğu gösterildi (p<0,05). M. anisopliae var. anisopliae izolatları arasında da yüksek düzeyde genetik çeşitlilik belirlenmesine rağmen, bu çeşitlilik coğrafik lokalite ve habitat tipi ile ilişkilendirilemedi (p>0,05). İzolatların insektisidal aktivite tarama testleri Tenebrio molitor (un kudu) larvaları üzerinde yapıldıktan sonra yüksek insektisidal aktiviteye sahip 9 izolatın Melolontha melolontha (mayıs böceği) ve Dendroctonus micans (dev soymuk böceği) üzerindeki insektisidal aktiviteleri belirlendi. Bu testler sonucunda, Evlachovaea sp. KTU-36'ın M. melolontha üzerinde 15 gün içerisinde % 86,6 ve B. cf. bassiana KTU-53'ün D. micans'ın hem larva hem de erginlerde 6 gün içerisinde %100'lük ölüme neden olduğu belirlendi. Ayrıca, B. cf. bassiana KTU-53 izolatının D. micans larvalarına karşı LC50 değeri 1,77 × 104 spor/ml, erginlerine karşı ise 2,65 × 104 spor/ml olarak hesaplandı.
Amsacta moorei entomopoksvirüs protein kinaz geninin karakterizasyonu ve fonksiyonel analizi
Amsacta moorei Entomopoksvirüs (AMEV), Poxviridae familyasına ve Entomopoxviridae subfamilyasına ait bir böcek virüsü olup, önemli böcek zararlıları üzerinde yüksek derecede patojenik etki göstermektedir. Ayrıca AMEV, gen ekspresyon ve gen terapi vektörleri olarak kullanılabilmekte ve insan virüslerinin mekanizmalarının anlaşılmasında çalışılabilecek model virüs olması bakımından büyük önem arz etmektedir.AMEV genomik araştırmaları kapsamında yapılan bu çalışmada, AMEV genomunda bulunan serin/treonin protein kinaz bölgesine sahip AMV197 kodlu genin transkripsiyonel ve fonksiyonel analizleri gerçekleştirildi.DNA sentez inhibitörü varlığında enfekte edilen Ld652 hücrelerinden izole edilen mRNA örneklerinin RT-PCR yöntemiyle yapılan transkripsiyonel analizleri, AMV197'nin ?erken? grubu gen olarak ifade edildiğini gösterdi. AMV197'nin zamana bağlı transkripsiyon profili ise gene ait transkripsiyonun, enfeksiyondan 4 saat sonra başladığını, 7. saatte en yüksek seviyeye çıktığını ve bu saatten sonra azalmaya başladığını gösterdi.5' RACE analizi, transkripsiyonun, translasyon başlangıç noktasına göre -54. pozisyonda başladığını gösterdi. 3' RACE analizi sonuçları, AMV 197 geninin translasyon bitiş noktasına (TAA), bir tanesi 21 diğeri 31 baz (aşağıda) uzaklıkta iki transkripsiyon bitiş noktasının bulunduğunu gösterdi.Genin fonksiyonel analizi için, AMV197 geni homolog rekombinasyon ile AMEV genomundan silindi. Oluşturulan rekombinant virüsün (Am?PK/gfp) DNA replikasyonu slot-blot hibridizasyonu yöntemiyle ve enfektivitesi ise EPDA (End Point Dilution Assay) yöntemiyle belirlendi. Bu sonuçlar, protein kinaz geninin AMEV genomundan silinmesi durumunda, DNA replikasyonunun yaban tipe göre 6 saat erken gerçekleştiğini, ancak virüs üretiminin %61 oranında azaldığını göstermektedir.
Malacosoma neustria (Lepidoptera:Lasiocampidae)'dan virüs izolasyonu, karakterizasyonu ve mikrobiyal mücadelede kullanılma potansiyeli
Malacosoma neustria (Lepidoptera; Lasiocampidae) önemli tarımsal zararlılardan biridir. Bu zararlı ile mücadelede kullanılan kimyasal insektisitlerin çevre üzerinde zararlı etkileri bulunmaktadır. Kimyasal ilaçların yan etkilerinin keşfedilmesi, bilim adamlarını daha etkili ve daha güvenli bir mücadele yöntemi geliştirmeye sevk etmiştir. Bu tezde, Malacosoma neustria'da patojenik olan bir virüsün morfolojik, ultrastrüktürel, moleküler karakterizasyonu ve biyolojik mücadelede kullanılmak üzere konak hassasiyeti ve taşınımı çalışıldı. Viral infeksiyon Gümüşhane-Köse yöresinden toplanan M neustria larvalarında tespit edildi. Yapılan morfolojik, ultrastrüktürel, ve moleküler çalışmalar sonucunda tespit edilen virüsün Baculoviridae familyasından bir nükleopolihedrovirus olduğu belirlendi. Virusa ait PIB yapılarının 1,64±0,52 um çapında olduğu belirlendi. Polihedralann enine kesitinde her bir virionun 1 ile 18 adet arasında değişen sayılarda nükleokapsid içerdiği gözlendi. Bu nükleokapsidlerin 240 x 35 nm boyutlarında olduğu tespit edildi. Virus DNA'sının EcöBJ, BamHL ve HindSl restriksiyon enzim analizleri, bu çalışmada tespit edilen virüsün daha önce izole edilen ManeMNPVlerden farklı bir restriksiyon enzim profiline sahip olduğunu ortaya çıkardı. Polihedrin geni sekans analizleri sonucunda diğer ManeMNPV orijinli polihedrin genleriyle önemli farklılıkların olduğu belirlendi. Virüsün infeksiyon özelliğini belirlemek için yapılan çalışmalar birinci ve ikinci instar M. neustria larvaları üzerinde virüsün oldukça etkili olduğunu gösterdi. Konak spektrumunu belirlemek için virus Gypsonoma deaîbana, Cydia pomonella (Lep.Tortriciidae), Euproctis chrysorrhoea (Lep; Lymantriidae), Pieris brassicae (Lep; Pieridae), Yponomeuta malineüus (Lep; Yponomeutiaae) ve Hyphantria cunea (Lep; Arctiidae) larvalarına karşı test edildi. Elde edilen sonuçlar bu virüsün konak spektrumunun çok dar olduğunu gösterdi. Horizontal infeksiyonun yüksek oranda gerçekleştiği tespit edildi. Yapılan çalışmalar bu izolatın M. neustria ile biyolojik mücadelede etkili bir ajan olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Malacosoma neustria, Nükleopolihedrovirus, Biyolojik Mücadele, Baculovirus VI
Doğal ortamlardan izole edilen Bacillus thuringiensis'lerin karakterizasyonu ve insektisidal özelliklerinin belirlenmesi
Bu araştırmada, 3 tanesi böceklerden [(BnBt (Balaninus nucum, ergin), Mm2 (Meloloniha melolontha, ergin) ve MnÖ (Malacosoma neustria, larva)] 6 tanesi ise topraktan [(6 numaralı izolat Çağlayan' dan, 1 1 numaralı izolat Yeşilova'dan, 27 numaralı izolat Akçaabat' dan, 29 ve 40 numaralı izolatlar Tonya' dan ve 46 numaralı izolat Çaykara'dan)] izole edilen 9 B. thuringiensis izolatının fenotipik, moleküler ve kemotaksonomik olarak karakterizasyonu yapıldı. Işık ve tarama elektron mikroskobu sonuçlarına göre altı izolatta (BnBt, MnÖ, 27, 29, 40, 46) bipiramidal, bir izolatta (6 numaralı) küresel, bir izolatta (Mm2) düz kare ve bir izolatta (1 1) da şekilsiz kristaller olduğu tespit edildi. ISR-PCR sonuçlarına göre izolatlarm kontrol B. thuringiensis izolatlan ile benzer bantlar oluşturduğu görüldü. PCR analizleri sonucunda BnBt, MnÖ, 1 1 ve 29 numaralı izolatlarda cryl ve cry2 genleri, Mm2 izolatmda cry3 ve 6 numaralı izolatta ise cry4 genleri bulundu. SDS-PAGE analizlerinde, izolatlarda yaklaşık 65-130 kDa'lık proteinler belirlendi. Çözünmüş kristallerin tripsin ile parçalanmalarından sonra, SDS-PAGE analizlerinde 50-65 kDa arasında tripsine dirençli peptidler oluşturduğu görüldü. İzolatlarm plazmit içerikleri, kontrol Bacillus thuringiensis suşlan ile karşılaştınldığında 1 1 numaralı izolat hariç diğerlerinde 4-8 arası plazmit olduğu tespit edildi. BnBt ve MnÖ izolatlannm Malacosoma neustria ve Lymantria dispar larvalarına ve Mm2 izolatının Leptinotarsa decemlineata ve Agelastica alni larvalarına karşı insektisidal aktivite gösterdikleri diğer izolatlarm ise insektisidal aktivite göstermediği tespit edildi. Sonuç olarak, BnBt ve MnÖ izolatlannm Bacillus thuringiensis subsp. kurstakVye, Mm2 izolatının Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis'e ve 6 numaralı izolatın Bacillus thuringiensis subsp. israelensis'e benzedikleri tespit edildi. Diğer izolatlarm ise yeni B. thuringiensis izolatlan olduğu düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Bacillus thuringiensis, Kristal Proteinleri, cry Genleri, Biyolojik Kontrol
Hyphantria cunea nükleopolihedrovirüs`ünün Spodoptera frugiperda ve Lymantria dispar hücre kültürlerinde replikasyonunun karşılaştırılması
Bu çalışmada, Hyphantria cunea nükleopolihedrovirüs (HcNPV)'ün Spodoptera frugiperda (IPLB-Sf21) ve Lymantria dispar (IPLB-LdElta) hücre kültürlerinde replikasyon özellikleri araştırıldı. Enfeksiyon, oluşan sitopatik etkiler (CPE), ektrasellüler virüs üretimi ve virüs çoğalma eğrisi, polihedral inklüzyon yapı (PIB) oluşumu, viral DNA replikasyonu, viral yapısal proteinlerin sentezi vepolh gen transkripsiyonuyla belirlendi. Işık mikroskobuyla tespit edilen CPE'lerin Sf21 hücrelerinde LdElta hücrelerine göre yaklaşık 12 saat önce meydana geldiği görüldü. Polihedral inklüzyon yapılar Sf21 hücrelerinde enfeksiyondan 36 saat sonra meydana gelirken, LdElta hücrelerinde ilk olarak enfeksiyondan 48 saat sonra tespit edildi. Doku kültürü enfektif doz %50 (TCID5o)'ye göre belirlenen ektrasellüler virüs üretiminin Sf21 hücrelerine göre LdElta hücrelerinde yaklaşık 12 saat geç meydana geldiği belirlendi. Enfeksiyondan 72 saat sonra Sf21 ve LdElta hücrelerinde üretilen ekstrasellüler virüs miktarı sırasıyla 5,6 x 10 pfu/ml ve 1,77 x 10 pfu/ml olarak hesaplandı. Viral DNA replikasyonunun her iki hücrede de enfeksiyondan 12 saat sonra başladığı Slot Blot hibridizasyonuyla tespit edildi. Viral proteinlerin sentezi poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile belirlendi ve polihedrin proteininin her iki hücrede de enfeksiyondan 24 saat sonra ortaya çıktığı gösterildi. HcNPV -polh geninin hem Sf21 hem de LdElta hücrelerinde enfeksiyondan 10 saat sonra transkrip olduğu revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile gösterildi. Hücrelerde üretilen PIB'lerin H. cunea ve L. dispar larvaları üzerinde sırasıyla %51,9 ve %65,38 insektisidal etkiye sahip olduğu biyoassay testleriyle hesaplandı. HcNPV'nin makromoleküllerinin sentezinin Sf21 hücrelerindekine göre LdElta hücrelerinde yaklaşık 12 saat daha geç ve toplam virüs partikülleri üretiminin ise yaklaşık 3 kat az olduğu belirlendi. Anahtar Kelimeler: Baculovirus, HcNPV, Sf21, LdElta, Virüs Replikasyonu VI
Heliothis (Yeşilkurt) (Lepidoptera: Noctuidae) türlerinin viral patojenlerinin araştırılması
(Helicoverpa/Heliothis sp., Lepidoptera: Noctuidae) türleri dünyanın her yerinde kozmopolit olarak bulunan polifag tarım zararlılarıdır. Yeşilkurtlarla mikrobiyal mücadele amacıyla planlanan bu tez çalışmasında, 5 nükleopolihedrovirüs (NPV) izolatı tespit edildi, tanımlandı ve virülansları belirlendi. En etkili olan izolattan biyopestisit geliştirildi. İzolatların inklüzyon cisimciklerinin boyutlarının 0.73 - 2.26 m arasında, nükleokapsit boyutlarının ise 146 × 34 nm ile 279 × 56 nm arasında olduğu belirlendi. Filogenetik analizlerde, izolatların Helicoverpa armigera NPV (HearNPV) Çin izolatına yakın olduğu görüldü. Biyotestler sonucunda, HearNPV-TR izolatının tüm türlerde %80'in üzerinde ölüm gösterdiği belirlendi. Biyopestisit olarak geliştirilmesine karar verilen HearNPV-TR izolatının genomunun 130.691 baz çifti olduğu belirlendi. Genomda bulunan homolog tekrar bölgelerinin (hr3 ve hr5) ve bakülovirüs tekrar genlerinin (bro-a) literatürdeki Helicoverpa/Heliothis NPV genomlarından farklı olduğu görüldü. HearNPV-TR formülasyonunun üçüncü dönem H. armigera larvaları üzerinde LC50 değeri, 1.9 × 104 olarak hesaplandı. Bu çalışma ile ülkemizdeki Helicoverpa/Heliothis türlerinden bakülovirüs izolasyonları gerçekleştirildi ve tüm özellikleriyle tanımlanan HearNPV-TR izolatından Helicoverpa/Heliothis türlerinin biyokontrolleri amacıyla etkili ve yerel bir mikrobiyal mücadele etmeni ilk defa geliştirildi. Anahtar Kelimeler: Yeşilkurt, bakülovirüs, biyopestisit, yağ formülasyonu, genom analizi
Kiraz sineği mikrobiyomunun belirlenmesi ve potansiyel mikrobiyal kontrol ajanlarının tespiti
Cherry is a sweet and nutritious fruit grown all over the world. Türkiye has an important place in world cherry production and export. However, many factors negatively affect the yield and quality of cherry production. The cherry fruit fly (Rhagoletis cerasi) is a serious pest that causes big damage to cherry production and quality in Türkiye, as in almost every part of the world. Besides the cultural measures and the use of sticky traps containing ammonium salt, chemicals are preferred for the control of this pest. However, the harm of chemicals to non-target organisms, the formation of chemical residues on the fruits, the resistance gained by insect pests against chemicals, and a problem in the viewpoint of organic cherry production led to a reconsideration of the chemicals. Biological control agents are an ideal alternative for controlling insect pests. Among biological pesticides, the place of entomopathogenic organisms (bacteria, fungi, nematodes, viruses, and protozoans) is undoubtedly the most important. The current study aims to enlighten the microbiome of the cherry fruit fly for the elimination or reduction of the damage caused by this pest on cherries. In line with this aim, a total of 317 cherry flies from certain stations were collected, total RNA was extracted from larvae and adults of the insect, and high-efficiency sequencing (HTS) technology and bioinformatics tools were used for the detection of the microbiome of cherry fruit fly. Data analysis indicated that the most abundant entomopathogens in cherry fruit flies are Pseudomonas fluorescens, Serratia entomophila, Serratia proteamaculans, Enterococcus gallinarum, Lysinibacillus sphaericus, and Pseudomonas aeruginosa as bacterial entomopathogens and also indicate other potential viral and fungal entomopathogens with less abundance. Classification of the cherry fruit fly microbiome regarding commensal, symbiotic, or entomopathogenic microorganisms was done by comparing it with information in the literature.