Theses supervised by Prof. Dr. Rıdvan Say
10 theses · Anadolu University, Bilecik Şeyh Edebali Üniversity
Çok işlevli biyonanoplatformların geliştirilmesi ve biyokataliz ile biyobellek uygulamaları
Bu tezde; apoferritin biyomolekülünün ana iskelet olarak kullanılması ve farklı metal atomlarının bu proteinin boşluğuna gömülmesi yoluyla elde edilen birden fazla yüze ve fonksiyona sahip (Janus) biyonanoyapılar sentezlenmiştir. Bu biyonanoyapıların eldesi fotosensitif aminoasit monomerleriyle çapraz bağlanma yaklaşımı kullanılarak (ANADOLUCA metodu) sağlanmıştır. Bu çalışmada ilk olarak; nanoapoferritinlerin sentezi, bis (2-2'-bipiridil) MATyr-MATyr-rutenyum (II) fotosensitif monomeri eşliğinde mikroemülsiyon yoluyla başarılmış, ardından nanoapoferritinlerin kafes boşluklarına indirgeme yoluyla Pt, Fe, Mn, Cu metalleri ile Pt/Cu, Mn/Fe, Pt/Cu/Mn/Fe, Ag/Cu/Mn/Fe metal karışım kombinasyonları düzenlenmiş ve bu çok fonksiyonlu nano-apoferritin yapılar karakterize edilmiştir. Çalışmanın son aşamasında; Janus modeli biyonanoyapıların fonksiyonelliği, peroksidaz enzim kinetiği ve elektrokimyasal temelli yaklaşımlarla ortaya konulmuştur. Subsrat ve enzim derişimlerinin bu biyonanoyapıların aktivitelerine etkileri incelenmiştir.
Yapısında birden fazla fonksiyonu barındıran hetero nano-enzim yapılar ve elısa uygulamaları
Bu çalışmada rutenyum tabanlı amino asit monomerleriyle fotosensitif çapraz bağlama (ANADOLUCA) yöntemi kullanılarak, yapısında birden fazla enzim barındıran nano yapılar sentezlenmiş ve sentezlenen bu nano-enzimlerin ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) uygulamalarında kullanımları incelenmiştir. Bu amaçla ilk olarak horseradish peroksidaz (HRP) ve alkalen fosfataz (ALP) enzimleri, bis (2-2'-bipiridil) (MATyr)2 rutenyum (II) fotosensitif monomeri ile çapraz bağlı nano yapılar mikro emülsiyon polimerizasyon yöntemi ile gün ışığında, azot atmosferinde ve oda sıcaklığında sentezlenmiş ve bu nano yapılar geçirgenlik elektron mikroskobu (TEM), atomik kuvvet mikroskobu (AFM), zetametre ile boyut ve potansiyel analizi ile karakterize edilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında, HRP ve ALP'nin çapraz bağlandığı hetero nano-enzim ile kinetik çalışmalar yapılmıştır. Kinetik çalışmalar sonucunda hetero nano-enzimin tetrametilbenzidin substratına karşı optimum pH' ı 5, Km= 26 mM ,Vmak=1,24 x 10-2 U ve p-nitrofenilfosfat substratına karşı optimum pH' ı 10, Km=0,516 mM ,Vmak= 1,70 x 10-4 U olarak bulunmuştur. Yüksek sıcaklıklarda serbest enzimler denatüre olurken sentezlenen hetero nano-enzim yapı aktivitesini kaybetmemiştir. Tekrarlanabilirlik çalışmaları, metil alkol ile yıkanan nano yapının aktivitesinde on beşinci tekrarda bile önemli bir düşüş olmadığını göstermiştir. Çalışmanın son aşamasında nano enzim yapısı antikor ile konjuge edilerek ELISA uygulamaları gerçekleştirilmiştir.
Biyotinleyici ayırma sistemlerinin geliştirilmesi ve uygulamaları
Bu çalışmada; rutenyum tabanlı amino asit monomerleriyle fotosensitif çapraz bağlama (ANADOLUCA) metoduna göre sentezlenen kriyojel kolon aracılığıyla primerlerin 5' ucundan biyotinlenmesi tek basamakta gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla; ilk olarak DNA ligaz çapraz bağlı HEMA ve fotosensitif monomer tabanlı monolitik kriyojel kolon geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında, sentezlenen enzim tabanlı kriyojel kolon sistemi ile Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA) hastalığına sahip olan primerin 5' ucuna biyotin bağlanarak avidite etkinliği oluşturulmuştur. Bu etkileşimin ispatı, numunelerin mikroplaka okuyucu ile 354 nm' de elde edilen absorbans değerlerinde görülen artış ile yapılmıştır. Tasarlanan KKKA hastalığına sahip olan primerlerin etkinliği ise polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile kanıtlanmıştır. Çalışmanın son aşamasında, floresans özelliği gösteren streptavidin çapraz bağlı ve fotostabil Kuvantum nanokristaller (QD) oluşturulmuş ve biyotinlenmiş 5'-ssDNA problar streptavidin-QD platformlara bağlanmıştır. Daha sonra; hastalık tanısı gerçekleştirecek 3'-ssDNA komplementerinin hibridizasyonuna dayalı floresans değişimleri incelenmiştir.
Fotosistem II tabanlı biyonanoenerjetik geliştirilmesi ve biyobellek uygulamaları
Bu çalışmada öncelikle fotosistem II (FS II) kompleksinin ıspanak bitkisinden kimyasal parçalama yöntemiyle izolasyonu sağlanmış ve saflaştırmasında kullanılmak üzere kriyoyel tabanlı katı destek materyalleri geliştirilmiştir. Bu bağlamda çalışmanın ilk aşamasında fenilalanin içerikli hidroksi etilmetakrilat (HEMA) monomeri ile çapraz bağlayıcı N,N' metilenbisakrilamit (MBA) polimerleştirilerek kriyojel kolonlar hazırlanmıştır. Daha sonra sentezlenen kriyojel katı desteğin karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca; saflaştırılan FS II'lerin molekül ağırlığı SDS PAGE analizi ile protein içeriği ise Bradford yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında, saflaştırılan FS II yapısından yola çıkılarak biyoenerjetikler sentezlenmiştir. Bunun için fotoduyarlı mikro-emülsiyon polimerizasyon yöntemi uygulanmış olup biyonanoenerjetikler floresan spektrofotometresi, circular dichroism (CD) spektroskopisi ve zetametre ile karakterize edilmiştir. Çalışmanın son aşamasında, dönüşümlü voltametri ve kronoamperometri kullanılarak sentezlenen bu biyonanoenerjetiklerin biyobellek ve redox özellikleri incelenerek nanoFSII kompleksine yeni yönelimler getirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Fotosistem II (FS II), kriyojel, fotoduyarlı mikro-emülsiyon polimerizasyonu, biyobellek
Laktoferrin saflaştırılması için antikor çapraz bağlı kriyojel kolon
Laktoferrin (Lf), sütte bulunan ve önemli biyolojik aktivitelere sahip bir glikoproteindir. Yapılan tez çalışması ile vücut salgılarında bulunan, demir içeren bir savunma proteini olan ve tümör büyümesini de engelleyen Lf'nin inek sütünden saflaştırılması için anti-laktoferrin (anti-Lf) antikoru çapraz bağlı yeni nesil kriyojel kolon geliştirilmesi ve afinite kromatografi amaçlı kullanılması hedeflenmiştir. Bu amaçla; gözeneklerine anti-Lf tutturulmuş çapraz bağlı kriyojel kolon sentezlenmiştir. P(Anti-Lf-co-HEMA) kriyojeli kolon dolgu maddesi olarak kullanılmış ve Lf'nin Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) ile ayırımı sağlanmıştır. İnek sütünden elde edilen Lf'nin saflığı SDS-PAGE ile araştırılmıştır. Geliştirilen kolonun karakterizasyonu şişme testi, FT-IR, SEM ve BET analizleri ile yapılmıştır. Sonuç olarak; R. SAY tarafından WIPO ve USPTO patenti alınan fotoduyarlı konjugasyon yöntemi (ANADOLUCA) kullanılarak Lf 'yi yüksek seçicilikte ayırabilen ve tekrar kullanılabilen bu kolonlar ilk kez geliştirilmiştir. Geliştirilen bu kolonlar, kanser, aşı ve görüntüleme teknolojileri için önemli bir ajan olan Lf'nin saflaştırılması için bir alternatif oluşturacaktır. Anahtar Kelimeler: İnek sütü, Laktoferrin, Kriyojel, ANADOLUCA, Saflaştırma, Affinite Kromatografi
Antibakteriyel ve mimik özellikte nanobiyokonjugat geliştirilmesi
S.aureus hafif deri enfeksiyonlarından, endokard iltihabı, septisemi, toksik şok sendromu gibi hayati öneme sahip pek çok hastalığa neden olan çok yaygın rastlanan insan ve hayvan patojenidir. S. aureus enfeksiyonlarda kullanılan kemoterapötiklere hızla direnç kazanmaktadır. Özellikle lizozime, metisiline ve glikopeptitlere direnç kazanması mevcut antibiyotiklerle tedavi sorunları yaşanmasına neden olduğundan yeni nesil antibiyotikler üzerinde araştırmalar yoğunlaşmaktadır.S. aureus'un hastalık oluşturma yeteneği sahip olduğu virulans faktörlerine bağlıdır. En önemli virulans faktörleri stafilokokların konak dokularında kolonize olmasını sağlayan yüzey proteinleridir. Protein A immunoglobilinleri yanlış oryantasyonda bağlayarak enfeksiyon boyunca bakteri yüzeyini çevreleyip, bakterinin kamufule olmasını sağlayan yüzey proteinidir.Bu çalışmada, protein A blokasyonuna yönelik fotosensitif Mikroemülsiyon Tekniği ile Polimerik nano IgG ler sentezlenmiş ve biyokonjugasyon yöntemi ile lizozim için polimerik nano IgG'ler üzerinde yeni bağlanma bölgeleri geliştirilmiştir. Sentez işlemlerinde floresan özelliğe sahip kimyasallar kullanıldığından aktivite testleri floresans spektrofotometrisi ile yapılmıştır. Sentezlenen nanobiyokonjugatların in vitro ortamda aktivitesi tayin edilmiştir.
Romatoid artrit hastalığının proinflamatuvar sitokini olan TNF-? tabanlı nanoteranostik geliştirilmesi
Romatoid artrit (RA), bağışıklık sisteminin eklemlere saldırmasına yol açan kronik, inflamatuvar ve ağrılı bir otoimmün hastalıktır. RA' da hastalığın başlangıç sürecinde immun sistemine (bağışıklık) ait hücreler aktif hale gelirler ve bir otoimmunite süreci başlayarak hücreler kendi vücutlarına karşı savunmaya geçerler. RA tetiklendiğinde, vücudun bağışıklık yanıtı sinovyumun inflamasyonuna sebep olur. Bu süreç, inflamasyonun erken ve orta moleküler medyatörlerden sitokinlerin ve diğer inflamasyon aracılarının tetiklenmesi ile gerçekleşmektedir. RA oluşumunda, en önemli proinflamatuvar sitokinlerinden biri Tümör Nekroz Faktör-? (TNF-?) olarak kabul edilmektedir. Bu sebeple TNF-? tayini, RA hastalığında, hastalığın aktivitesi konusunda doğru bilgi edinilmesini, hastalığın lokalizasyonunun belirlenmesini ve görüntülenmesini sağlayarak hastalık sürecinin anlaşılmasında önemli bir parametreyi teşkil etmektedir.Bu çalışmada, TNF-? blokasyonuna yönelik yeni nanobiyobloklayıcılar sentezlenmiştir. TNF-? ve anti- TNF-? ile sentezlenen konjugatlar, floresan özelliğe sahip nano polimerik bir formata dönüştürülmüş ve aktiviteleri test edilmiştir. Aynı zamanda TNF-? ve anti-TNF-? eklem ve kıkırdağın en önemli bileşeni olan hiyaluronik asite ve superparamanyetik nanopartiküllere konjuge edilmiştir. Karakterizasyon çalışmaları nano formatta ve konjuge haldeki TNF-? ve anti-TNF-?'nın aktivitelerini koruduğunu göstermiştir. Böylece; RA hasta örneklerinde TNF-? tayini ve blokasyonu gerçekleşebilecektir.
ELISA sistemleri için yeni bir alternatif teknoloji: Tekrar kullanılabilir afinite kuyucuklar
Enzim bağlı immunosorbant testleri (ELISA) peptidler, proteinler, antikorlar ve hormonlar gibi maddelerin belirlenmesi ve sayısal olarak değerlendirilmesi için dizayn edilmiş plaka temelli testlerdir. Tayin, konjuge edilmiş enzim aktivitesini kullanarak ölçülebilir bir ürün üreten substratın inkübasyonu yolu ile gerçekleşir. Bir enzim doğrudan olarak birincil antikora bağlanabilir ya da bu birincil antikor biyotin işaretli ise streptavidin gibi bir proteine bağlanabilir. En yaygın kullanılan enzimler Horseradish Peroksidaz ve alkalinfosfatazdır. ß-galaktozidaz, asetilkolinesteraz ve katalaz da ELISA işleyişinde kullanılabilir. Substrat seçimi sinyal-tespit için uygun bir (spektrofotometre ya da florimetre gibi) cihaza dayanır. ELISA, antikorlar veya proteinler ile kaplanan 96 kuyucuk taşıyan polistren plakalarda gerçekleşir. Bu plakalar tek kullanımlıktır. Piyasada bulunan Protein A, G, C kaplı, Biyotin kaplı, Streptavidin kaplı, amin kaplı yada antikor kaplı modifiye mikroplakalar ELISA için tercih edilir.Bu çalışmada; ELISA prosedüründe kullanılan polistren mikroplaka kuyularının modifikasyonu ile tekrar kullanılabilir mikroplakalar elde edilmiştir. Plazma yöntemi ile amin kaplanan polistren plaka kuyular, fotosensitif monomerler kullanılarak yapılan modifikasyonlarla antikorlar yada diğer proteinlerin yüzeye çapraz bağlanması için uygun hale getirilmiştir.
Yapay integrin temelli nanobiyokonjugatif platform geliştirilmesi
Bu çalışma, hücre matriksine dıştan bağlanan transmembran hücre yüzey proteini olan integrin moleküllerini tanıyan ve reseptör-ligand etkileşiminde önemli bir rol oynayan arginin-glisin-aspartik asit (RGD) peptid dizilişini yansıtan biyouyumlu, kararlı yapay aspartik asit temelli ligand tanıyan nanokonjugatların oluşturulması ve bu yapının integrin reseptörünü tanıyan nanoyapılar olup olmadığını görüntülenmesine ve incelenmesine yöneliktir.
İyon baskılamaya dayanan katı-faz ekstraksiyon uygulamaları
Bu çalışmanın amacı, Fe(III) iyonlarını tanıyan iyon belleklere sahip, polimerik tabanlı Fe(III) baskılanmış yeni katı destekler geliştirilerek, bu katı desteklerde yer alan Fe(III) belleklerin Fe(III) iyonlarını bağlayabilme ve seçebilme özelliklerinin ortaya konulması ile bu katı desteklerin analitik uygulamalardaki etkinliğinin araştırılmasıdır. Bu çalışmanın ilk aşaması olan üç farklı katı desteğin sentez aşamasında; metakroilamido antipirin (MAAP) fonksiyonel monomer olarak kullanılmış ve kalıp iyon olan Fe(III) ile etkileştirilerek, MAAP-Fe(III) ön-kompleksi hazırlanmıştır. Sentezlenen önkompleks kullanılarak Fe(III) baskılanmış P(MAAP-Fe(III)-PQS) polimerik kuartamin simektit nanokompozit, sıcaklığa duyarlı Fe(III) iyonu baskılanmış P(NIPA-Fe(III)-MAAP) polimerik partiküller ve Fe(III) baskılı P(EDMA-Fe(III)- MAAP) mikrokürelerin sentezi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra bu yapılardan, kalıp Fe(III) iyonu 4 M HNO3 ile uzaklaştırılmış ve Fe(III) iyonunu tanıyan bağlama bölgelerine sahip üç farklı katı destek elde edilmiştir. İkinci aşamada; bu katı desteklerin yapıları karakterizasyon çalışmalarıyla doğrulanmış ve bu desteklerin Fe(III) iyonlarının adsorpsiyon-desorpsiyon işlemlerinde kullanılabilirliği, adsorpsiyon izotermleri, diğer iyonlarında bulunduğu ortamda Al(III), Co(II), Zn(II), Cu(II), Ni(II), Fe(III) iyonlarına seçicilikleri ortaya konularak karşılaştırılmıştır. Son aşamada ise; katı desteklerin analitik uygulamalarda kullanılmasına yönelik olarak sulu çözeltilerdeki Fe(III) iyonlarının Fe(III) belleklere sahip katı desteklerle kesikli sistemlerde önderiştirmeleri ve atomik spektroskopi yöntemleriyle tayin performansı incelenmiştir. Anahtar Kelimeler:Moleküler baskılanmış polimerler, İyon baskılanmış polimerler, Nanokompozit, Demir, Organokil, Katı- faz ekstraksiyonu, Sıcaklık duyarlı polimerler, Önderiştirme,