Farklı lösemi tiplerinde nükleer manyetik rezonans tabanlı metabolomik profilleme

Lösemi, çocukluk çağında %30'luk oran ile en sık görülen kanser türü olup, tüm kanserler içerisinde 3.2%' lik oranı kapsamaktadır. Lenfomalar ise orijin aldığı doku açısından lösemi ile ayrışmakla beraber ortak semptomlar gösterebilmektedir. Hastalık gelişiminde temelde beyaz kan hücrelerinin kemik iliği/ lenfoid organlardaki maturasyon bozukluğu yer almaktadır. Literatürde lösemi ve lenfomada metabolik profilleme çalışmaları mevcut olup, belirlenen biyobelirteç adayı metabolitlerin erken tanı, prognoz, tedaviye cevapta kullanılabilirliği tartışılmaktadır. Yüzlerce metaboliti kapsayan metabolomiks çalışmalarında çok yönlü istatistiksel modelleme kullanılarak bu aday belirteçlerin ilişkili olduğu yolaklar belirlenebilmekte, kişiselleştirilmiş tedaviler için değerli bilgiler sunulabilmektedir. Bunu mümkün kılan analitik kimya tekniklerinden ve metabolomiksin en önemli enstrümanlarından nükleer manyetik rezonans (NMR) ile kütle spektrometresi (MS), birbirini tamamlayıcı şekilde farklı moleküllerin ölçümünde başarılıdır ve entegre analizlerde analit spektrumun tamamına yakınını kapsamaktadır. NMR; yüksek tekrarlanabilirlik, tek internal standartla yüzlerce metabolit kantitasyonuna olanak vermesi, uzun stabilite, kalibrasyon gerektirmemesi gibi avantajlarıyla son yıllarda metabolomikste artan sıklıkta kullanılmaktadır. Öte yandan rutin kullanımı oturmuş MS ise yüksek sensitivitesi ve proteomik-lipidomik moleküllerin başarılı tespiti ile pratik kullanımda halen en ön sırada yer almaktadır. Güncel tez çalışması, sık görülen lösemi/ lenfoma tiplerini kapsayacak şekilde bütüncül yaklaşımla kantitatif NMR ve kalitatif MS metodlarını entegre eden bir çalışma düzeni içerisinde gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla her bir grupta (AML, KLL, NHL) yer alan 30 yetişkin hastaya ait serum ile lökosit izolatlarında bir ve iki boyutlu 1H NMR ile yüksek-rezolüsyonlu MS (HR-MS) analizleri tamamlandıktan sonra diferansiyel metabolitler ile ilgili metabolik yolaklar tek değişkenli-çok değişkenli istatistiksel metotlarla MetaboAnalyst ve TidyMass çevrimiçi platformlarında belirlenmiştir. 1D deneylerde kimliklendirilen metabolitler, 2D NMR analizleri ile doğrulanmıştır. Lökosit izolatları ise HRMS platformunda serum örnekleri ile eşit koşullar altında çalışılarak bu matrikste kontrollere kıyasla anlamlı eksprese edilen metabolitler belirlenmiştir (TidyMass). Serum NMR analizlerinde ortaya konan bulgulara göre; AML grubunda kontrol bireylere kıyasla artış gösteren metabolitler (VIP skoru> 1) metilguanidin, izobütirat, glisin, 2-hidroksiizobütirat, glukoz, üre, betain ve azalanlar (VIP skoru> 2) piroglutamat, 3-hidroksiizovalerat, alanin olarak kaydedilmiştir. KLL grubunda artan metabolitler içerisinde AML ile ortak bulunanlar haricinde kreatinin-kreatin fosfat, tirozin ve fosfoetanolamin molekülleri de yer almaktadır. Burada her üç grupta da artan moleküllerin protein degredasyon ürünü olmaları, hematolojik malignitelerde gözlenen hızlı protein turnoverını doğrulamaktadır. VIP skoru 2.5' ten büyük bulunan fumarat ve asetat moleküllerinin azalışı da KLL ve NHL gruplarında ortak öne çıkan farklılıklar olarak Krebs siklusu ara bileşenlerinin prolifere olan lökoblastlarda yoğun tüketimine işaret etmektedir. Ayrıca NHL grubuna özgü bir farklılık olarak düşük bulunan serum karnitin seviyesi (VIP skoru> 1), lenfoma hastalarında artan enerji ihtiyacının beta oksidasyon artışı ile kompanse edildiğini düşündürmektedir. Serum NMR sonuçlarını kapsayan alıcı özelliği (ROC) analizi ile AML için 10, KLL için 3 ve NHL için 20 en anlamlı metabolit ile eğri altı alanı> 0.98 olan tanısal biyobelirteç modelleri oluşturulmuştur. Grup bazlı değişim gösteren yolak analizlerinde glutatyon, glukojenik ile dallı zincirli amino asit metabolizması ve kolin oksidasyonu AML' de birinci sıradayken; KLL ve NHL gruplarında ise Krebs ve üre siklusu öne çıkmaktadır. Serum HRMS sonuçlarında ise yüksek sensitif metodoloji yardımıyla çeşitli polar lipitler (yağ asitleri ve fosfolipitler) tanımlanarak özellikle AML grubunda anlamlı artan doymamış yağ asitleri dokozatrienoik ve cis-13-dokozenoik asit (p=0.002 ve 0.003, sırasıyla, Tidymass) olarak kaydedilmiştir. Serum HRMS sonuçlarına göre KLL grubunda anlamlı bulunan oleamid artan ve gliserofosfokolin ile piroglutamat ise NMR sonuçlarını doğrulayan şekilde düşük seviyelerde bulunmuştur (p=0.001 ve 0.000, sırasıyla, Tidymass). Öte yandan NHL serum HRMS bulguları artan doymamış yağ asitleri açısından AML ve oleamid açısından KLL ile; azalan piroglutamat seviyeleri açısından ise KLL ile benzerlik göstermektedir. Lökosit izolatlarında gerçekleştirilen HRMS analizlerinde ise seruma göre daha az sayıda anlamlı metabolit tanımlanmış olup; spermin ve uzun zincirli yağ asitlerinin (serumda sonuçlarını destekleyen biçimde) artan, biyotin gibi koenzimlerin ise düşük seviyeleri her üç grupta da ortak olarak kaydedilmiştir. Sonuç olarak güncel çalışmada, lösemi/ lenfoma hastalarında NMR ve MS metodolojilerinin komplementer kullanımı ile oldukça geniş metabolit spektrumu içeren serum-lökosit matriks profillemesi gerçekleştirilmiştir. Literatürde bir ilk olarak, farklı hematolojik malignitelerde serum metabonomu kantitatif yaklaşımla belirlenmiş ve HR-MS teknolojisi ile yapılan global tarama ile entegrasyon sağlanarak geniş kapsamlı parametre araştırması yapılmıştır. Bir diğer yenilik ise, global serum araştırması yanı sıra lökosit izolatlarında MS analizi ile hücresel düzeyde anlık metabolik profilleme ile bireysel etyolojilere dair önemli veriler sunulmasıdır. Grup bazlı değişiklikleri ortaya çıkaran mevcut bulgular bireysel itici güçlerin yanı sıra farklı alt sınıflarda yaygın olarak gözlemlenen patojenik mekanizmalar hakkında da ipuçları sağlamaktadır. Tüm bunlarla birlikte sunulan güncel sonuçların, her grup için oluşturulacak geniş kohort ve omiks teknolojilerinden gelen tamamlayıcı veriler ile doğrulanması gerekmektedir.