Üç gün hastalığı virusu Türkiye izolatının tüm genom sekanslanması ve bu virusa karşı DNA aşısı geliştirilmesi

Bovine ephemeral fever (BEF) yüksek verimli sığır ve mandalarda önemli kayıplara yol açabilen, kısa süreli klinik tablo ile karakterize arboviral bir hastalıktır. Bu tez çalışmasında öncelikle, Türkiye'de 2012 yılında ortaya çıkmış BEF salgınından izole edilen bovine ephemeral fever virüs (BEFV)'ün ileri düzeyde genetik karakterizasyonu amaçlanmıştır. Ayrıca mevcut tez çalışmasında, BEFV glikoprotein (G) ve BEFV nükleoprotein (N) gen bölgelerini içeren rekombinant vektörün oluşturulması ve rekombinant vektörlerle immunize edilen BALB/c farelerinde bu proteinlere karşı humoral immun cevabın uyarımı hedeflenmiştir. Genetik karakterizasyon amacıyla BEFV tam genomunu kapsayan 600-800 bç kısmi gen bölgeleri RT-PCR ile çoğaltılmıştır. ABI 310 Genetik analiz® sisteminde çift yönlü okutulan gen ürünleri ClustalW programı ile hizalanmış ve veriler gen bankasına sunulmuştur. Filogenetik analiz işlemi MEGA5 paket programı ile gerçekleştirilmiş farklı izolatlarla benzerlikleri yönünden kıyaslanmıştır. Sonuçlar, BEFV izolatları arasındaki filogenetik ilişkilerin coğrafi konumla yakından ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca izolatlar arasında genetik rekombinasyon durumuna rastlanmamıştır. Rekombinant vektör oluşturulması ve immunizasyon çalışması amacıyla BEFV G ve BEFV N genleri pcDNA4/HisMax© TOPO® TA ekspresyon vektörüne aktarılarak TOP10 kompeten hücrelerinde çoğaltılmıştır. pcDNA4-G ve pcDNA4-N plazmidleri öncelikle Vero E6 hücrelerine transfekte edilerek, Vestern blot ve immunoperoksidaz testleri ile protein düzeyinde ve RT-PCR testi ile mRNA düzeyinde ekspresyonları gösterilmiştir. Uygun plazmidler lipofektamin 2000 ile muamele edilerek 0., 14., 21. günlerde BALB/c farelerine kas içi uygulanmıştır. İmmunize farelerdeki antikor yanıt plak redüksiyon nötralizasyon testi (PRNT) ve ELISA testleri ile ölçülmüştür. BEFV G ve N indirek ELISA sonuçlarına göre bu gruplardaki yedi hayvandan yalnızca ikisi cutoff düzeyini aşabilmiştir. pcDNA4-N ve pcDNA4-G immun gruba ait 450 nm absorbanstaki ortalama OD değeri plazmid kontrol grubu ile kıyaslandığında fark 30. günde istatistiki olarak anlamlı hale gelmiştir (p<0.001), (p<0.05). PRNT50 sonuçlarına göre pcDNA4-G (100 µg) ile immunize farelerde 30. günde 1:20 (p<0.05) düzeyinde antikor yanıt alınırken BEFV (1000 PFU/0.5ml) verilen farelerde ise bu oran 1:80'e (p<0.001) ulaşmıştır. Sonuç olarak rekombinant proteinlerin üretimi ve rekombinant vektörler ile immunize edilen deney farelerinde humoral yanıtın uyarımı noktasında başarı sağlanmıştır.