Sequence analysis
110 theses under this subject heading
Tekirdağ ilinde bazı kabakgil virüslerinin araştırılması ve karpuz mozaik virüsü (watermelon mosaic virus, wmv)'nün moleküler karakterizasyonu
Bu çalışmada, Tekirdağ ili genelindeki kabakgil üretim alanlarında Watermelon mosaic virus (WMV), Papaya ringspot virus-Watermelon (PRSV-W) ve Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)'nin belirlenerek, virüs izolatlarının genotipik yakınlık düzeylerinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. 2017 ve 2019 yıllarında yapılan arazi survey çalışmalarında viral enfeksiyon belirtileri gözlenen kabakgil bitkilerine ait yaprak örnekleri toplanarak DAS-ELISA ile ZYMV, PRSV-W ve WMV varlığı açısından test edilmesi sonucunda 180 adet bitki örneğinin %4,44 oranında WMV ile enfekteli olduğu belirlenmiştir. Toplanan bitki örneklerinden ELISA testleri sonucunda pozitif çıkan veya tipik virüs belirtisi gösteren 30 adet bitki örneği seçilerek WMV NIb-CP, PRSV-W ve ZYMV CP gen bölgesine spesifik oligonükleotitler ile Real-Time PCR ve RT-PCR kullanılarak test edilmiştir. Reverse Transcriptase PCR çalışmaları sonucunda 12 adet bitki örneğinde WMV'ye ait yaklaşık 408 bp boyutundaki bant oluşumu gözlenmiş, dizileme sonucunda 12 WMV izolatının NIb-CP genine ait 342 ve 348 nükleotidin filogenetik analiz çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışma kapsamında elde edilen WMV izolatlarının Gen Bank'asına kayıtlı bazı WMV izolatları ile benzerlikleri açısından kıyaslamalar yapılmıştır. Bu çalışmada elde edilen 342 nükleotid uzunluğunda WMV NIb-CP geni kodlayan kısmın sekans analizleri sonucunda TR-Tn2 (MT448602), TR-Tn5 (MT448603), TR-Tn8 (MT448604), TR-Tn9 (MT448605), TR-Tn10 (MT448606), TR-Tn18 (MT448607), TR-Tu75 (MT448612) ve TR-Tu80 (MT448613) izolatları İtalya (EU660590), Fransa (NC_006262 ve JF273459), Türkiye (EU660579), Şili (EU660582), Pakistan (AB218280) izolatları ile %99.7-95 arasında benzerlik göstermiş ve Moleküler Grup 1'de yer almıştır. TR-Tf50 (MT448610), TR-Ta63 (MT448608), TR-Ta64 (MT448609) ve TR-Ts71 (MT448611) izolatlarının WMV NIb-CP kodlayan 348 nükleotid kısmının analizi sonucunda Güney Kore (AB369278), Çin (EF127832 ve DQ399708), Güney Kore (MN854651) ve Japonya (AB353119) izolatları ile %98,2-92.2 arasında değişen oranlarda benzerlik göstermişler ve WMV Moleküler Grup 3'te yer almışlardır.
Boruta ve elastik ağ algoritmalarının gen seçim performanslarının RNA dizileme veri setleri üzerinde karşılaştırılması: Bir monte carlo benzetim çalışması
Kanser Genom Atlası Programından elde edilen farklı kanser türlerine ait sekiz gerçek RNA dizileme veri seti kullanılarak ilgili kanser hastalığına önemli derecede etki eden genlerin seçilmesinde, Boruta Algoritması ve Elastik Ağ Genelleştirilmiş Doğrusal Modeller İçerisinde Determan'ın Algoritması uygulanmıştır. Boruta Algoritmasının kendi içerisinde bulunan, sınıflandırma yöntemlerine ve önemlilik ölçütlerine göre farklılaşan yöntemlerden yedi tanesine ait algoritmalar, ayrı ayrı olarak uygulanmış ve elde edilen sonuçlar sadece Elastik Ağ Algoritması ile değil aynı zamanda birbirleri ile de kıyaslanmıştır. Gerçek veri setlerine dayalı olarak bir Monte Carlo benzetim çalışması yapılmıştır. Özellik seçiminde kullanılan gen setleri; filtreleme, normalleştirme, dönüşüm ve tek değişkenli analiz olmak üzere dört aşamada ön işleme adımları uygulanarak elde edilmiştir. Özellik seçimi yöntemlerinin performansları Pozitif Kestirim Değeri, Duyarlılık, F1 Ölçüsü gibi ölçüler kullanılarak karşılaştırılmıştır. Çalışmada kullanılan veri setlerinin tümünde Elastik Ağ Algoritması, Pozitif Kestirim Değeri açısından öne çıkmıştır. Boruta Algoritmasının Ekstra Ağaçlar ve Random Ferns tabanlı yöntemleri, Duyarlılık Oranları açısından Elastik Ağ Algoritmasından daha iyi performans göstermiştir.
Hedef gen yeni nesil dizileme yöntemi ile Subakut sklerozan panensefalit (SSPE) hastalığı ilişkili gen mutasyonlarının tespiti
Subakut sklerozan panensefalit (SSPE) çocuk ve genç erişkinlerde kızamık infeksiyonu sonrası görülen ilerleyici nörodejeneratif hastalıktır. İlk bulgular bilişsel fonksiyonlarda kayıp, miyokloni ve davranış değişiklikleri şeklinde başlar. Daha sonra denge bozukluğu eklenerek hastalar yatağa bağımlı hale gelerek kaybedilir. Primer immün yetmezlik hastalıklarının her geçen gün farklı tabloları tanımlanmaktadır. Bu çalışmada SSPE'nin gelişiminde immünolojik mekanizmaların ortaya konulabilmesi için primer immün yetmezliklere yönelik olarak yeni nesil dizileme yapılması amaçlandı. Hacettepe Çocuk Nöroloji Bölümü'nde takip edilen 53 SSPE hastası çalışmaya dahil edildi. Tanıları klinik bulgulara, BOS kızamık indeksine ve EEG bulgularına göre konuldu. Dizileme işleminde Illumina 5 sistemi kullanıldı. Hastaların 42'si erkek, 11'i kadın olup ortalama yaş 16±3.2 yıldır. Hastalarda ortalama kızamık geçirme yaşı 24±18 aydır. Yapılan değerlendirmede 15 hastada hastalık yapıcı olduğu düşünülen varyant tespit edildi. MCM4 varyantı 5 hastada, TNFRSF13B varyantı 3 hastada, , IRF3 varyantı 2 hastada görüldü. Sadece bir hastada görülen varyantlar; SERPING1, TTC7A, DOCK8, LRBA, C1q, TYK2, LRRC8A mutasyonlarıdır. Çalışma sonucu bulunan varyantlar kızamık virüsü ile ilişkili olabilecek immün mekanizmaların belirlenmesinde yeni çalışmalara ışık tutacaktır.
Kolonik subepitelyal ve perikriptal myofibroblastlar için immunohistokimyasal belirteçlerin tanımlanması ve neoplastik süreçteki ifadelerinin araştırılması
Kolonik subepitelyal myofibroblastlar, lamina propriada kriptlerin hemen altında yer alan; yara iyileşmesi, epitel büyümesi, fibrozis, immuntolerans, inflamasyon, tümör invazyonu gibi birçok süreçte rol alan -SMA pozitif mezenkimal hücrelerdir. Kolonik lamina propriada subepitelyal myofibroblastlar haricinde -SMA boyanan başka mezenkimal hücreler de (örneğin perisitler) mevcuttur. Bu tez çalışmasının amacı; kolonik subepitelyal ve perikriptal myofibroblastlara spesifik bir immunbelirteç bulmaktadır. Çalışmaya Hacettepe Üniversitesi Tıp fakültesi'nde 2019 yıllında adenokarsinom nedeniyle kolektomi ameliyatı olan 20 adet vaka dahil edilmiştir. Olgulara ait normal kolon mukozasını temsil eden parafin bloklardan iki ayrı odak örneklenerek doku mikrodizini hazırlanmıştır. Mikrodizinden elde edilen seri kesitlere ZEB1, -SMA, Desmin, TMEM119, AOC3, PR2D3, MYH11, CD146, CD56 antikorları kullanılarak immünohistokimyasal çalışmalar uygulanmıştır. Ayrıca iki farklı doku mikrodizininde temsil edilen 28 kolorektal adenokarsinom TMEM119, AOC3 ve MYH11 ile boyanmıştır. Bu çalışmada literatürde ilk kez TMEM119 ile kolonik subepitelyal ve perikriptal myofibroblastların pozitif olduğunu göstermiştir. Myofibroblastlarda ZEB-1 ekspresyonu EMT'yi desteklemektedir. Kolorektal kanserlerde stromada myofibroblastik biyobelirteçlerde kayıp da gösterilmiştir.
Türkiye'nin çeşitli bölgelerindeki ruminantlardan izole edilen Brucella türlerinin tüm genom dizileme temelli analizi
Bu çalışma, Türkiye'de ve dünyanın birçok ülkesinde önemli bir hayvan ve halk sağlığı sorununa neden olan brusellozis etkenlerinin ruminantlardan izole edilen türlerine tüm genom dizileme (WGS) yapmak amacıyla yürütüldü. Bu kapsamda tek nükleotit polimorfizmleri (SNP) ile WGS-SNP tabanlı filogenetik analiz ve ikili SNP mesafesi hesaplama, WGS tabanlı virulens gen ve direnç gen analizleri gerçekleştirme, geleneksel mikrobiyolojik analizlerle identifikasyon ve biyotiplendirme, fenotipik antimikrobiyal direnç ve faj duyarlılık analizleri yapılarak, elde edilen veriler uyumluluk kapsamında birbiriyle karşılaştırıldı. Çalışmada Türkiye'nin çeşitli bölgelerindeki ruminantlardan izole edilen 21 adet ve insanlardan izole edilen iki adet Brucella spp. izolatı kullanıldı. Kültürel yöntemler, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve WGS analizleri sonucunda 11 adet Brucella melitensis, 12 adet B. abortus identifiye edildi. B. abortus izolatlarının tamamının sığır orijinli, B. melitensis izolatlarının ise koyun, keçi, koç ve insan orijinli olduğu belirlendi. B. abortus izolatlarının 11 (%91,66) adedi biyovar (bv) 3, bir adedi (%8,33) B. abortus bv 9 olarak, B. melitensis izolatlarının 9 (%81,8) adedi B. melitensis bv 3, birer adedi bv 1 ve bv 2 olarak biyotiplendirildi. Tüm genomu dizilenen 23 adet izolatın ortalama GC içeriği %57, genom uzunluğu ise 3,2 megabaz (mb) olduğu belirlendi. Tüm genom SNP tabanlı oluşturulan filogenetik ağaçlandırmada B. melitensis suşlarının tamamının Doğu Akdeniz soyu ile ilişkilendirilen genotip II'nin IIb alt genotipinde yer aldığı tespit edildi. IIb alt genotipinde üç ayrı kümelenme sergileyen yerel izolatlarımız arasında en fazla SNP mesafesinin Siirt ve İstanbul menşeili izolatlar (22RB24671) arasında olduğu tespit edildi. B. abortus izolatlarıyla oluşturulan WGS-SNP tabanlı filogenetik ağaca göre yerel izolatların tamamının C1 kladında yer aldığı görüldü. C1 kladında iki ana kümelenme gösteren yerel izolatlardan Iğdır ili izolatlarının tamamı ve Şanlıurfa/Hilvan ile İstanbul (22RB24674) izolatları İran menşeili suşlarla bir kümelenme oluştururken diğer B. abortus izolatları Çin menşeili suşunda yer aldığı ikinci kümelenmeyi meydana getirdi. Gerçekleştirilen ikili SNP mesafesi karşılaştırma analizinde yerel B. abortus izolatları arasında SNP farkının 0-316 arasında değiştiği belirlendi. Aynı dönemde ve aynı sürüdeki farklı hayvanlardan izole edilen bazı B. melitensis ve B. abortus izolatlarında SNP farkı olmadığı tespit edildi ve bu durum ortak bir bulaş kaynaklı enfeksiyon olarak değerlendirildi. Çalışmaya dahil edilen 23 adet B. abortus ve B. melitensis izolatlarının WGS verileri ile gerçekleştirilen virulens gen analizinde tür, konakçı ve izolasyon yılı fark etmeksizin tüm suşlarda 43 adet virulens geni ile ilişkili bölge tespit edildi. Tespit edilen genlerin büyük bir kısmının kromozom I (Chr I) üzerinde yer aldığı ve lipopolisakkarit (LPS) ile tip 4 salgı sistemiyle (T4SS) ilişkili genlerin çoğunlukta olduğu belirlendi. Gerçekleştirilen WGS tabanlı antimikrobiyal direnç gen analizinde kontrol edilen klasik dirençle ilişkili genler tespit edilmezken, fenotipik direnç analizinde B. abortus izolatlarının %58,33'ü test edilen antibiyotiklerin en az ikisine dirençli bulundu. B. melitensis izolatlarında bu oranın %63,63 olduğu tespit edildi. Sonuç olarak brusellozisin en yaygın iki etkeni olan B. melitensis ve B. abortus izolatlarının WGS tabanlı ileri epidemiyolojik analizi gerçekleştirilerek Türkiye'de dolaşımda olan genotipler belirlendi. Bu verilerin ülkede hastalığın izlenmesi ve salgınların kontrolü açısından önemli olduğu, antimikrobiyal dirençliliğin kaygı verici boyuta ulaştığı ve izlenmesi gerektiği kanısına varıldı.
Erken başlangıçlı inflamatuvar bağırsak hastalığı ve inflamatuvar bağırsak hastalığı benzeri kronik ishali olan çocukların sorumlu genler açısından araştırılması
İnflamatuvar bağırsak hastalığı (İBH), gastrointestinal sistemin kronik inflamatuvar bir hastalığıdır. Altı yaşından önce başlayan İBH çok erken başlangıçlı İBH, on yaşından önce başlayan İBH erken başlangıçlı İBH olarak sınıflandırılır. Özellikle çok erken başlangıçlı İBH'de genetik yatkınlığın önemli olduğu bilinmektedir. Erken başlangıçlı İBH ve benzeri hastalıkların patogenezinde monogenik nedenlerin daha sık olduğu düşünülmektedir. Çalışmamızın amacı, erken başlangıçlı İBH ve İBH benzeri kronik ishal patogenezinde rol alan sorumlu genleri araştırmaktır. Çalışmaya, Hacettepe Üniversitesi Çocuk Gastroenteroloji, Hepatoloji ve Beslenme Ünitesi'nde erken başlangıçlı İBH veya İBH benzeri kronik ishal nedeniyle izlenmekte olan 0-18 yaş arasındaki hastalar dahil edildi. Çalışma başlamadan önce klasik Sanger dizileme çalışması ve yeni nesil dizileme ile monogenik hastalık tanısı almayan hastalara tüm ekzom dizi analizi yapıldı. Çalışmaya 47 hasta [14 kız (%29,8), 33 erkek (%70,2)] dahil edildi. Semptomların başlama yaşı ortancası 36 ay (IQR 10-72) ve İBH tanı yaşı ortancası 3,7 yıldı (IQR 1,5-7,6). Yirmi beş hastada (%53,2) Crohn hastalığı, 18 hastada (%38,3) ülseratif kolit ve dört hastada (%8,5) indetermine kolit vardı. Dokuz hasta Ailevi Akdeniz Ateşi, iki hasta glikojen depo hastalığı tip 1b, bir hasta XIAP defekti, bir hasta kronik granülomatöz hastalık, bir hasta DOCK8 defekti, bir hasta IL10 reseptör alfa defekti, bir hasta LRBA eksikliği ve bir hasta NFKB2 eksikliği tanısı aldı. Çalışmamızda on yedi hastada (%36,2), erken başlangıçlı İBH'ye neden olabilecek monogenik neden saptandı. Otuz altı hastada (%76,6) SLC29A3 geninde varyant saptanmış olup; daha önce İBH ile ilişkili literatürde yer almamıştır. Bu varyantın İBH'li hastalarda önemli olabileceği düşünülmüştür. Çalışmada bulunan diğer varyantların İBH'ye yatkınlık yaratabileceği düşünülebilir.
Cloning of astacus leptodactylus ryanodine receptor gene
Cytoplasmic Ca2+ concentration plays an essential role in many types of cellular function including electro-mechanical coupling in striated muscle fibers. Ryanodine receptor channels (RyR), mediating Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum (SR), has a homotetrameric structure. It is the largest ion channel with a size of 2.2 MDa. Vertebrate and invertebrate RyR channels are structurally and functionally similar. Although Astacus leptodactylus, narrow-clawed crayfish, is a widely used model animal in neuroscience, information about genetic properties of the animal is rather limited. The present study is focused onto de novo cloning of the mRNA of the crayfish RyR channel which encodes the largest ion channel. A hybrid cloning method has been used, referring to the homology between RyR mRNA molecules and the computational assembly of the next generation sequencing data. A mRNA molecule of 15236 bp in size has originally been cloned. The putative RyR protein, with 5042 amino acids, has a significant similarity to the sequences reported in other species. Furthermore, the putative sequence possessed many of the conserved domains specific to the RyR channel. Thus, it has been proposed that a mRNA coding RyR channel has originally been cloned in the present study. The 3D protein structure can also be determined by the help of this revealed genetic information, or future mutation studies can be designed.
DOCK8 eksikliği olan hastalarda T hücre reseptör repertuvarının yeni nesil dizileme ile belirlenmesi
Primer immün yetmezliklerde immün repertuvarın tanımlanması ve adaptif immün yanıtların karakterizasyonu hastalıklara yaklaşım ve hastalıkların değerlendirilmesi açısından önemlidir. İmmün repertuvarın oluşumda en önemli faktörlerden biri V(D)J rekombinasyonudur. T hücre reseptörünü oluşturan V (variable), D (diversity) ve J (joining) genlerinin rekombinasyonu sonucu oluşan çeşitlilik, farklı antijenlere bağlanmadaki en önemli bölge olan CDR3 (complementarity determining region 3) bölgesi, yeni nesil dizileme teknolojileri ve biyoinformatik programları kullanılarak araştırılabilmektedir. Bu çalışmada, DOCK8 eksikliği tanısı almış hastalarda T hücre reseptör repertuvarı araştırılmıştır. Öncelikle hastalardan lenfosit izolasyonu gerçekleştirildi. Lenfositlerden, manyetik negatif seperasyon yöntemi ile, CD4+ ve CD8+ T hücreler izole edildi. Elde edilen CD4+ ve CD8+ T hücrelerden total RNA izolasyonu yapıldı, konsantrasyon ölçümü ile total RNA miktarları kaydedildi. SMARTer teknolojisi ile TRB zincir amplifikasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen diziler Illumina Miseq kullanılarak dizilendi. Çıkan sonuçların biyoinformatik ve istatistik analizleri Cogent, Immunarch ve IMGT programları aracılığı ile yapıldı. Hastaların ve kontrollerin CD4+ T hücre repertuvar çeşitliliği ve eşsiz klonotip sayıları arasında anlamlı farklılık elde edilmedi. Hastaların CD4+ T hücre V-J gen kullanımlarının kontrollerden farklı profilde olduğu görüldü. Hastaların CD8+ T hücre repertuvar çeşitliliği ve eşsiz klonotip sayılarında kontrole oranla belirgin düşüklük saptandı. Hastaların CD8+ T hücrelerinde farklı V-J genlerinin kullanım frekanslarının kontrole oranla belirgin olarak düşük olduğu gözlemlendi. CD8+ T hücrelerin CDR3 uzunluklarının dağılımının CD4+ T hücrelere oranla düşük olduğu sonucu elde edildi. Elde edilen sonuçlarda DOCK8 eksikliği olan hastaların CD8+ T hücre repertuvarlarının belirgin şekilde etkilenmesi, DOCK8 mutasyonlarının CD4+ ve CD8+ hücre repertuvarının oluşumunda etkisi olabileceğine ve DOCK8 proteininin hücre farklılaşmasında rolü olabileceğine dair ipuçları vermektedir. Bu çalışma, DOCK8 eksikliğinde görülen hücre içi patojenlere ve kutanöz enfeksiyonlara yatkınlığın, CD8+ T hücre repertuvarının etkilenmesi sebebiyle oluşabileceğine dair fikir vermektedir.
Karakterize edilemeyen kalıtsal kemik iliği yetmezliklerinde genetik nedenlerin araştırılması
Kalıtsal Kemik İliği Yetmezliği Sendromları hematopoez sürecinde tek bir hücre serisinde azlık şeklinde ortaya çıkabildiği gibi ikili ya da üçlü seride yetmezlik şeklinde de ortaya çıkabilen heterojen bir hastalık grubudur. Klasik örneklerini Fanconi Anemisi, Diskeratozis Konjenita, Shwachman Diamond Sendromu gibi hastalıklar oluştururken, bilinen kemik iliği yetmezlikleri ile uyumlu olmayıp, bir ya da daha fazla hücre hattındaki kemik iliği yetmezliğine diğer sistemik bulguların eşlik ettiği heterojen hastalık grubu "Karakterize Edilemeyen Kemik İliği Yetmezlikleri" olarak tanımlanmaktadır. Bu tez çalışmasında, Türkiye genelinden karakterize edilemeyen kemik iliği yetmezliği ön tanısı ile gönderilen 17 indeks vaka öncelikle genom boyu kopya sayısı değişiklikleri açısından değerlendirilmiş ardından tüm ekzom dizileme yöntemi kullanılarak incelenmiştir. 7 hastada daha önce kemik iliği yetmezliği ile ilişkilendirilen telomer boy sürdürülmesinde, amino asit metabolizmasında, ribozom maturasyonunda, vitamin metabolizmasında ve diğer hücresel süreçlerde görevli genlerde nedensel varyantlar saptanırken 1 hastada klinik önemi bilinmeyen kopya sayısı değişikliği gözlenmiştir. Bunlara ek olarak, kemik iliği yetmezliği, gelişme geriliği ve dismorfik bulgulara sahip bir birey ile etkilenmiş kardeşinin de yer aldığı çekirdek ailesinde homozigotluk haritalaması yapılarak p53 ilişkili apoptoz yolaklarında görevli ve şu ana kadar kalıtsal kemik iliği yetmezliği fenotipi ile ilişkilendirilmemiş olan güçlü bir aday gene ulaşılmıştır. Sonuç olarak, bu tez çalışması ile karakterize edilemeyen kemik iliği yetmezlikleri başlığı altında genetik ve fenotipik açıdan oldukça heterojen bir grup hasta ile karşı karşıya kalındığı, harman fenotipler ve germline mutasyona eklenen somatik değişikliklerin yüksek fenotip çeşitliliği gösteren bu grupta ayırıcı tanıyı zorlaştırdığı ortaya konmuştur.
Mycobacterium tuberculosis klinik izolatlarında yeni antitüberküloz ilaçlar olan bedaquiline ve Delamanid'in MİK değerlerinin ve dirence neden olan mutasyonların saptanması
Bu çalışmanın amacı, dirençli tüberküloz hastalarından izole edilen 101 M. tuberculosis klinik izolatının bedaquiline ve delamanid minimal inhibitör konsantrasyon (MİK) değerlerinin fenotipik olarak MGIT-960 otomatize sıvı kültür sisteminde bir araştırma yazılımı olan TB/eXİST ile saptanması ve dirence neden olan mutasyonların Sanger dizileme ve tüm genom analizi (WGS) yöntemleriyle genotipik olarak araştırılmasıdır. Suşların 31'i İsviçre Zürih Üniversitesi'nde, 70'i ise Türkiye'deki hastalardan izole edilmiştir. İsviçre suşlarında bedaquiline ve klofazimin arasında çapraz direnç varlığı da araştırılmıştır. Fenotipik duyarlılık sonuçlarına göre İsviçre ve Türkiye suşlarının bedaquiline, delamanid ve yalnızca İsviçre suşlarının klofazimin MİK dağılımları ve ortalama MİK değerleri sırasıyla <0,2 µg/ml ile ≥4,0 µg/ml arasında (ortalama MİK=0,92 µg/ml), ≤0,01 µg/ml ile ≥3,2 µg/ml arasında (ortalama MİK=0,18 µg/ml) ve ≤0,5 µg/ml ile ≥2,0 µg/ml arasında (ortalama MİK=1,11 µg/ml) saptanmıştır. İsviçre suşlarının bedaquiline MİK değerleri, Türkiye suşlarına göre daha yüksek bulunurken, Türkiye suşlarının delamanid MİK değerleri İsviçre suşlarına göre daha yüksek bulunmuştur. Dünya Sağlık Örgütü'nün Kritik İlaç Kosantrasyonları Raporu'na göre çalışmamızdaki tüm suşlar ortalama MİK değerlerine göre bedaquiline duyarlı bulunurken, delamanid ve klofazimine dirençli bulunmuştur. Bedaquiline ve klofazimin MİK değerleri yüksek suşlarda çapraz dirençten sorumlu olan mutasyon, Sanger dizileme ile saptanamamıştır, dirence neden olan yeni mutasyonun saptanması için ileri çalışmalar yapılması gerekmektedir. Bakteri genomunda bulunan ve tüm ilaçlara karşı gelişen direnç profillerini saptamak amacıyla bir WGS protokolü optimizasyon çalışması yapılmıştır. 25 suşun genomunda bulunan dirençle ilişkili varyantlar saptanabilmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada ÇİD-TB tedavisinde yakın zamanda ülkemizde de kullanıma girmesi beklenen yeni ilaçlar için Türkiye M. tuberculosis suşlarının ön duyarlılık verisi elde edilmiştir. MGIT-960 sistemiyle entegre edilen araştırma yazılımı ve optimize edilmiş WGS protokolünün ÇİD-TB hastalarının kişiselleştirilmiş tedavilerinin belirlenebilmesinde kullanılabileceği düşünülmektedir.
Count based clustering and classification of RNA-seq data
In molecular biology, gene-expression based studies are frequently used for examining transcriptional activities in different tissue samples or cell populations. Gene expression data can be used for different tasks; e.g differential expression, classification and clustering. In this thesis we focused on clustering and classification of gene expression data obtained from RNA sequencing experiment. Poisson (PLDA) and negative binomial (NBLDA) linear discriminant analyses are selected as discrete, and nearest shrunken centroids (NSC) are selected as continuous classifiers in classification part. We proposed an extension of NBLDA as sparse classifier and compared its performance with other classifiers. In clustering part, we used k-means and hierarchical clustering as continuous, and Poisson and negative binomial clustering as discrete approaches. A comprehensive simulation study is conducted for classification part under different scenarios. Furthermore, we used three different real data sets. Simulation results showed that overdispersion has an important effect on model performances. Overall, discrete models performed better in classification. Among discrete classifiers, NBLDA outperformed PLDA when data set is highly overdispersed. Moreover, our proposed algorithm performed better than NBLDA algorithm in terms of prediction accuracy and sparsity. We also applied the same classifiers to three real data sets and found that results agree with the simulation results. Clustering, on the other hand, is applied to real data sets only. Unlike classification, discrete and continuous clustering approaches performed similar on two real data sets. We did not perform a simulation study for clustering scenarios due to several reasons: (i) simulations were computationally intensive, and (ii) dissimilarity matrices cannot be calculated when data set had several thousands of features. Therefore, we were not able to generalize clustering results. In conclusion, discrete statistical approaches should be preferred for classification while discrete or continuous approaches can be preferred for clustering purpose. However, if visualizing data is of interest in clustering, data should be transformed for better graphical results.
Exom veri setinden hastalığa özgü varyant veri tabanı oluşturulması
İnsan Genom Projesi ile insan referans genom dizisinin oluşturulması ardından ileri nesil dizileme teknolojileri ile katlanarak artan sayıda bireyin genomik dizileri ortaya çıkarılmaya devam etmiştir. Böylece, insanlar arasında genomik dizide milyonlarca farklılığın (varyantın) olduğunu görülmüştür. Bu genetik varyantların bir kısmının genetik hastalıklara sebep olduğu bilinmektedir; ancak bir dizileme analizinde ortaya çıkan pek çok varyanttan hangisinin hastalıkla ilişkili olduğunu saptamak zordur. Bu tezin amacı, genetik hastalık şüphesi olan kişilerden ekzom dizilemesi yapılarak elde edilen genetik varyant verilerinin Türk populasyonuna özgü verileri içeren bir varyant veri tabanı oluşturmakta kullanılması ve karşılaştırmalı varyant analizi için bir platform sağlanmasıdır. Bu amaçla, veri tabanı yönetim sistemi olarak MS-SQL; uygulama arka yüz teknolojisi olarak ASP .NET MVC; nesne ile ilişkisel haritalama/eşleme aracı olarak Entity Framework; ön yüz teknolojisi olarak ise HTML5, CSS teknolojileriyle Bootstrap, Javascript ve Jquery kütüphaneleri kullanılmıştır. Kurulan sistem, Ion Reporter yazılımı aracılığıyla anote edilen tabuler dosya formatlarını (.tsv, .csv gibi) kullanan genişletilebilir bir veri tabanıdır. Veri tabanında çeşitli varyant özelliklerine göre sorgu yapılabilmektedir. Ayrıca, veri tabanındaki hastaya özgü varyantlar, hastalık tipine ve kalıtım modeline göre 3 farklı modda, kurumsal ve uluslararası varyant veri tabanlarındaki varyant sıklıklarına ve varyantların pozisyonu/etkisine göre karşılaştırmalı varyant filtrelenebilmektedir. Sonuçta, oluşturulan veri tabanı hastalıkla ilişkili olabilecek genetik varyantların Türk toplumuna özgü veriler kullanılarak hızlı ve etkin analizini sağlamakta ve büyük genetik verilerin analizini kolaylaştırmaktadır.
Solunum yolu hastalıklarında rol oynayan seçilmiş protein ve nükleik asitlerin dizi ve yapılarının moleküler modelleme yoluyla incelenmesi
Solunum yolu hastalıklarında rol oynayan seçilmiş protein ve nükleik asitlerin dizi ve yapılarının moleküler modelleme yoluyla incelenmesi Bu tezde, solunum hastalıklarında rol oynayan seçilmiş 7 mikroorganizmanın biyofilm oluşumunda önemli bir mekanizma olan Çevreyi Algılama Sistemi (Quorum Sensing) 'de görevli protein ve nükleik asitleri, moleküler modelleme ve dizi karşılaştırma yolu ile incelenmiştir. Proteinlerin amino asit ve nükleik asit dizileri https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ve https://www.uniprot.org/ veri tabanlarından alınmıştır. MEGA 7. 0. 26 programında ortak nükleik ve amino asit dizilerinin bulunması için dizi hizalama (alignment) yapılmıştır. PyCharm Community Edition 2018.3.4 programında oluşturulan algoritma ile bu dizilerin benzerlik yüzdeleri hesaplanmıştır. https://swissmodel.expasy.org/ veri tabanında bu proteinlerin 3 boyutlu yapıları oluşturulmuş ve UCSF Chimera 1. 13. 1 (University of California, 2000) programında bu modeller karşılaştırılmış ve ortak yapılar bulunmuştur. Fiziksel ve kimyasal özelliklerin incelenmesi amacıyla https://web.expasy.org/protparam/ veri tabanı kullanılmıştır. Sonuçta ise ortak diziler ve yapılar elde edilmiştir. Bu sonuçların biyofilm oluşumunu önleyici çözümler üretilmesine önemli katkılar sağlayabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler; Moleküler modelleme; Quorum Sensing; Solunum yolu hastalıkları; Biyofilm
Nanopore sekanslama teknolojisi kullanılarak, kişi tanımlama kiti geliştirilmesi
Amaç: İnsan Deoksiribo Nükleik Asidi (DNA) bilinen en stabil biyolojik materyallerden bir tanesi olup, kişiye özel bir çok tanımlama bölgesi içermektedir. Son yıllarda, DNA üzerindeki belirli Tek Nükleotid Polimorfizm'lerinin (Single Nucleotide Polymorphism-SNP) genotiplendirilmesi, özellikle kimliklendirme çalışmalarında giderek yaygınlaşan ve yüksek ayrım gücü sunan bir yöntemdir. Genotiplendirme işlemi, yeni nesil dizi analizi teknolojisindeki hızlı ilerlemeler sayesinde giderek pratikleşmiş olsa da bu cihazların birçoğunun uzun sürede sonuç vermesi ve büyük veri analizleri gerektirmesi, özellikle hızlı kimliklendirme gereken durumlarda büyük bir dezavantaj oluşturmaktadır. Bununla birlikte, 4. nesil olarak geçen Oxford Nanopore teknolojisini kullanan bir cihazın (Minion) uzun okumalar yapması, hızlı analiz ve küçük boyutları sayesinde sahada kullanıma imkan sağlaması, bu dezavantajları ortadan kaldırmıştır. Bu projede; Oxford Nanopore sekanslama platformuna uyum sağlayacak, teknolojik ve pratik SNP temelli bir kişi tanımlama prototipi geliştirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve yöntem: Ticari DNA kullanılarak, literatürde kişi tanımlama için sıklıkla kullanılan 52 SNP bölgesi multipleks Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction-PCR) metodu ile amplifiye edilmiştir. Bu amplikonlar Oxford Nanopore Minion cihazı ile sekanlanmıştır. Sekans verilerine göre özgün bir biyoinformatik iş akışı tasarlanmıştır. Bulgular: Üç ticari DNA örneği üzerinden yapılan çalışmalarda Nanopore verilerinin 52 SNP bölgesinde de tam olarak doğru sonuç verdiği gözlenmiştir. Toplam süre 1 saatin altında tamamlanmıştır. Sonuç: Bu tez sonucunda 52 adet SNP bölgesi Oxford Nanopore Minion cihazıyla başarılı bir şekilde sekanslanmıştır. Aynı zamanda SNP temelli kişi tanımlama için dünya üzerinde erişilmiş en hızlı süre elde edilmiştir.
CNTNAP2 ve SETBP1 varyantlarının gelişimsel dil bozukluğuna olası etkisinin araştırılması
Amaç: Gelişimsel dil bozukluğu (GDB), çocukların iletişim kurmalarını zorlaştıran en yaygın gelişimsel engellilik olup, normal dil gelişimindeki bozulmanın, işitme kaybı, nörolojik/psikiyatrik hastalıklar ve çevresel uyaranlardan yoksunluk ile açıklanamaması ile karakterizedir. GDB patogenezinde çevrenin yanı sıra, güçlü genetik faktörlerin de etkili olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada SETBP1 ve CNTNAP2 genlerindeki dizi varyasyonları ve suçlanan çevresel değişkenlerin GDB etiyolojisindeki rolünün belirlenmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Eylül 2022-Mart 2023 tarihleri arasında Necmettin Erbakan Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi (NEUTFH) Çocuk Ruh Sağlığı polikliniklerine başvuran, DSM-V ölçütlerine göre dil bozukluğu tanısı konulan, gelişim düzeyleri AGTE ile değerlendirilmiş olan, 2 - 7 yaş arasındaki otuz çocuk, etiyolojiden sorumlu olabilecek aday genler ve çevresel etmenler açısından incelenmiştir. NEUTFH Tıbbi Genetik polikliniklerine başvuran, vaka grubundakiler ile yaş ve cinsiyet bakımından benzer, altta yatan bir hastalığı olmayan otuz sağlıklı çocuk kontrol grubu olarak çalışmaya dahil edilmiştir. Her iki grubun periferik kanından izole edilen DNA örneklerinde SETBP1 ve CNTNAP2 genleri yeni nesil dizileme yöntemi ile analiz edilmiştir. Saptanan varyantların klinik önemini değerlendirilmiş ve gerekli vakalarda varyant doğrulama ve segregasyon analizleri Sanger dizileme ile yapılmıştır. Elde edilen veriler uygun istatiksel yöntemlerle karşılaştırılmıştır. Bulgular: En sık varyant türü, CNTNAP2 geninde intronik (%75), SETBP1 geninde missense varyantlar (%60) olmuştur. 29 SNV vaka ve kontrol gruplarında ortak izlenirken üç SNV (rs186624619, rs17170742, rs373599564) ve iki önemi bilinmeyen (CNTNAP2: c.973C>G:p.P325A ve CNTNAP2: c.2236G>A:p.D746N) varyant yalnızca vaka grubunda izlenmiştir. Nadir varyantlardan biri novel olup, her ikisinin in siliko analizleri çelişkili sonuçlar vermiştir.Yapılan segregasyon çalışmasında etkilenmemiş ebeveynden paternal kalıtıldıkları gösterilmiştir. Polimorfizmlerin vaka ve kontrol gruplarındaki sıklıkları kıyaslanmıştır. SETBP1 rs11082414 (G/C) varyantı için homozigot CC genotip sıklığı hastalarda kontrollere kıyasla anlamlı derecede daha yüksek bulunmuştur (p=0,024). Nongenetik faktörler incelendiğinde ise vaka grubunda ortalama doğum kilosu daha yüksek (p=0,043), ortalama laktasyon süresi daha düşük (p=0,044) bulunmuştur. Sonuç: Çalışmamızda aile öyküsü, erkek cinsiyet, 15 aydan az laktasyon süresi ve SETBP1 rs11082414-CC varyantının GDB için risk faktörü olabileceği sonucuna varılmıştır. Risk faktörlerini belirlemek, yüksek riskli aileler için önleyici ve tedavi stratejileri oluşturmaya yardımcı olabilir.
Trehaloz' un pterjium dokusundaki fibroblastların üzerine inhibitör etkisinin araştırılması
Pterjium şimdiye kadar yapılan çalışmalarla etyolojisi tam olarak aydınlatılamamış, birçok hipotez ortaya konan ancak patogenezinde fibroblast proliferasyonun olduğu dejeneratif bir oküler yüzey bozukluğudur. Tedavisi için genellikle cerrahi eksizyon tercih edilir. Biz çalışmamızda trehalozun fibroblastlar üzerindeki inhibitör etkisini invitro koşullarda incelemek istedik ve bunu hangi hücresel yolaklarla ve hangi genler üzerinden yaptığını analiz etmeyi amaçladık. Kliniğimize başvuran 3 erkek ve 3 kadın toplamda 6 primer pterjiumlu hastayı çalışmamıza dahil ettik. Önce bu hastaların pterjium ve normal konjontivalarını eksize edilip primer hücre kültür yapıldı. Trehaloz(100, 200, 400, 600 mM) ve mitomisin C(0,5, 1, 2,5 ,5 ,10 ve 20 μl) muamelesi gerçekleştirildi ve 48 saat boyunca 37oC'de %5 CO2 ve %95 nemli ortamda inkübe edildi. Bu aşamada trehalozun fibroblastların proliferasyonunu inhibe ettiğini gözlemledik. Geneall marka Hybrid-R total RNA izolasyon kiti aracılığıyla ilaç muamele edilmeyen kontrol ve trehaloz, mitomisin C uygulanan pterjium ve konjonktiva hücrelerinin total RNA izolasyonu gerçekleştirildi. Sonrasında bu örneklerden ikisi mikrodizin analizine gönderildi. Pterjiumda normal konjonktivaya oranla ifadesi değişen VIM, FGF7, FGF10, TGFBR2, TGBR3 MSMO1, Tenascin C, RANBP3L, NR4A1, IGFBP4, CLCA2, SERPIN2,ASPN genleri olarak saptadık. Trehaloz verildiğinde bu genlerdeki değişimler dikkat çekiciydi. Bu genler genel olarak vaskülogenezis, migrasyon, yara iyileşmesi, adezyon, fibroblast proliferasyonu, fibroblast büyüme faktörünün pozitif regülasyonu gibi olaylarda görev alıyorlar ve trehaloz verildiğinde bu genlerin ifadesi pterjium oluşumunu bloke edecek yönde değişti. Ancak çalışmamızda kısıtlı hasta sayısı mevcut olduğundan daha geniş hasta gruplarına ihtiyaç mevcuttur. Anahtar Kelimeler: pterjium, fibroblast, mikrodizin analizi, trehaloz, mitomisin C
COVID-19 tanılı hastalarda SARS-COV-2 tam genom analizi ve klinik bulgular ile ilişkisi
Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin (SARS-CoV-2) neden olduğu koronavirüs hastalığı (COVID-19), Aralık 2019'un sonlarında Wuhan'da ortaya çıkarak kısa sürede tüm dünyada etkisini göstermiştir. Pandemiden kısa süre sonra ortaya çıkan SARS-CoV-2 varyantları, epidemiyolojik ve klinik bulgularda, aşı ve tedavi seçeneklerinde değişikliklere neden olarak pandeminin seyrini değiştirmiştir. SARS-CoV-2 virüsünün genomik dizilimini belirlemek için kullanılan bir teknik olan sekanslama, yeni varyantların ve mutasyonların tespiti ve karakterizasyonu için önemli bir araçtır. RNA dizisindeki değişikliklerin belirlenmesi, virüsün evrimi, yayılımı, bulaşıcılığı, hastalığın klinik bulguları ve aşıların etkililiği gibi faktörlerin anlaşılmasına katkı sağlar ve salgının kontrolünde önemli bir rol oynar. Bu çalışmada farklı dönemlerde takip edilen belirli özelliklere sahip COVID-19 hastalarından elde edilen SARS-CoV-2 örneklerinde tam genomik sekanslama yapılarak virüsün yapısal değişikliklerinin görülme sıklıkları ve hastalığın klinik bulgularına etkisi analiz edilmiştir. 2022 Ocak ve Kasım ayları arasında Pamukkale Üniversitesi Hastanesi Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği'nde takipli 21 hasta çalışmaya dahil edilmiştir. COVID-19 hastalarının nazofaringeal ve orofaringeal sürüntü örnekleri alınarak viral RNA'ları ekstrakte edilmiş ve tam genomik sekanslama analizi gerçekleştirilmiştir. Hastalar klinik durumlarına göre hafif, orta ve ciddi klinik seyirli olmak üzere gruplandırılmış, klinik durumları, laboratuvar sonuçları, radyolojik bulguları ve PCR pozitiflik süresi ile gen analizi sonuçları arasındaki ilişki araştırılmıştır. Çalışmaya dahil edilen 21 hastanın 13'ü (%61,9) erkek ve yaş ortalamaları 65,3±20,7 (26-97) idi. Toplamda 18 (%85,7) hastanın hastanede (servis veya yoğun bakım) takip ve tedavisi yapılırken, üç (%14,3) hasta ayaktan takip edildi. Çalışmada 12 hastada Omicron BA.2, dört hastada Omicron BA.1, dört hastada Omicron BA.5 alt varyantları ve bir hastada Delta varyantı saptandı. İncelenen tüm izolatlarda c.1841A>G (D614G), c.425G>A (G142D), c.9764C>T, NSP4 (T492I), c.14144C>T (NSP12 P323L) mutasyonları saptandı. Hastalardan izole edilen örneklerde tespit edilen mutasyonlar ile bu mutasyonların tüm dünyada aynı sekansta görülme sıklıkları Pearson korelasyon testi ile karşılaştırıldığında, bu değişkenler arasında yüksek derecede pozitif bir korelasyon bulundu. (r(163)=0.81, p<0.001). Ek olarak Türkiye'den alınan örneklerde ilk kez bulunan bazı missense mutasyonlar gözlemlendi. Ağır klinik seyirli hastalarda obezite, hafif ve orta klinik seyirli hastalara göre istatistiksel açıdan anlamlı olarak daha yüksek oranda görüldü (p=0,042). Laboratuvar bulgularına göre incelendiğinde ağır klinik seyirli hastalarda; başvuru anındaki C-reaktif protein (p=0,014), aspartat aminotransferaz (AST) (p=0,001), BUN ve (p=0,018) kreatinin yüksekliği (p=0,003) ve hemoglobin (Hgb) değerlerinde düşüklük (p=0,037) diğer klinik formalara göre istatistiksel olarak anlamlı olarak daha fazla tespit edildi. Uzamış PCR pozitifliği (dört haftanın üzerinde) immunsuprese hastalarda (malignite (p=0,016), lenfoma (p=0,006)) daha sık saptandı. Aynı zamanda bu hastaların çoğunun orta ve ağır klinik seyir gösterdiği saptandı (p=0,019). İmmun yetmezlik kliniği olan hastalarda istatistiksel açıdan anlamlı şekilde daha fazla hastaneye yatış (p=0,026) ve daha ağır hastalık tablosu gözlemlendi (p=0,018). Çalışmaya alınan hastalarda saptanan mutasyonlar değerlendirildiğinde ise aşılardan herhangi biriyle dört doz ve üzeri aşılanan hastalarda Spike Q493R mutasyonu daha yüksek oranlarda saptandı (p=0,043). Çalışmada nadir olarak görülen mutasyonlara bakıldığında literatürle uyumlu bir şekilde Omicron BA.1 subvaryantı saptanan olgularda Spike A67V, del211 ve ins214EPE mutasyonları viral infektivitede artış ve bağışıklık yanıtına direnç ile ilişkilendirilmiştir. Spike R346K ve Türkiye'den ilk kez bildirilen Spike A263T mutasyonunun klinik etkisinin infektivite ve bulaştırıcılıktan ziyade sonuncusu son üç ay içinde olan dört doz aşılamaya rağmen hastamızda tespit edilmesi sebebiyle bu varyantın antikor yanıtından kaçış ile ilişkili olabileceğini düşündürmüştür. Omicron BA.2 subvaryantı hastamızda saptanan Spike R21T'nin, literatürle uyumlu olarak, virüsün insan ve bağırsak hücrelerine geçişini artırarak ağır klinik seyir ve gastrointestinal (GİS) bulgulardan sorumlu olabileceği (hastamızda GİS semptomları olması nedeniyle) ve antikor nötralizasyonunda azalmaya (hastamızın dört doz aşılanma öyküsü olması nedeniyle) neden olabileceği sonucuna varılmıştır. Omicron BA.2 subvaryantı için Spike L452M değişikliğinin ORF3a'da tespit edilen D155Y ile sinerjik etki göstererek aşırı immün yanıt ve hiperinflamasyonu tetikleyebileceği (hastamızın inflamatuar parametlerinde belirgin artış olması nedeniyle) düşünülmüştür. NSP1 H110Y mutasyonun konakçı gen ifadesini inhibe ederek bu yolla bağışıklık sisteminden kaçma etkisinin hastamızda da görüldüğü gözlemlenmiştir. Spike A222V, T323I ve NS7a A106T değişiklikleri azalmış infektivite, artmış bağışıklık yanıtından kaçış ve konakçı-virüs bağlanması (hastamızda hafif klinik seyir, uzamış PCR pozitifliği saptanması nedeniyle) ile ilişkilendirilmiştir. NSP4 T114I'in literatürle uyumlu olarak hastamızda da viral replikasyonda artış/viral klerenste azalış ile uzamış PCR pozitifliğine neden olduğu görülmüştür. Spike A27S, K417N, N440K, Q493R, T19I, G142D mutasyonlarının saptandığı hastalarımızda da yine literatürle uyumlu olarak, ortak etki oluşturarak aşı ile oluşan antikor yanıtına dirence neden olduğu gözlemlenmiştir. Spike G339D, S373P, S375F, K417N, N440K, S477N, T478K, E484A, Q493R, Q498R, N501Y mutasyonlarının da dört doz aşılı ve yüksek antikor titresine sahip hastamızda olması nedeniyle bağışıklık yanıtından kaçış etkisinin olabileceği düşünülmüştür. Çalışmamızda Delta (B.1.617.2) varyantı saptanan bir olguda Spike protein NTD spesifik E156G/del157-158 ve L452R kombinasyonunun artan enfektivite, aşı ile ortaya çıkan poliklonal antikorlara direnç ve artmış hücreden hücreye füzyon etkisinin olgumuzda da gözlemlendiği düşünülmüştür. Spike P681R saptanan hastamızda olduğu gibi ağır klinik seyir ve uzamış PCR pozitifliği ile ilişkili olabileceği sonucuna varılmıştır. Omicron BA.5 varyantı için NSP13 A389V, NSP14 M315I, NSP16 T140I mutasyonlarının hastamızda hiperinflamasyon kliniği olması nedeniyle literatüre benzer şekilde abartılı inflamatuar yanıta ve akciğer immünopatolojisine neden olabileceğini düşündürmüştür. N E136D mutasyonu, hastamızda olduğu gibi daha ağır ve uzun seyreden üst solunum yolu bulgularına neden olabileceğini ve yurt dışı seyahat öyküsü olan kişiyle temas öyküsü olması nedeniyle seyahat öyküsünün epidemiyolojik ve varyantların dağılımındaki önemini olgumuzda göstermiştir. Türkiye'de ilk kez sekanslama sonuçlarının kliniğe yansıması bu çalışmada değerlendirilmiştir. Ancak sınırlı sayıda hasta grubunda ve tek merkezde yapılan bu çalışma tüm ülke verilerini temsil etmemektedir. Daha büyük bir popülasyonda, daha fazla sayıda merkezde, daha fazla sekanslama çalışmaları ile bu sonuçların klinik yansımasının araştırılmasına gereksinim vardır. Virüsün yayılımının ulusal ve global seviyelerde takibi, viral genomların karşılaştırılması ve moleküler filogenetik ağaçların oluşturulmasıyla izlenebilir. Genetik değişikliklerin tespiti, varyantların ortaya çıkması ve mutasyon oranlarının anlaşılması etkin tedavi ve aşı geliştirilmesinde olumlu bir etki yaratacaktır.
Dishormonogenezli konjenital hipotirodi hastalarında yeni nesil dizi analizi ile genetik etiyoloji değerlendirilmesi
Hipotiroidi, hipotalamus-hipofiz-tiroid bezi aksında herhangi bir sorun nedenli tiroid bezi tarafından yetersiz tiroid hormonu üretilmesi olarak tanımlanır. Konjenital ya da edinsel olabilir. Konjenital hipotiroidi yenidoğan döneminde en sık görülen endokrin bozukluk olup önlenebilir mental retardasyonun en önemli sebeplerindendir. Geçici (%40-50) veya kalıcı (%50-60) olarak görülebilir. İyot eksikliği veya fazlalığı, annenin otoimmun tiroid hastalıkları, annenin antitiroid ilaç kullanımı veya yenidoğan dönemi kullanılan bazı ilaçlara bağlı olarak geçiçi hipotroidi nedenleri arasındadır. Kalıcı hipotrodiler ise tiroid bezinin disgenezileri (%60) veya dishormonogenez (%40), hipotalamohipofizer nedenlere bağlı sekonder veya santral hipotroidi ve tiroid hormonlarının transport /metabolizma defektlerine bağlı olarak görülebilir. Doğumsal hipotiroidinin insidansı 1/4000 olarak bilinmektedir ancak son yıllarda görülme sıklığında artış olduğuna dair yayınlar mevcut olup, güncel insidansı 1/2000 olarak bildirilmiştir. Vaka sayısındaki artışın etiyolojisi tam olarak bilinememektedir. Endokrin bozucu ajanlar, hipotroidi tarama testinde kullanılan tirotropin (TSH) eşik değerinin düşürülmüş olması ve tıbbi hizmetlerin daha çok insana ulaşması gibi nedenler bu artışın sebebi olarak düşünülmektedir. Etiyolojik olarak bakıldığında, geçmiş yıllara kıyaslandığında, disgenezi ve ciddi hipotroidi sıklığında artış olmadığı; dishormonogeneze bağlı veya hafif-geçici seyirli vakalarda artış olduğu saptanmıştır. Konjenital hipotiroidi hastalarında %15-40 arasında dishormonogenez sıklığı bildirilmiştir ve artış olduğu düşünülmektedir. Primer konjenital hipotroidi nedenlerinden olan dishormonogenez bağlı hipotroidi, tiroid hormon sentez basamaklarında görevli reseptör veya enzimleri kodlayan genlerin mutasyonları sonucu, sıklıkla otozomal resesif geçişli görülür. Tiroid bezi ötopik (normal) yerleşimli olup, sıklıkla normal büyüklükte veya hafif büyüktür (guatr). Sodyum/iyot simporter (NIS veya SLC5A5), tiroid peroksidaz (TPO), tiroglobulin (TG), dual oksidaz 2 ve reseptörü (DUOX2 ve DUOXA2), pendrin (SLC26A4 veya PDS), IYD/DEHAL1 ve SLC26A7 etiyolojiden sorumlu genler olarak bildirilmiştir. Teknolojinin gelişmesi sonucunda, karşılaştırılmalı genetik hibridizasyon (CGH), yeni nesil dizileme (targeted NGS) ve tüm ekzom sekanslama (WES) gibi yeni yöntemler, konjenital hipotirodili olgularda geniş populasyon çalışmalarını mümkün kılmış, hastalarda hipotroidiye neden olan birden fazla gende varyasyon saptanmış olup, hastalığın oligogenik kalıtım paternini göstermiştir. Konjenital hipotiroidizm ile ilişkili genlerin sayısının artmasına rağmen, konjenital hipotiroidizmin tam olarak ne kadarının bilinen genetik nedenlere atfedilebildiği ve spesifik genlerdeki mutasyonların göreceli prevalansı kesin olarak bilinmemektedir ve çalışmaların sonuçları arasında farklılıklar mevcuttur. Örneğin yapılan çalışmalarda Doğu Asya toplumlarında en çok sorumlu tutulan gen gibi görünen DUOX2, Kore, Japonya ve Çin'de konjenital hipotiroidizm hastalarda %16-32, Avrupa ve Ortadoğu hastalarından oluşan bir grupta % 18 sıklıkta bildirilmiştir. Bu farklılıklar kohortun etnik kökeni ve çalışılan konjenital hipotiroidi tipi (disgenezi/dishormonogenez) seçiminden kaynaklanabilir. Ülkemizde, akraba evliliğinin sık olması ve otozomal resesif geçiş paterninin hakim olduğu dishormonogeneze bağlı hipotroidi grubunda, bilinenden farklı bir genetik yelpazeye katkıda bulunmuş olabilir. Dishormongeneze bağlı hipotiroidinin genetik etiyolojisi ile ilişkili geniş kapsamlı ulusal verimiz oldukça az sayıdadır. Artan konjenital hipotiroidi vakalarından, hafif klinik seyirli olan ve dishormonogeneze bağlı olan konjenital hipotroidilerin sorumlu olduğu düşünülmektedir. Bu artışın nedeni tam olarak bilinmemektedir. Çalışılan konjenital hipotiroidi tipi, etnik köken açısından farklılık gösteren kohort seçimleri nedeni ile dishormonogenez prevalansı ve klinik seyri kesin olarak bilinmemektedir. Bu çalışmada amaç dishormonogenetik konjenital hipotiroidizm hastalarından oluşan iyi karakterize edilmiş bir kohortta, yeni nesil dizilemeyi kullanarak moleküler nedeni aydınlatmaktır. Çalışmamızda dishormonegeneze bağlı hipotroidi düşünülen çocuk hastalar alınmıştır. Çalışmaya görüntüleme yöntemleri ile tiroid disgenezisi (ektopi, agenezi, hipoplazi, hemiagenezi) dışlanmış ve aşağıdaki kriterlere giren hastalar alınmıştır; 1. Birinci derece akrabalarında (anne, baba veya kardeş) doğumsal hipotiroidi tanısı olan 2. Ebeveynleri arasında akrabalık öyküsü olan 3. L-tiroksin tedavi kesimi denenip, kontrolde TSH değeri ≥10 IU/mL olan hastalar alınacaktır. 4. Subklinik hipotroidi tanısı ile izlenip, tedavi almaz iken TSH değerleri >10 IU/L devam eden hastalar. 5. Konjenital hipotroidi tanısı ile izlenip, üç yaşını doldurmasına rağmen, L-tiroksin ihtiyacı > 2 μg /kg/gün olan ve tedavi kesimi bu nedenle denenmemiş olanlar. 6. Konjenital hipotroidi tanısı ile birlikte guatrı olanlar. Hastalardan yeni nesil dizileme (NGS) yöntemi ile GLIS3, TSHB, THRA, THRB, PAX8, NKX2-5, NKX2-1, FOXE1, TSHR, SLC5A5, SLC26A4, TG, TPO, DUOX2, DUOXA2, IYD, SLC26A7, DUOX1, ZNF607, SLC6A4, DIO1, DIO2, DIO3, TTR, GNAS, TRH, ALB, POR, TRHR, PHEX, SLC16A2, SERPINA7, IGSF1 genlerinden oluşan bir panel taraması yapılmıştır. Sonuç; Çalışmaya kriterleri karşılayan 59 hasta (30 erkek, 29 kız) alındı. Otuzbir (%52,5) hastada herhangi bir gende varyant saptadık. Oligogenik kalıtımdan bağımsız olarak kohortumuzdaki en yaygın olarak varyant saptanan gen TSHR geniydi (16/31). Bunu sırasıyla TG (7/31), TPO (6/31) SLC26A4 (3/31), DUOX2(2/31) THRB(1/31), DUOX1 (1/31) ve DUOXA2 (1/31) izlemekteydi. Altı adet olguda oligogenik kalıtım (TSHR-DUOXA2, TSHR-TG, SLC26A4-TG, TG-TPO, DUOX2-TSHR) söz konusuydu. Bir adet olguda TSHR geninde biallelik varyant mevcuttu. Yirmiki hastada (%71) TSHR, TPO, DUOX1,DUOX2, THRB, SLC26A4 ve TG'de monoalelik varyantlar tespit edildi. Beş adet novel varyant saptandı. Bu çalışma sonucunda elde edilen veriler, ileri dönemlerde dishormonogeneze bağlı konjenital hipotiroidi olguları için tanı, tedavi ve takip protokollerinin geliştirilmesine katkıda bulunabilir; olası muhtemel gen tedavisi için yol gösterici olabilir. Sonraki nesillere verilebilecek prenatal ve postnatal genetik danışmanlıkta da bu verilerin önemli olacağı kanaatindeyiz.
Klinik örneklerden izole edilen Fusarium suşlarının antifungal duyarlılıklarının ve virülans faktörlerinin araştırılması
Fusarium türleri doğada yaygın olarak bulunan küf mantarları olup insanlarda keratit ve onikomikoz başta olmak üzere invaziv veya invaziv olmayan çeşitli enfeksiyonlara yol açmaktadır. Fusarium cinsi, tür komplekslerine, tür kompleksleri de türlere ayrılmıştır. Bu identifikasyonun morfolojik özelliklere göre yapılmasının zorluğu nedeniyle tür tanısında moleküler yöntemlerin kullanımı önerilmektedir. Fusarium suşlarınının antifungal duyarlılık testi sonuçlarının ve virülans faktörlerinin türden türe değişme olasılığı bulunması nedeni ile identifikasyonları önem taşımaktadır. Bu çalışmada Fusarium suşlarının moleküler yöntemlerle identifikasyonu, sıklıkla kullanılan antifungaller için duyarlılık testlerinin yapılması ve bazı virülans faktörlerinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda, Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarında 2017-2022 yılları arasında çeşitli klinik örneklerden izole edilen Fusarium suşları ITS bölgesinin dizi analizi ile tür kompleksi düzeyinde tanımlanmıştır. Suşların amfoterisin B, vorikonazol ve posakonazol duyarlılık testleri sıvı mikrodilüsyon metodu ile yapılmıştır. Fusarium suşlarının proteaz, fosfolipaz, esteraz aktiviteleri ve biyofilm oluşturma yetenekleri fenotipik testlerle araştırılmıştır. Tür kompleksleri ile virülans faktörleri ve antifungaller için saptanan mininum inhibitör konsantrasyonu (MİK) değerleri arasında istatistiksel bir ilişki olup olmadığı araştırılmıştır. Laboratuvarımızda çeşitli klinik örneklerden izole edilmiş 22 Fusarium suşunun 10'u F. solani tür kompleksi, altısı F. fujikuroi tür kompleksi, beşi F. oxysporum tür kompleksi, biri F. incarnatum-equiseti tür kompleksi olarak tanımlanmıştır. Antifungal duyarlılık testi sonucunda suşların MİK90 değerlerinin amfoterisin B için 16 µg/ml, vorikonazol ve posakonazol için >32 µg/ml olduğu görülmüştür. Fusarium oxysporum tür kompleksi suşlarında posakonazol MİK değerleri, diğer tür kompleksi suşlarına göre istatistiksel olarak anlamlı oranda düşük saptanmıştır. Fusarium suşlarının yedisinin (%32) proteaz testi pozitif, 21'inin (%95) esteraz testi pozitif, 13'ünün (%59) fosfolipaz testi pozitif, 12'sinin (%55) biyofilm testi pozitif olarak saptanmıştır. Fusarium solani tür kompleksi suşlarının F. oxysporum tür kompleksi ve F. fujikuroi tür kompleksi suşlarına göre daha yüksek oranda biyofilm oluşturması istatistiksel olarak anlamlı bulunmuş, diğer virülans faktörleri için türler arasında anlamlı fark bulunamamıştır. Çalışmamızda Fusarium suşlarının amfoterisin B, vorikonazol ve posakonazol için saptanan MİK değerleri ile proteaz, fosfolipaz ve esteraz enzimleri arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmamıştır. Sonuç olarak, Fusarium türlerinin tanımlanmasında moleküler yöntemlerin kullanımının gerekli olduğu, Fusarium türlerinin virülans faktörleri ve antifungal duyarlılığı ile ilgili daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç olduğu görüşüne varılmıştır. Anahtar sözcükler: Fusarium, dizi analizi, proteaz, esteraz, fosfolipaz, biyofilm, antifungal duyarlılık.
Mide kanseri hücrelerine sonodinamik terapi uygulamasında HSP 70 inhibisyonu ve klorin E6 yüklü mikrokabarcıkların rolü
Amaç: Araştırmamızın amacı mide kanseri hücrelerine sonodinamik terapi uygulamasında ısı şok protein 70 inhibisyonu ve klorin e6 yüklü mikrokabarcıkların rolünün araştırılmasıdır. Gereç ve Yöntem: Elde edilen mikrokabarcıkların boyut analizleri çeşitli yöntemlerle elde edildikten sonra MKN28 mide kanseri hücre hattında ısı şok protein 70'in inhibisyonunu sağlamak için hücreler 48 saat pifithrin-μ ile inkübe edilmiştir. Pifithrin-μ inkübasyonunu takiben ultrases (1MHz, 3W/cm2, %20 puls, 30sn) ile yıkımı sağlanan klorin e6 yüklü mikrokabarcıklar varlığında 12 saat inkübe edilmiştir. Son olarak gruplar arasında sitotoksisite ve apoptoz süreçleri hakkındaki farklılıklar moleküler yöntemlerle incelenmiştir. Bulgular: Boyut analizleri sonucunda elde edilen mikrokabarcıkların 1-5µm boyutunda dağılım gösterdiği gözlenmiştir. Klorin e6 içeren mikrokabarcıkların ultrases ile yıkımı esnasında istatistiksel anlamlı artan kavitasyon verisi elde edilmiştir. Spektroskopik ölçümler sonucunda klorin e6 trisodyum salt çözeltisinde agregasyon oluşmadığı fakat farklı ölçümlerle de teyit edilmesi gereken bir bulgu olduğu düşünülmektedir. Yapılan sitotoksisite testleri sonucunda 1MHz frekans ve 3W/cm2 güçte 30sn süresince %20 puls ultrases uygulanmasına karar verilmiştir. Uygulama dozu olarak pifithrin-μ için 5μM ve klorin e6 için 5μM dozları seçilmiştir. Deney grupları incelendiğinde klorin e6 yüklü mikrokabarcıkların ultrases ile yıkımı sonucu sitotoksisitede ve apoptoz süreçlerinde istatistiksel anlamlı sonuçlar elde edilmiştir. Isı şok proteini inhibisyonu ile sinerjetik etki gösteren veriler elde edilmiştir. Sonuç: Sonuç olarak, kombine gruplarda gözlenen artmış hücre ölümü ve apoptoz verisinin tek başına ultrases, pifithrin-μ ve klorin e6 yüklü mikrokabarcık gruplarında görülen etkinin toplamından istatistiksel anlamlı olarak daha fazla olduğu gözlenmiştir.
Rabdomyosarkom hücre dizisinde onkogenik wip1 fosfatazın ve dna hasarı cevabı regülasyonunun araştırılması
Amaç: RMS A204 hücre hattında onkojenik Wip1 fosfatazın genotoksik stres kaynaklı (etoposid) apoptoz aktivasyonu üzerine etkisinin araştırılması amaçlandı. Gereç ve Yöntem: Çalışmada, A204 hücrelerinde etoposid, GSK2830371 ve etoposid + GSK2830371 kullanılarak; Hücre canlılığı, 24-48-72 saatlik inkübasyonun ardından MTT ile analizi edildi. Apoptozu indüklemek için 24-48-72 saatlik inkübasyonun ardından Annexin V testi yapıldı. WIP1, GAPDH, fosfo p53 ve total p53 proteinlerinin seviyeleri, 48 saatlik inkübasyonun ardından Western blot analizi ile ölçülmüştür. Bulgular: Etoposide'in GSK ile kombinasyonu halinde zamana ve doz artışına bağlı olarak metabolik aktiviteyi azalttığı MTT testi ile belirlenmiştir. Etoposid ve GSK kombinasyonun da zaman artışına bağlı olarak apoptoz miktarında artış olduğu Annexin V testi ile saptanmıştır. Etoposid + GSK kombinasyonunun Wip1'in baskılanmasıyla fosfo p53 proteini seviyesinde artışa sebep olduğu Western Blot analizi ile tespit edilmiştir. Sonuç: bu çalışmada, A204 rabdomyosarkom hücre hattında PPM1D amplifikasyonu nedeniyle aşırı artan Wip1 ekspresyonunu inhibe ederek genotoksik stres oluşturan bir kemoterapi ajanı olan etoposidin etkinliği ve bu hücrelerin apoptoz yoluyla kemoterapiye yanıtı araştırıldı. Anahtar kelimeler: DNA hasarı cevabı (DDR), A204, Rabdomyosarkom (RMS), Wip1 fosfataz.
Docotettix cornutus Ribaut, 1948 (Hemiptera: Cicadellidae)'un DNA barkodlaması
Bu çalışmada nar bahçelerinden toplananan Docotettix cornutus erginlerinden DNA dizisi elde ederek barkodlamasının yapılması amaçlanmıştır. Örnekler Aydın, İzmir, Manisa illerindeki nar bahçelerinden japon şemsiyesi kullanılarak toplanmıştır. Docotettix cornutus'un ilk olarak tür teşhisi yapılmış sonrasında DNA izolasyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. Örneklerimizin dizi analizi HLO ve HCO primerleri kullanılarak yapılmıştır. Grup içi DNA farklılıkları incelendiğinde 499bç (SE05) ile 675bç (SE07) arasında sağlıklı okuma yapılmıştır. Örneklerimizde Timin %33,33 - %33,89, Sitozin %14,19 - %15,03, Adenin %31,86 - %32,94 ve Guanin %18,81 - %20,24 oranında bulunmuştur. Grup içi örnekler arası mesafe hesaplandığında SE05 ve SE07'nin aynı haplotipi taşıdığı SE15 ile SE5 örneklerinin ise birbirine en uzak haplotipleri içerdiği tespit edilmiştir. BlastN dizi analizi programı ile yapılan analizde Docotettix cornutus'a en yakın tür Synophropsis lauri olduğu tespit edilmiştir.Çalışmada kullanılan her bir örneğin COI gen bölgesindeki DNA dizileri tespit edilmiştir. DNA dizileri BLAST yapılarak NCBI tabanında benzerlik gösterebileceği örnekler ile karşılaştırılmıştır. Her bir örnek için NCBI kod numarası alınarak kaydedilmiştir.
Papiller tiroid kanserinde next genereration sequencing(NGS) moleküler multiple varyant analizi, histopatolojik ve immunhistokimyasal bulguların değerlendirilmesi
PTK tiroid malignitelerinin %90'indan fazlasını oluşturan en yaygın malign tiroid tümörü tipidir. Tiroid karsinomunun insidansı son birkaç dekaddır hızla artarken PTK'yı en yaygın malign endokrin tümör haline getirmiştir. Tiroid kanserinin son yıllarda moleküler patogenezinin anlaşılması daha etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için büyük umut vaat etmektedir. Çoğu PTK yavaş yayılım gösterse de bazıları agresif bir klinik seyir ile ilişkilidir. Histopatolojik ve moleküler parametreler ile PTK'nın farklı alt tiplerini belirlemek için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır. Risk sınıflandırmasına yardımcı olmak için BRAF ve RAS gibi çok sayıda moleküler belirteç önerilmiştir. PTK'yı yüksek riskli ve düşük riskli gruplara ayırma kavramı, prognozu tahmin etme ve PTK'lı hastaların cerrahi ve cerrahi sonrası yönetimini optimize etme potansiyeli nedeniyle son zamanlarda ilgi odağı haline gelmiştir. Bu çalışmada PTK tanısı alan olgularda yeni nesil dizileme (Next Generation Sequencing, NGS) sistemiyle bölümümüzde tespit edilen somatik mutasyonların profilinin belirlenmesi ve moleküler belirteçlerin histopatolojik ve immunhistokimyasal parametrelerle karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya 2019-2021 yılları arasında Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı'nda incelenen PTK tanılı olguların tiroidektomi materyalleri içerisinden NGS sistemiyle analiz edilen olgular dahil edildi. Toplam 74 olgunun hepsine immunhistokimyasal olarak Yüksek molekül ağırlıklı keratin (HMWK), Sitokeratin-19(CK19) ve Galektin-3 boyaları uygulandı. Çalışmada tümörlerin prognozunda rol oynayan histopatolojik bulgular, immunhistokimyasal CK19, galektin-3, HMWK ekspresyonları ve NGS ile genlerde saptanan patojenik mutasyonlar değerlendirilmiştir. İstatiktiksel analizler sonucunda BRAF mutasyonu ile immunhistokimyasal galektin-3 ve CK19 ekspresyon değerleri arasında anlamlı ilişki izlenmiştir. İmmunhistokimyasal galektin-3 ekspresyonu ile lenf nodu metastazı ve lenfovasküler invazyon arasında anlamlı ilişki izlenmiştir. İmmunhistokimyasal CK19 ekspresyonu ile lenfovasküler invazyon arasında anlamlı ilişki olduğu tespit edilmiştir. İmmunhistokimyasal CK19, HMWK ve galektin-3 ekspresyonlarının kendi arasında anlamlı korelasyonu tespit edilmiştir. Tümör boyutu ile lenf nodu metastazı, lenfovasküler invazyon ve kapsül invazyonu arasında anlamlı ilişki olduğu görülmüştür. Lenf nodu metastazı ile histopatolojik olarak saptanan psammom cisimcikleri ve kapsül invazyonu arasında anlamlı ilişki olduğu izlenmiştir. Daha önceki çalışmalarda BRAF pozitifliğinin hem kötü prognoz açısından hem de spesifik tedaviler açısından önemi gösterilmiştir. Bu nedenle tiroid materyallerinde NGS yöntemi ile bu genlerdeki mutasyonların analiz edilmesi olguların takip ve tedavisinde yol gösterici olabilir. NGS sonuçları daha efektif olmakla birlikte NGS cihazlarının ya da immünhistokimyasal BRAF'ın olmadığı laboratuvarda immünhistokimyasal bir alternatife ihtiyaç duyulabilir. Mevcut bulgularımız birçok merkezde sıklıkla çalışılan Sitokeratin-19 ve Galektin-3 boyanma yüzdelerindeki oransal artışın moleküler BRAF pozitifliği ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Sitokeratin-19 ve Galektin-3 birçok merkezde tanısal amaçlı olarak da kullanıldığı için, ek bir immünhistokimyasal boya, doku kaybı veya yöntem olmaksızın olguların moleküler BRAF açısından araştırılmasına hızlı bir yönlendirme potansiyeli sunabilir. BRAF mutasyonu pozitifliğinin kötü prognozla ilişkili olması ve bu mutasyonun immünhistokimyasal Sitokeratin-19 ve Galektin-3 oranları ile korele olması; bu iki immünhistokimyasal boyanın boyanma oranlarındaki artışın kötü prognozla ilişkili olduğuna dair fikir vermektedir.
Sığır ve koyunlardan elde edilen fasciola spp izolatlarındaki genetik çeşitliliğin multipleks PCR ve sekans analizi ile araştırılması
Fasciolosis, Fasciola hepatica ve F. gigantica'nın neden olduğu oldukça yaygın bir helmint enfeksiyonudur. Bu çalışmada fosfoenol piruvat karboksikinaz (pepck) genini amplifiye ederek hibrid Fasciola türlerini tanımlamak amacıyla bir multipleks PCR yapıldı. Ayrıca Fasciola haplotiplerini belirlemek için mitokondriyal nad1 amplifiye edilerek dizi ve filogenetik analizleri yapıldı. Bu amaçla, Elazığ ilindeki mezbahanelerden kesimi takiben 51 sığır ve 51 koyundan erişkin Fasciola izolatları toplandı, genomik DNA izole edildi ve ardından pepck'i çoğaltmak için tek aşamalı multipleks PCR yapıldı. 510 bp'lik bir bant oluşturan izolatlar F. gigantica, 241 bp'lik bir bant oluşturanlar F. hepatica ve her iki bandı oluşturanlar da hibrid (aspermik) parazitler olarak tanımlandı. Multipleks PCR neticesinde, dört izolat F. gigantica ve 84 izolat da F. hepatica olarak tanımladı. On dört de hibrid izolat (beş sığır ve dokuz koyun) tanımlandı. nad1 PCR ürünlerinin tek yönlü DNA dizi analizinde, üç izolatın F. gigantica ve 99 izolatın da F. hepatica olduğu teyid edildi. Ayrıca F. hepatica nad1 sekansları ile tespit edilen 87 haplotipten dördünün daha önce rapor edildiği, geri kalan 83'ünün de bu çalışmaya özgü olduğu belirlendi. Sonuç olarak, bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez hibrid Fasciola parazitlerinin ve F. hepatica'nın daha önce tanımlanmamış 83 haplotipinin varlığı ortaya konuldu.