57
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
N-asetil sisteinin kolistin nefrotoksisitesine karşı koruyucu etkilerinin araştırılması
N-ASETİL SİSTEİNİN KOLİSTİN NEFROTOKSİSİTESİNE KARŞI KORUYUCU ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Amaç: Bu çalışmada kolistin nefrotoksisitesi oluşturulmuş sıçanlarda N-asetil sistein proflaksi ve tedavisinin böbrek fonksiyonları üzerine olan koruyucu etkisinin araştırılması amaçlandı. Yöntem: Erişkin Wistar erkek sıçanlar 4 gruba ayrıldı. Nefrotoksisite grubuna 300000 IU/kg/gün toplam doz olacak şekilde 8 saat arayla iki doza bölünerek intraperitonel (i.p.) yolla kolistin verildi. Tedavi grubuna 300000 IU/kg/gün toplam doz olacak şekilde 8 saat arayla iki doza bölünerek i.p. yolla N-asetil sistein (NAS) verildi. Yine bu gruba her bir NAS enjeksiyonundan 2 saat sonra 300000 IU/kg/gün toplam doz olacak şekilde kolistin uygulandı. Diğer bir gruba ise 300000 IU/kg/gün toplam doz olacak şekilde 8 saat arayla iki doza bölünerek i.p. yolla NAS verildi. Kontrol grubuna aynı yolla 2 ml (mililitre)/kg (kilogram) serum fizyolojik uygulandı. Tüm gruplara enjeksiyonlar 10 gün boyunca tekrarlandı. Son doz verildikten 24 saat sonra, biyokimyasal ve histopatolojik incelemeler için tüm hayvanların anestezi altında intrakardiyak kan örnekleri alınıp böbrek dokuları çıkartıldı. Bulgular: Kolistine bağlı nefrotoksisite oluşturulan grupta toplam histolojik aktivite skoru diğer gruplarla kıyaslandığında anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0.0001). Diğer taraftan kolistin grubunda görülen histopatolojik belirtiler, NAS tedavisi uygulanan NAS+Kolistin grubunda istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldı. Buna göre, kreatinin düzeyleri kolistin grubunda artarken NAS+Kolistin grubunda kolistin grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldı (p<0.01). Kolistin grubunda artan apoptotik hücre sayısı NAS tedavisi uygulanan NAS+Kolistin grubunda istatistiksel olarak anlamlı derecede azaldı (p<0.0001). Histopatolojik incelemelerde tübüler nekrozun NAS+Kolistin grubunda kolistin grubuna oranla daha az olduğu gözlendi. Sonuç: Çalışmanın sonucunda, kolistinin böbrekte işlevsel ve yapısal hasarlara sebep olduğu, NAS tedavisinin ise bu hasarlara karşı iyileşme gösterdiği gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Apoptoz, kolistin, kreatinin, N-asetil sistein, nefrotoksisite.
Oksalat dekarboksilaz enziminin rekombinant DNA teknolojisi ile üretimi ve karakterizasyonu
Oksalat taşları üriner sistemde biriken kalsiyum ve oksalik asidin oluşturduğu yapılardır. Oksalat taşları ileri zamanlarda böbrek taşı oluşturur ve erken tanısı için idrar oksalat seviyelerinin ölçülmesi önemlidir. Ülkemizde ve dünyada oksalat seviyeleri oksalat oksidaz ve oksalat dekarboksilaz olmak üzere iki farklı yöntem ile ölçülmektedir. Oksalat oksidaz yönteminde Oksalattan H2O2 ve CO2 açığa çıkarken, Oksalat dekarboksilaz yönteminde reaksiyon sonunda oluşan format'ın format dehidrogenaz enzimiyle parçalandığında açığa çıkan NADH+'nın spektrofotometrik yöntemle ölçülmesiyle oksalat miktarı tayin edilebilmektedir. Bu çalışmada, oksalat dekarboksilaz enziminin rekombinant DNA teknolojisi ile üretimi hedeflenmiştir. Böylece elde edilen rekombinant oksalat dekarboksilaz enzimi ticari olarak satılan format dehidrogenaz enzimi ile birlikte kullanılarak oksalat tayininde kullanılacak bir ölçüm metodunun geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bunun için Basillus subtilis M168 suşundan elde edilen yvrK geni pET SUMO TA Cloning® vektör sistemi ile One Shot® Mach1™-T1R Escherichia coli ve BL21(DE3) One Shot® Escherichia coli mikroorganizmalarına aktarılarak klonlama ve protein ifadesi işlemleri yapılmıştır. Böylelikle elde edilen 6xHis-SUMO-yvrK füzyon proteini başarılı bir şekilde üretilmiştir. Gerekli kofaktör, optimum pH ve sıcaklık sağlanıp karakterizasyonu ve enzim aktivitesi belirtilmiştir. Ayrıca ticari olarak temin edilen format dehidrogenaz enzimi de kullanılarak idrarda oksalat miktarını ölçmekde kullanılabilecek enzimatik aktivitesi yüksek bir oksalat ölçüm metodu geliştirilmiştir.
Investigation of delayed type hypersensitivity response against crimean-congo hemorrhagic fever virus nucleoprotein
Crimean–Congo hemorrhagic fever (CCHF) caused by CCHFV is reported in a wide geographic range with a fatality rate ranging from 5 to 50 %. CCHFV is a member of the family Bunyaviridae and classified in Nairovirus genus. CCHFV genome is composed of tripartite single-stranded negative RNA segments, and RNA dependent viral RNA polymerase is produced by L segment. S segment encodes nucleoprotein (NP) and M segment expresses Gn and Gc. To initiate the viral replication and transcription in the host cell, the segments are needed to be encapsidated by NP. The S segment of CCHFV encodes 53 kDa NP made up of globular domain with a prominent arm. CCHFV infection is generally reported as a mild, nonspecific febrile illness but in some cases, severe hemorrhagic disease is also developed. Persisting hemorrhage, multi-organ failure and shock result in fatality on day 5-14 of illness. In combatting against viral infections, CMI plays a pivotal role. Therefore it is essential to clarify the role of cellular immunity in CCHFV infection. In this study, we aimed to investigate the presence of delayet type hypersensitivity (DTH) reactions against CCHFV in an animal model. For this purpose, CCHFV NP (1449 bp), N-terminal part of NP, NPNT (387 bp) and C-terminal part of NP, NPCT (513 bp) were recombinantly produced in procaryotic expression systems and investigated their effect on DTH. Following immunization steps, antigens were injected in three different dosage (50 μg/μl, 100 μg/μl, 200 μg/μl) and footpad swelling was measured by an electronic caliper. For each protein, DTH response has peaked at 24 hr and decreased by 72 hr. Footpad swelling was statistically significant on right hind pad injected with antigen for each groups, compared to negative control (p<0,05). 100 μg/μl was found to be optimum dose for DTH response. The results of this study demonstrate that, CCHFV NP contains CD4+ T cell epitopes and N-terminal part of CCHFV NP developed stronger antigenicity than C-terminal part. Because, the exact role played by each protein in developing a cellular immunity against the whole virus have not been studied in detail, any information on the individual proteins and on the cellular immune response will be a wellcomed addition to the data on CCHFV. These information would be used in developing strategies in designing vaccines as well as on antiviral approaches.
Timokinon tedavisinin sporadik alzheimer modeli oluşturulmuş sıçan beyin dokusundaki mikroRNA ve mRNA ekspresyonu üzerindeki etkisinin araştırılması
Alzheimer hastalığı en sık rastlanan nörodejeneratif hastalıklardan birisidir. Hafıza ve öğrenme kontrolünün gerçekleştiği hipokampüs bölgesinde sinaptik yetmezlik, nöron hasarı ve nöron kaybı Alzheimer hastalığının nöropatolojik bulguları arasında sayılabilir. Moleküler boyutta incelendiğinde ise nöronların ölümüne ve sinaptik bağlantılardaki bozulmalara bağlı olarak apoptoz, nörogenez, hücre bölünmesi ve döngüsü, sağ kalım vb. yolaklarda gen düzeyinde ve protein düzeyinde bir çok regülasyon meydana gelmektedir. Ayrıca hücre fonksiyonunun epigenetik seviyede kontrolünde büyük önemi olduğu bilinen mikroRNA'ların Alzheimer hastalığında da etkili olduğu, hastalık süreciyle birlikte tekrardan düzenlendiği hem insan hem de hayvan çalışmalarıyla gösterilmiştir. Timokinon (TQ), Nigella sativa (çörek otu) bitkisinde %18.4-24 oranında bulunan en önemli biyoaktif bileşendir. Daha önce yapılan birçok çalışmada TQ'nun anti-oksidatif, anti-inflamatuar, anti-kanserojenik gibi pek çok yararlı etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde nörolojik bozuklukların patolojilerinde TQ'nun nöroprotektif etkili bir bileşik olduğu bildirilmektedir. Aynı zamanda in vitro yapılan çalışmalarda TQ'nun Alzheimer hastalığına karşı nöroprotektif etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Fakat literatürde TQ'nun moleküler etki mekanizmasına dair in vivo çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle çalışmamızda, Amiloid beta (Aβ) ve Streptozotosin (STZ) ile indüklenen sporadik Alzheimer modellerinde Timokinon tedavisinin etkinliğinin karşılaştırılmasını ve bu modellerden elde edilen hippocampus dokularında TQ'nun ilgili genlerin ve mikroRNA'ların ekspresyon düzeylerindeki etkisini araştırmayı amaçladık İnanıyoruz ki elde ettiğimiz veriler, TQ'nun henüz tedavi edici bir ilaca sahip olmayan Alzheimer hastalığında aday molekül olma potansiyeline ışık tutacaktır.
Rekombinant yöntemlerle sentetik parathormon üretimi
Biyoteknoloji alanında üretilen ürünler içerisinde proteinler oldukça önem taşımaktadır. Rekombinant yöntemler kullanılarak sentetik olarak üretilen proteinler terapötik, endüstriyel ve bilimsel araştırma amaçlı üretimleri gerçekleştirilmektedir. Çalışmamızdaki amaç, rekombinant teknoloji kullanılarak terapötik kullanımını amaçladığımız parathormonu üretmektir. Parathormon (PTH) polipeptid yapısında 84 aminoasitlik (aa) tek bir zincir olarak paratiroid bezlerinden salgılanır. PTH'nin başlıca sorumluluğu, kemiklerden kalsiyum (Ca+2) emilimi ile plazma Ca+2 değerlerini düzenlemektir. Böbrekler ve bağırsaktan Ca+2 emilimi ve aynı zamanda fosfat (PO4−3) atılımınını sağlayarak, Ca+2-PO4−3 metabolizmasındaki homeostaziyi sağlamakta önemli bir role sahiptir. D vitamininin aktif formunun üretimi üzerine olan etkisi ile kalsiyumun bağırsaklardan emilimini kolaylaştırır. Hormonun az ya da çok salgılanması çeşitli sağlık sorunlarına neden olabilir. PTH'nin az salgılanmasıyla görülen en önemli endokrin rahatsızlık hipoparatiroidizm olarak adlandırılır. Çalışmamızda hipoparatiroidizme alternatif tedavi yöntemi olması planlanan sentetik PTH üretimi hedeflenmiştir. Bu çalışmada, hiperplazi dokudan alınan örnekten mesajcı ribo nükleik asit (mRNA) izolasyonu ve daha sonrasında komplementer deoksiribo nükleik asit (cDNA) eldesinin spesifik primerler ile DNA fragmentleri oluşturan, DNA polimeraz enzimi kullanılarak gerçekleştirilen polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) çalışmaları sonucunda PTH geni elde edilmiştir. Rekombinant PTH (rPTH) N-Terminal (1-84) kodlayan gen, PEGFP-N1(ökaryotik plazmid vektör) klonlama vektörüne sekresyon sinyalinin ardına yerleştirilip, moleküler klonlama teknikleri kullanılarak klonlanmıştır. Konak organizma olarak One Shot® Mach1™ T1R Escherichia coli kompetent suşu kullanılmıştır. Vektör içerisine aktarılan rPTH geni, hücre kültüründe HeLa (Henrietta Lacks, serviks kanseri) ve AGS (ATCC®CRL-1739™, Gastrik Adenokarsinoma) hücre hatlarına transfeksiyon ajanı ile 24 sa., 37 santigrat (˚C) ve %5 CO2 içeren etüvde inkübasyona bırakılmıştır. 24 sa.lik kültür sıvısından aktivasyon ölçümü ile PTH seviyesi ölçülmüş ve ekspresyon düzeyi sodyumdodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) analizi ile değerlendirilmiştir. Bu çalışmada elde edilen sonuç ile medikal alanda çalışmaları sürdürülen sentetik PTH'nin elde edilmesi ile geliştirilen N- terminal (1-84) formülasyonu hipoparatiroidi tedavisi için umut verici olabilmesi ve rekombinant ilaç üretimi alanında bilimsel çalışmalara katkı sağlaması amaçlanmıştır.
PRP'den elde edilen lipid fraksiyonunun yara iyileşme tedavisinde etkisi ve ilişkili genlerin MRNA ekspresyon profillerinin değerlendirilmesi
Günümüzde yara iyileşmesi tedavisi olarak uygulanan birçok yöntem olmasına karşın yara kapanma hızını arttırmak, en az yara izi oluşumunun sağlamak ve hissedilen acıyı en aza indirgemek amacıyla yara üzerine çalışmalar devam emektedir. Son zamanlarda, içerdiği bileşenlerin rejenerasyonu arttırıcı etkisi ortaya konulan PRP (plateletten zengin plazma) tedavisi, yara iyileşmesi çalışmalarının da popüler konusu haline gelmiştir. PRP'nin içeriğini oluşturan protein ve lipid yapılı biyoaktif biyomoleküller yara iyileşmesini moleküler düzeyde uyararak iyileşmeyi hızlandırırlar. PRP'nin bileşenlerinden protein yapılı olanların yara bölgesinde bulunan proteaz aktivitesi ile yıkılarak işlevsiz hale geldiği bu sebeple PRP'nin iyileştirici etkisinin protein yapılı bileşenlerinden ziyade lipid yapılı olanların aktivitesi ile gerçekleştiği üzerine yapılan in vitro çalışmalar literatürde yer almaktadır. Söz konusu hipotezin in vivo olarak test edilmesi, tez çalışmamızın konusu olup, PRP'den elde edilen lipid fraksiyonunun yara iyileşmesi üzerindeki etkisi makroskopik ve moleküler olarak değerlendirilmiştir. Makroskopik anlamda yara alanlarına bağlı yara kontraksiyon hesaplamaları yapılırken moleküler anlamda ise yara iyileşmesiyle ilişkili olduğunu bildiğimiz 84 tane farklı genin mRNA ekspresyon seviyeleri analiz edilmiştir. mRNA protein sentezinde genetik şifreyi taşıyan RNA molekülü olup ekspresyon profillerinin değerlendirilmesi yara iyileşmesi süresince moleküler seviyede meydana gelen protein sentezi hakkında bilgi vermektedir. Çalışmamızın hayvan deneyleri, 20 tane Sprague Dawley türü sıçanların sırt bölgelerinde yaklaşık 1.2 cm çapında dairesel tam kat yaralar oluşturularak 4 faklı grup üzerinden tamalanmıştır. PRP, lipid fraksiyonu, DMSO ve SHAM grublarına ait yaralardan yara iyileşmesinin inflamasyon, proliferasyon ve olgunlaşma (yeniden şekillenme) evrelerine denk gelen 3., 7., ve 14. günde biyopsi örneği alındı. Alınan biyopsi örneklerinden yararlanılarak PCR array tekniği ile gerçek zamanlı PCR yapıldı ve yara iyileşmesi genlerine ait ekspresyon seviyeleri analiz edildi. 2ˆΔΔCT yöntemi ile kat değişimleri hesaplandı ve artış veya azalış gösteren genler belirlendi. Günlere göre regülasyon gösteren gen sayısı bakımından en fazla sayıda gen regülasyonu proliferasyon evresinde gözlenmiştir. PRP ve lipid fraksiyonu tedavi grupları inflamasyon, proliferasyon ve olgunlaşmada benzer regülasyonları gösterse de kat değişimleri açısından PRP daha fazla fark göstermiştir. Makroskopik değerlendirmelerde lipid fraksiyonu tedavi grubuna ait yaraların PRP'ye göre kapanma hızının daha az olduğu tespit edilmştir. PRP grubuna ait yara kontraksiyon bulguları T-test ile analiz edildi ve istatistiksel olarak anlamalı bulundu. PRP tedavi grubu ve lipid fraksiyonu tedavi grubuna ait RT-PCR verileri, moleküler seviyede benzerlik göstermeleri açısından PRP'den elde edilen lipid fraksiyonu, PRP'nin sahip olduğu içeriğe ve iyileştirici etkiye sahip olduğu ancak PRP'nin daha etkili olduğu sonucuna varılmıştır. Anahtar Kelimeler : Yara, Yara İyileşmesi, PRP, Lipid Fraksiyonu, mRNA Profili, PCR Array
Format dehidrogenaz enziminin candida boidinii'den moleküler olarak klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Modern biyoteknoloji endüstrisinde enzim üretimi önemli bir yer tutmaktadır. Klasik yöntemlerle bitkisel ve hayvansal kaynaklardan enzim eldesinin ekonomik olmaması, kalite ve miktar standardizasyonunun yakalanmasının zor olması gibi faktörler mikrobiyal kaynaklara olan eğilimi artırmıştır. Rekombinant DNA teknolojisinin gelişmesi ve mikroorganizmalarda kolaylıkla manipüle edilmesi ile birlikte rekombinant enzimlerin endüstriyel pazarının büyüyerek 2016 yılında 4.61 milyar dolara çıktığı açıklanmıştır ve 2017-2022 öngörü raporlarına göre %5.8'lik yıllık bileşik büyüme oranı ile 6.3 milyar dolara ulaşması beklenmektedir. NAD+-bağımlı format dehidrogenaz (FDH, EC 1.2.1.2), format iyonlarını CO2'ye yükseltgeyerek NAD+ molekülünü NADH'a indirgeyen bir enzimdir. Enzimatik indirgemenin önemli olduğu reaksiyonlarda NAD(H) ve NADP(H) gibi pahalı kofaktörlere ihtiyaç vardır. Ekonomik alternatifler sunmak amacıyla kofaktörlerin geri dönüştürüldüğü metotlar dizayn edilmiştir. Bu metotlarda; kofaktör geri dönüşümünde hiçbir yan ürün biriktirmeyen, ana reaksiyonun substratına karşı inert olan böylelikle istenmeyen izomerler oluşturmayan, termodinamik denge olarak uygun olan, geniş pH aralığında çalışabilen, ucuz substratlara gereksinim duyan FDH enzimi sahip olduğu bu avantajlı özellikleri ile en çok tercih edilen enzimlerden biridir. Özellikle farmasötikler için önemli olan optikçe aktif bileşiklerin üretiminde ve rutin biyokimya laboratuvarlarında tanılama testlerinde kullanımından dolayı FDH enziminin sentetik üretimi son yıllarda önem kazanmıştır. Yapılan çalışmalar, çeşitli metilotrof maya ve bakterilerden FDH enziminin rekombinant olarak üretilebildiğini göstermiştir. Bu çalışmada, Candida boidinii (C. boidinii) mayası ATCC 18810 suşunda FDH enzimini kodlayan gen bölgesinin rekombinant tekniklerle Escherichia coli (E. coli) bakterilerine klonlanması, gen ürünü olan proteinin eksprese edilmesi ve karakterizasyonunun gerçekleştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda ilk olarak C. boidinii mayasının genomik DNA'sı izole edilmiş, tasarlanan primerler ile polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirilerek hedef FDH gen bölgesi çoğaltılmış ve beklenen 1104 bp'lik bant görülmüştür. Çoğaltılan gen TA klonlama metodu ile pTZR57R/T vektörüne klonlanmış, elde edilen rekombinant vektör pTZR57R/T+FDH ile E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücreleri transforme edilmiştir. Transformasyon gerçekleştikten sonra rekombinant vektör NdeI ve BamHI restriksiyon enzimleri ile kesilmiş ve hedef gen bölgesi ekspresyon vektörü olarak kullanılan pET-14b vektörü ile birleştirilerek E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücrelerine aktarılmıştır. Transformasyonun başarısı koloni PCR, restriksiyon enzim kesimi ve dizi analizleri ile onaylanmıştır. Sonrasında elde edilen rekombinant pET-14b/FDH vektörü ile ekspresyon hücresi olarak kullanılan E. coli One Shot® BL21 (DE3) hücrelerinin transformasyonu gerçekleştirilmiştir. FDH enziminin üretimi için gen ekspresyonu IPTG ile indüklenmiş, Ni-NTA afinite kolon kromatografisi ile hücredeki diğer proteinlerden ayrıştırılarak saf bir şekilde eldesi sağlanmıştır. Hedef proteinin varlığını görmek için SDS-PAGE ve Western blot analizleri yapılmış ve beklenen 41 kDa'luk bant görülmüştür. Son olarak FDH enziminin ideal koşullardaki aktivitesini bulmak için testler yapılmış, enzimatik reaksiyon ürününün 340 nm'deki absorbans değerlerine bakılarak değerlendirme yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmalarının sonucunda; pH 8.0 Tris tampon çözeltisinde, 40 mM format substrat konsantrasyonunda, 60°C'a kadar olan sıcaklıklarda enzimin aktif olarak çalıştığı belirlenmiştir. Farmasötik endüstrisinde ve rutin biyokimya laboratuvarlarında sıklıkla kullanılan bu enzim ülkemizde yurtdışı kaynaklardan temin edilmekte ve pahalıya mâl olmaktadır. Bu çalışma, NAD+-bağımlı FDH enziminin yerli olarak üretilmesi ve endüstriyel sahada büyük ölçekte üretime geçilmesi için veri sağlaması açısından önemlidir.
Işığa-duyarlı akıllı ilaç taşıyıcı sistemler: DNA-polimer ve protein-polimer konjugatlarının sentezi ve karakterizasyonu
Son zamanlarda özellikle kanser gibi önemli hastalıkların tedavisi için yeni metodların geliştirilmesine yönelik artan ihtiyaç sebebiyle, konvansiyonel ilaçların yerine daha etkili olabilecek ve hastaları daha az yan etkiyle tedavi edebilme potansiyeline sahip akıllı ilaç taşıyıcı sistemler geliştirilmektedir. Bu sistemler genellikle çeşitli polimerlerle oluşturulan nanoparçacıkların içine uygun ilaçların yüklenip hastalıklı bölgeye uygun hedeflendirmenin yapılarak ilacın tüm vücuda yayılmadan sadece istenilen bölgeye uygulanabileceği şekilde tasarlanmaktadır. Bu amaçla oluşturulacak taşıyıcı sistemlerin sentezinde uygun çözücüler içinde kendiliğinden birleşme özelliğine sahip amfifilik konjugatların kullanılması bu sistemlerin kolaylıkla elde edilmesine olanak sağlamaktadır. Amfifilik yapıları oluşturmak için hidrofobik ve hidrofilik iki blok çeşitli konjugasyon yöntemleriyle bir araya getirilir. Bu yapılar tamamen sentetik polimerlerle hazırlanabilirken canlı ortamla uyumlu olmaları sebebiyle günümüzde hidrofilik blok olarak biyomakromoleküller daha yaygın olarak çalışılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada fotoaktif bir molekül olan kumarin içeren metakrilat monomeri ile tersiyer bütil akrilat monomerinin ATRP ile polimerizasyonu sonucu hidrofobik bir polimer bloğu elde edilmiştir. Hidrofilik blok olarak ise iki ayrı biyomakromolekül kullanılmıştır. İlk olarak 22 bazlı tek zincirli bir oligonükleotit ile hidrofobik polimerin CuAAC "click" reaksiyonu vasıtasıyla konjugasyonu yapılmış ve bu konjugatın karakterizasyonu için FT-IR, DLS ve UV ölçümleri alınmıştır. Bir diğer hidrofilik blok olarak ise BSA proteini kullanılmıştır. Hidrofobik polimer ile BSA'nın CuAAC "click" reaksiyonu vasıtasıyla konjuge edilmesinden sonra elde edilen konjugatın karakterizasyonu FT-IR, DSC, SDS-PAGE, UV ve floresans ile yapılmıştır. Daha sonra konjugatların distile su içerisinde misel oluşumu sağlanmış ve DLS ölçümleri ile bu misellerin parçacık boyutları belirlenmiştir. Miseller UV ışık altında (350 nm) 1 saat aydınlatılarak tekrar DLS ölçümleri yapılmış ve parçacık boyutlarındaki değişim gözlenmiştir.
Pluronik esaslı enjekte edilebilir hidrojeller
Geçmişten günümüze dek ilaç keşfi, ilaçların uygulama yöntemleri, ilaç salım sistemleri ve ilacın doz ayarlama stratejileri ile verimini artırmak gibi önemli konular sıkça çalışılmış olup özellikle 'kontrollü ve hedefli' biçimde, ilaçların istenilen bölgeye ulaşması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda çok sayıda strateji geliştirilmiş olsa da birçok çalışmada gerek toksisite, gerekse biyouyumluluk ve biyobozunurluk kriterlerine uyum konusunda sorun yaşanmıştır. Basit bir ilacın vücutta taşınmasından gen terapiye kadar söz konusu olan tüm süreçler için, onaylı, belli koşulları sağlamış, birbirinden çok farklı kökenlere sahip yapılar kullanılarak, çeşitli yöntemlerin ve sistemlerin oluşturulması hedeflenmiştir. Polimerik jeller, çapraz bağlı polimer zincirlerinin oluşturduğu ağ şeklinde yapı ve bu ağın içindeki çözücünün bir arada olduğu ikili sistemlerdir. Fiziksel özellikleri sıcaklık ve zaman değişimine bağlı olarak katı-sıvı arasındadır. Jeller, daha yüksek sıcaklıkta ve kısa zaman skalasında sıvı formdadır. Genel olarak, sıvı jeller viskoz davranış sergilerken, katı jeller elastik davranış sergilemektedir. Bu durum viskoelalastik davranış olarak ifade edilmektedir. Eğer bir jelin ağ yapısı içinde var olan sıvı ortam su ise, bu jeller hidrojel olarak adlandırılmakta olup bu yapılar üstün ve benzersiz özelliklerinden dolayı en önemli jel sistemlerindendir. Bu durumun temel sebepleri arasında hem kendi özelliklerinden dolayı gerçek doku ve organlara yüksek oranda benzerlikler göstermeleri hem de çoğu zaman jeli oluşturan temel moleküllerin istenilen özelliklere sahip seçilebilme, uyarlanabilme ve yönetilebilme gibi avantajları gösterilmektedir. Özellikle sıcaklığa ve pH'ya duyarlı hidrojeller, ayarlanabilir şişme ve ilaç salım özelliklerinden dolayı ilaç taşıyıcı sistemi olarak en çok tercih edilen hidrojel yapılarındandır. Blok kopolimerler bu hidrojel sistemlerinin oluşturulmasında kullanılan önemli polimer gruplarındandır. Bu polimer çözeltilerinin en önemli iki özelliği sıcaklığa bağlı miselleşmesi ve jel oluşumudur. Poloksamerler, diğer bir adıyla pluronikler, söz konusu blok kopolimer sınıfında olup, belli koşullarda jelleşme özelliğine sahip, hidrofilik ve hidrofobik bölgeleri sayesinde hem kendi içinde hem de moleküller arasında etkileşimler gösterebilen yapılardır. Pluronik sınıfının içerisinde en çok bilinen türlerinden olan Pluronik F127 (F127) polimeri, sıkça çalışılan hidrojel yapılarının temelinde rastlanan bir polimer grubudur. Amerikan Gıda ve İlaç Kurumu (U.S. FDA) onaylı olan F127, gıda katkısı, kozmetik, ilaç endüstrisi gibi alanlarda çok farklı uygulamalarda kullanılmasına rağmen fiziksel etkileşimlerle biraraya getirilen bu jellerin mekanik dayanımlarının yetersiz olması ve fizyolojik çevrede çok hızlı çözünüyor olması en büyük dezavantajlarındandır. Bu durumu iyileştirmek amacıyla, karışık misel yapılarının kullanılması, farklı polimer zincirleri ile etkileşimlerin arttırılması, sisteme nanoparçacıkların eklenmesi veya iç-içe ağ yapılı sistemlerin oluşturulması gibi çok farklı yöntemler kullanılmaktadır. Bu çalışma kapsamında F127 esaslı, biyouyumlu, fiziksel çapraz bağlı, vücut ısısında jelleşebilen, muko-adeziv ve enjekte edilebilir ve en önemlisi mekanik dayanımları arttırılmış jel sistemleri oluşturulması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, F127 içeren çözeltilere sırasıyla hiyalüronik asit, siklodekstrinler ve türevleri, jelatin ve poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA)/polietilen glikol (PEG) yapıları katılarak dört farklı sistem üzerinde çalışılmıştır. Her bir formülasyon için değişen konsantrasyonlarda yapıların akış davranışları, enjekte edilebilirlikleri ve muko-adeziv özellikleri detaylı bir şekilde incelenmiştir. Hedeflenen amaç doğrultusunda elde edilecek jellerin ilerleyen dönemlerde kulak cerrahi operasyonlarında kullanılması planlanmaktadır.
Sülforafanın 769-P insan böbrek kanser hücre dizisinde apoptoz üzerine etkisi ve hücre migrasyonunun inhibisyonu
Kanser görülme sıklığı dünyada giderek artmaktadır. Sağlıklı hücrelerde meydana gelen fenotipik ve genotipik değişiklikler sonucunda kanser meydana gelmektedir. Kontrolsüz hücre proliferasyonu sebebiyle hücreler anormal şekilde çoğalarak invazyon ve metastaz özelliği kazanırlar. Böbrekler metabolizma tarafından üretilen artık maddelerin vücuttan uzaklaştırılmasında ve homeostazın sağlanmasında önemli fonksiyonlara sahiptir. Böbrek kanseri; ürogenital kanserler içerisinde yer almakta ve insidansı gittikçe artmaktadır. Son yıllarda bitkisel kaynaklı besinlere olan ilgi artmaktadır ve geleneksel tedavileri desteklemek amacıyla sıklıkla tercih edilmektedir. Tarih boyunca da tedavilerde bitkisel gıdalar kullanılmış olup biyoaktif bileşenlerin aynı zamanda kanserin önlenmesinde farmakolojik ve fizyolojik etkilerinin olduğu savunulmaktadır. Diyetle alınan besinlerdeki kemopreventif bileşikler; hücre içi sinyal iletim yolaklarını düzenleme veya kanser oluşum sürecini uzatarak çeşitli koruyucu etkiler meydana getirmektedir. Brokoli, karnabahar, beyaz ve karalahana, Brüksel lahanası gibi Brassicaceae olarak da bilinen turpgiller ailesindeki sebzeler 'glukosinolat ' adı verilen bileşik içerirler. Glukosinolatlar, mirosinaz enzimi tarafından katalizlenen reaksiyona girerler. Parçalanma ürünü ise izotiyosiyanatın karakteristik bir bileşiği sülforafan (SFN)'dır. SFN kemopreventif etkileri sayesinde son yıllarda büyük ilgi görmektedir. Çok sayıda epidemiyolojik araştırmalar ile in vivo ve in vitro çalışmalar, SFN'nin kanseri önleyici ya da riskini azaltıcı potansiyeli olduğunu belirlemiştir. SFN'nin çeşitli hücre hatları üzerindeki proapoptotik etkileri tanımlanmıştır fakat literatürde böbrek kanserinde apoptoz üzerine olan etkisi için yeterli çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada SFN'nin 769-P insan böbrek kanser hücre hattı üzerindeki etkisi araştırılmış ve kontrol grubu olarak 293-T insan böbrek epitel hücre hattı kullanılmıştır. Bu amaçla çeşitli SFN konsantrasyonları hazırlanmış ve hücre hatları üzerinde etkileri incelenmiştir. Hücre proliferasyonu üzerine etkisinin gözlenmesi için MTT [3-(4, 5-dimetil tiyazol-2-il)-2, 5 difenil tetrazolyum bromid] testi (24. ,48. ,72. saat) ve sitotoksik etkinin belirlenebilmesi için LDH (Laktat dehidrogeneaz) testi uygulanmıştır. Analizler sonucu seçilen konsantrasyonlarda hücre döngüsü inhibisyonları saptanmıştır. SFN'nin hücrelerde meydana getirdiği apoptotik etkinin belirlenebilmesi için erken ve geç apoptotik hücreler Anneksin V yöntemi ile analiz edilmiştir. 769-P insan böbrek kanser hücre hattında ise doza bağımlı şekilde hücre migrasyonunun inhibisyonu incelenmiştir.
Işığa duyarlı kumarin fonksiyonlu amfifilik kopolimerlerin sentezi, karakterizasyonu ve ilaç taşıyıcı uygulamaları
İlaç taşıyıcı sistemler, terapötik aktiviteyi arttırırken yan etkileri en aza indirmeye duyulan ihtiyaçtan dolayı sürekli gelişmektedir. Son zamanlarda oldukça ilgi çeken ilaç taşıyıcı sistemlerinden biri dış uyaranlara duyarlı amfifilik blok kopolimerlerin sulu çözeltilerde kendiliğinden bir araya gelmesiyle oluşturulan misellerdir. Dış uyaranlara yanıt veren polimerler arasından ışığa-duyarlı olanlar özellikle ilgi çekmektedir. Foto-tersinir dimerleşme yapabilen ve polimerik sistemlerde yaygın olarak kullanılan bu yapılar genellikle uygun bir dalga boyundaki ışığın uygulanması ile tersine çevrilebilecek bir [4 + 4] - veya [2 + 2] - siklokatılma mekanizması ile ilerlemektedir. Kontrollü radikal polimerizasyon (KRP) tekniklerinin ve "click" reaksiyonlarının gelişmesiyle hassasiyet kazanan polimer sentezindeki ilerlemeler, polimerik yapıtaşlarının tasarlanmasında esneklik, çeşitlilik ve işlevsellik açısından muazzam imkanlar ortaya çıkmıştır. Bu çok yönlülük polimerik yapıtaşlarının kendiliğinden bir araya gelerek oluşturdukları nanoyapıların istenilen boyutta ve şekilde oluşturulmasını sağlamıştır. KRP tekniklerinin hidrofobik ve hidrofilik kopolimerlerin sentezinde kullanılan diğer basit tekniklere göre üstünlüğü, polimerlerin molekül ağırlığının, dizilişinin ve uç grup fonksiyonalitelerinin kontrolünü sağlamasıdır. Bu çalışmada, kontrollü polimerizasyon tekniklerinin ve "click" reaksiyonlarının avantajları kullanılarak ışık vasıtasıyla dimerleşebilen kumarin grupları içeren amfifilik bir blok kopolimer sentezlenmiş, bu kopolimer ile misel oluşturulmuş ve ilaç taşıma etkinliği incelenmiştir. Hidrofobik bloğu oluşturmak amacıyla glisidil metakrilat (GMA) monomeri tersinir katılma-ayrışma zincir transfer polimerizayonu (RAFT) vasıtasıyla polimerleştirilmiş, sonrasında glisidil fonksiyonları NaN3 ile azitlenerek "click" reaksiyonu vasıtasıyla belli bir oranda kumarin grupları takılmıştır. Elde edilen bu polimer PEG metakrilat monomerinin RAFT polimerizasyonunda makrobaşlatıcı olarak kullanılmış ve amfifilik kopolimer elde edilmiştir. Çalışma sırasında sentezlenen polimerler FT-IR, 1H NMR, UV, floresan ve DSC ile karakterize edilmiştir. Son aşamada diyaliz yöntemi kullanılarak amfifilik kopolimer ile misel oluşturulmuş, ilaç taşıma etkinliğini belirlemek amacıyla da misellere doksorubisin (DOKS) yüklenmiştir. İlaç yüklü ve boş misellerin partikül boyutları DLS ile ölçülerek TEM görüntüleri sonucunda elde edilen boyutlarla karşılaştırılmıştır. Elde edilen miseller ayrıca 350 nm dalgaboyunda aydınlatılarak meydana gelen değişiklikler gözlenmiştir.
Helicobacter pylorı ve epstein barr virüsü ilişkili gastrik karsinomların P73 ekspresyon profili ve klinikopatolojik parametrelerle ilişkisi
Mide kanseri dünyada en sık görülen kanserlerden biri olup kanserle ilişkili ölümlerde üçüncü sırada yer almaktadır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) gastrik adenokarsinomun birincil nedeni olarak Helicobacter pylori (H.pylori) enfeksiyonunu göstermiştir. Epidemiyolojik çalışmalar ve bir çok meta analiz H.pylori enfeksiyonu ile mide kanseri arasında güçlü bir korelasyon saptamıştır. Yine yapılan çalışmalarda Epstein Barr virüsü (EBV) ilişkili gastrik karsinomlar %5-10 arasında bulunmuştur. P73 tümör baskılayıcı aday bir gen olduğu üzerinde durulmaktadır. Bu çalışmada; gastrik kanserli hastalarda, H. pylori ve EBV pozitif ve negatif tümör dokuları arasında p73 gen ekspresyon durumlarının karşılaştırılması ve bu değişimlerin, hastalara ait klinik ve patolojik özellikler ile ilişkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda mide kanserli 111olgu ile, kansersiz 110 olgu ele alındı. Kanserli olgular total ya da subtotal gastrektomi materyallerinden, kansersiz olgular ise mide küçültme operasyonu uygulanmış sleeve gastrektomi materyallerinden oluşmakta idi. Hastalara ait demografik veriler ile tümörlere ait histopatolojik veriler ve tümör evrelemesi ile ilgili sonuçlar hastane kayıt sistemi ve patoloji raporlarından elde edildi. Arşivdeki lamlar üzerinden olgular H.pylori yönünden tekrar değerlendirildi. Uygun görülen bloklar seçilerek yapılan kesitlere immünhistokimyasal (İHK) olarak p73, EBV varlığı için de in-situ hibridizasyon (ISH) yöntemi ile EBER uygulandı. Olguların %68,5'i erkek, %31,5'i kadındır. Erkeklerde en küçük yaş 37, kadınlarda 34'dür. Tümör yerleşimi %54,1 ile en sık distal bölge, %45,9 ile de proksimal yerleşimlidir. Tümörler %72,1 diffüz tipteyken, %27,9 intestinal tiptedir. Tümör evreleri incelendiğinde %15,3'ünün evre I, %12,6'sının evre II, %65,8'inin evre III ve %6,3'ünün evre IV olduğu görülmüştür. %36,9 hastada H. pylori ve %7,2 hastada EBV pozitiftir. İnvazyon durumlarına bakıldığında tümörlerin %75,7 lenfatik, %56,1 kan damarı, %73,5 perinöral ve %37,0 pleksus invazyonu yaptıkları görülmüştür. %81,9 lenf nodu tulumu vardır. Hasta ve kontrol grubu arasında p73 yoğunluğu açısından anlamlı bir farklılık bulunmuştur. Ancak EBV ve H.pylori varlığının p73 yoğunluğu ile anlamlı bir farklılık oluşturmadığı gözlenmiştir. Diğer taraftan, kan damarı invazyon varlığına göre p73 yoğunluğu açısından anlamlı fark saptanırken diğer parametrelerle anlamlı fark belirlenememiştir. Tümör yerleşim yerine göre p73 yoğunluğu açısından da anlamlı fark saptanamamıştır. Cinsiyetler arasında yaş ve tümör çapı açısından istatiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. p73 geninin gastrik karsinomlarda aday bir tümör süpresör gen olduğu belirtilmektedir. Çalışmamızda elde ettiğimiz bulgular, normal mide dokularında saptanmazken, mide karsinomu gelişiminde p73 gen ürünü olan bu proteinin etkili olduğunu göstermiştir. Ancak bulgularımız EBV ve H.pylori varlığının gastrik kanserlerde p73 salınımını arttırdığını yeterli düzeyde ortaya koyamamıştır. Olgu sayısının arttırılması ve diğer aday tümör süpresör genlerin de araştırılması bu alanda yapılabilecek ileri çalışmaları gerektirmektedir. Anahtar kelimeler: Gastrik karsinom, mide kanseri, Helicobacter pylori, Epstein Barr virüsü, p73.
İlaç taşıyıcı olarak fotoduyarlı amfifilik yıldız kopolimerlerin sentezi ve karakterizasyonu
Son yıllarda ilaç etkinliğini arttırma, hedefli taşıma ve özellikle kanser terapötiklerinin yan etkilerini en aza indirgeme avantajları sebebi ile ilaç taşıma sistemleri ön plana çıkmış ve bu alandaki çalışmaları arttırmıştır. Bunula birlikte, özellikle dış uyaranlara yanıt veren amfifilik blok kopolimerlerin oluşturduğu miseller ilgi çekmektedir. Doğrusal polimer analoglarına kıyasla avantajlı özellikleri barındıran yıldız kopolimerlerin geliştirilmesi önem kazanmıştır. Kontrollü radikal polimerizasyon teknikleri ile istenilen boyutta ve işlevsellikte polimer yapılarının elde edilmesi ile misel yapılarının geliştirilmesi sağlanmıştır. Işığa duyarlı misellerin oluşturulması ile misel stabilizasyonu, salım mekanizması ve hedefleme gibi özellikler elde edilmeye çalışılmaktadır. Bu çalışmada, kontrollü polimerizasyon tekniği kullanılarak ışık vasıtası ile dimerize olabilen antrasen grupları bulunduran amfifilik yıldız blok kopolimeri sentezlenmiş, bu kopolimer ile misel oluşturulmuş ve miselin ilaç taşıma etkinliği incelenmiştir. Hidrofobik yıldız kollarını oluşturmak amacıyla metil metakrilat ve antrasen metakrilat monomerleri birlikte atom transfer radikal polimerizasyonu (ATRP) ile polimerleştirilmiştir. Elde edilen bu polimer poli(etilen glikol) metil eter metakrilat monomerinin ATRP polimerizasyonunda makrobaşlatıcı olarak kullanılmış ve amfifilik yıldız blok kopolimer elde edilmiştir. Çalışmada sentezlenen polimerler FT-IR, 1H NMR, UV-Vis ve DSC ile karakterize edilmiştir. Bir sonraki aşamada, diyaliz membran yöntemi kullanılarak amfifilik kopolimer ile misel oluşturulmuş ve daha sonra ilaç taşıma etkinliğini belirlemek amacıyla misellere doksorubisin (DOKS) yüklenmiştir. Boş ve ilaç yüklü misellerin partikül boyutları DLS ile ölçülerek TEM görüntüleri sonucunda elde edilen boyutlarla karşılaştırılmıştır. Son aşamada, DOKS yüklü misellerin in vitro ilaç salım profilleri incelenmiştir.
Anti-oksidan doğal bileşiklerin kemoterapi ajanı paclitaxel ile birlikte nano misellere yüklenmesinin etkinlik ve toksisite profili açısından in -vitro ortamda gözlenen olası değişiklikler
Kemoterapi tedavisinde kullanılan kemorerapötik ajanlar sadece kanser tümöründe etki etmek ile kalmayıp, sağlıklı bölgelerde de toksik etkilerin oluşmasına sebep olabiliyorlar. Bu maddeler yan etkilerini zaman zaman oksidasyon ile göstermektedirler. Bu noktadan hareketle bazen kanser tedavisinde kemoterapi sırasında hastalara antioksidan doğal ürün tüketmeleri tavsiye edilmektedir. Ancak bu antioksidan maddelerin kanser tümör bölgesinde kemoterapi ajanının yarattığı oksidasyon etkisini azaltabilir ve kemoterapi ajanının tam olarak etki göstermesine engel olabilir. Bu konu aydınlığa kavuşturulmalıdır. Bu noktadan hareketle antioksidan etkisi olan curcumin, quercetin ve rosmarinik asit bileşiklerin kemoterapi ajanı paclitaxel ile birlikte kanser hücrelerine uygulanıp bu ajanın etkisini hangi yönde değiştirdiği araştırılmıştır. Bunun için adı geçen doğal antioksidanlar bileşikler nano-taşıyıcılara yüklenip paclitaxel ile birlikte meme kanseri hücreleri üzerinde ne yönde etki gösterdiği araştırılmıştır. Doğal antioksidanların nano-taşıyıcıya yüklenme sebebi ise bu maddelerin düşük sudaki çözünürlüğünün giderilerek yüksek oranda hücrelere uygulanabilmesidir. Bunun için polylactidecoglycolide (PLGA) nano-miselleri kullanılmıştır. Paclitaxel'in ise suda çözünür ticari formu hücrelere uygulanmıştır. Her antioksidan maddenin nano-formülasyonu ayrı ayrı o/w yöntemi kullanarak hazırlanmıştır. Bunun için antioksidan ile PLGA birlikte aseton içinde çözünmüş ve yüzey aktif madde içeren suya yavaşça damlatılmıştır. Organik çözücü gece boyunca karıştırılarak oda sıcaklığında uzaklaştırılmıştır. Elde edilen nano fomülasyonların boyutları DynamicLightScattering (DLS) yöntemi ile tayin edilmiştir. Anti oksidanlar artan konsantrasyonlarla nano-taşıyıcıya yüklenmiştir ve agregat gözlenmeyen en yüksek konsantrasyon yani tüm bileşiğin miselin içine yüklendiği formülasyon optimize formülasyon olarak kabul edilmiştir. Paclitaxel'in IC 50 değerine eşit miktarda konsantrasyonu nano-anti oksidanların çeşitli konsantrasyonları ile birlikte MCF-7 insan meme kanseri hücrelerine uygulanmış ve hücre canlılığındaki değişimler gözlenmiştir. Hücre canlılığı SulforhodamineB testi ile ölçülmüştür. Ayrıca nano-anti oksidan paclitaxel ile birlikte, paclitaxel'den 1 saat önce ve paclitaxel'den 1 saat sonra hücrelere uygulanmış ve böylece uygulama zamanının sonuçlarda ne gibi değişiklik yaratabileceği de incelenmiştir. Sonuç olarak kürkümin'in Paclitaxel'in anti-tumor etkisini büyük oranda azalttığı gözlenmiştir. Quercetin ise doza bağlı bir şekilde paclitaxel'in anti-tumor etkisini azaltmıştır. Rosmarinik asitin ise belirgin bir etkisi tespit edilmemiştir. Uygulama zamanının ise bu etkilerin değişimi üzerinde bir fonksiyonu olmadığı gözlenmiştir. Nihai olarak anti oksidanın biyo-yararlanımı ve kandaki konsantrasyonu bilinmediği müddetçe tümör bölgesinde hangi oranda bulunacağı da meçhul kalacaktır denebilir. Bu da xii doğal anti oksidanın kemoterapinin etkisini tümör bölgesinde hangi yönde etkileyeceğinin bilinmemesine sebep olacaktır. Buradan yola çıkarak, anti oksidanların kemoterapi ajanının etkisi ve nihai olarak kanser tümörünün büyümesi üzerindeki olumsuz etkisi tam anlaşılmadan kanser tedavisi süresince kullanılmaması gerektiği kanısına açıkça varılabilir.
Kırım kongo kanamalı ateş virüsü kelkit suşu gc glikoproteininin ökaryotik ekspresyon sisteminde üretilmesi
Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsü (KKKAV) keneler aracılığı ile taşınan bir virüs olup Afrika, Asya, Doğu Avrupa ve Orta Doğu'da etkili olan mortalite oranı %30'lara ulaşabilen bir kanamalı ateş etkenidir. KKKAV, Bunyaviridae ailesinin Nairovirüs cinsine ait olan zarflı, tek sarmallı, negatif polariteli bir RNA virüsüdür. Kene ile taşınan virüsler arasında en geniş coğrafi yayılıma sahip olması ve Dengue virüsten sonra medikal anlamda en önemli ikinci arbovirüs olması sebebi ile dikkat çekmektedir. Bunyaviridae ailesinin diğer üyelerinde olduğu gibi KKKAV'de üç adet yapısal protein barındırmaktadır. Üç segmentli bu virüsün small (S) segmentinden nükleoprotein, large (L) segmentinden RNA-bağımlı-RNA polimeraz, medium (M) segmentinden ise Gn ve Gc olmak üzere iki adet yapısal glikoprotein kodlanmaktadır. M segment open reading frame (ORF)' inden 1684 aminoasit uzunluğunda bir poliprotein üretilir. Ardından SKI-1 ve SKI-1 like proteaz ile Pre-Gn ve Pre-Gc ve posttranslasyonel kesimler sonucunda 37 kDa boyutunda Gn ve 75 kDA boyutunda Gc glikoproteinleri oluşmaktadır. Hücre yüzey reseptörleri ile etkileşime geçmeleri, virüsün konak hücreye girişini sağlamaları ve nötralizan antikorlar için hedef olmaları sebebi ile viral glikoproteinler virüslerin yaşam döngüsünde önemlidir. KKKAV'de nükleokapsit proteininin immunolojik özellikleriyle ilgili çalışmalar literatürde nispeten bulunmasına rağmen, bu virüsün glikoproteinleri Gn ve Gc'ye yönelik çalışmalar yeni yeni ortaya konmaya başlanmıştır. Bu çalışmada KKKAV glikopretini Gc'ye karşı humoral immün yanıtın araştırılması için fonksiyonel bir rekombinant protein üretmek hedeflenmiştir. Bu amaçla Pichia pastoris'te üretilip saflaştırılan Kelkit suşuna özgü Gc'nin otantik antijeniteye sahip olduğu, KKKAV infeksiyonu geçirmiş insan serumlarıyla yapılan Western blot ve EIA testleriyle gösterilmiştir. Gc'nin antijenitesi tavşan ile yapılan deneylerle de gösterilmiştir. Çalışmamızın sonuçları P. pastoris'in KKKAV glikoproteini Gc'yi üretmek için uygun bir model organizma olduğunu göstermiştir. Ayrıca KKKAV glikoproteini Gc'ye özgü antikorların KKKAV infeksiyonu geçirmiş hasta serumlarında ve inaktif virüs ile infekte tavşan serumu içerisinde bulunduğu tespit edilmiştir. P. pastoris'te rekombinant olarak üretilen Gc ile diyagnostik ve bağışıklama alanlarında daha ileri düzey işlevsel çalışmalar gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: Kırım Kongo Kanamalı Ateş Virüsü; glikoprotein; maya; Pichia pastoris
Pluronik esaslı enjekte edilebilir hidrojeller
Geçmişten günümüze dek ilaç keşfi, ilaçların uygulama yöntemleri, ilaç salım sistemleri ve ilacın doz ayarlama stratejileri ile verimini artırmak gibi önemli konular sıkça çalışılmış olup özellikle 'kontrollü ve hedefli' biçimde, ilaçların istenilen bölgeye ulaşması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda çok sayıda strateji geliştirilmiş olsa da birçok çalışmada gerek toksisite, gerekse biyouyumluluk ve biyobozunurluk kriterlerine uyum konusunda sorun yaşanmıştır. Basit bir ilacın vücutta taşınmasından gen terapiye kadar söz konusu olan tüm süreçler için, onaylı, belli koşulları sağlamış, birbirinden çok farklı kökenlere sahip yapılar kullanılarak, çeşitli yöntemlerin ve sistemlerin oluşturulması hedeflenmiştir. Polimerik jeller, çapraz bağlı polimer zincirlerinin oluşturduğu ağ şeklinde yapı ve bu ağın içindeki çözücünün bir arada olduğu ikili sistemlerdir. Fiziksel özellikleri sıcaklık ve zaman değişimine bağlı olarak katı-sıvı arasındadır. Jeller, daha yüksek sıcaklıkta ve kısa zaman skalasında sıvı formdadır. Genel olarak, sıvı jeller viskoz davranış sergilerken, katı jeller elastik davranış sergilemektedir. Bu durum viskoelalastik davranış olarak ifade edilmektedir. Eğer bir jelin ağ yapısı içinde var olan sıvı ortam su ise, bu jeller hidrojel olarak adlandırılmakta olup bu yapılar üstün ve benzersiz özelliklerinden dolayı en önemli jel sistemlerindendir. Bu durumun temel sebepleri arasında hem kendi özelliklerinden dolayı gerçek doku ve organlara yüksek oranda benzerlikler göstermeleri hem de çoğu zaman jeli oluşturan temel moleküllerin istenilen özelliklere sahip seçilebilme, uyarlanabilme ve yönetilebilme gibi avantajları gösterilmektedir. Özellikle sıcaklığa ve pH'ya duyarlı hidrojeller, ayarlanabilir şişme ve ilaç salım özelliklerinden dolayı ilaç taşıyıcı sistemi olarak en çok tercih edilen hidrojel yapılarındandır. Blok kopolimerler bu hidrojel sistemlerinin oluşturulmasında kullanılan önemli polimer gruplarındandır. Bu polimer çözeltilerinin en önemli iki özelliği sıcaklığa bağlı miselleşmesi ve jel oluşumudur. Poloksamerler, diğer bir adıyla pluronikler, söz konusu blok kopolimer sınıfında olup, belli koşullarda jelleşme özelliğine sahip, hidrofilik ve hidrofobik bölgeleri sayesinde hem kendi içinde hem de moleküller arasında etkileşimler gösterebilen yapılardır. Pluronik sınıfının içerisinde en çok bilinen türlerinden olan Pluronik F127 (F127) polimeri, sıkça çalışılan hidrojel yapılarının temelinde rastlanan bir polimer grubudur. Amerikan Gıda ve İlaç Kurumu (U.S. FDA) onaylı olan F127, gıda katkısı, kozmetik, ilaç endüstrisi gibi alanlarda çok farklı uygulamalarda kullanılmasına rağmen fiziksel etkileşimlerle biraraya getirilen bu jellerin mekanik dayanımlarının yetersiz olması ve fizyolojik çevrede çok hızlı çözünüyor olması en büyük dezavantajlarındandır. Bu durumu iyileştirmek amacıyla, karışık misel yapılarının kullanılması, farklı polimer zincirleri ile etkileşimlerin arttırılması, sisteme nanoparçacıkların eklenmesi veya iç-içe ağ yapılı sistemlerin oluşturulması gibi çok farklı yöntemler kullanılmaktadır. Bu çalışma kapsamında F127 esaslı, biyouyumlu, fiziksel çapraz bağlı, vücut ısısında jelleşebilen, muko-adeziv ve enjekte edilebilir ve en önemlisi mekanik dayanımları arttırılmış jel sistemleri oluşturulması amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, F127 içeren çözeltilere sırasıyla hiyalüronik asit, siklodekstrinler ve türevleri, jelatin ve poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA)/polietilen glikol (PEG) yapıları katılarak dört farklı sistem üzerinde çalışılmıştır. Her bir formülasyon için değişen konsantrasyonlarda yapıların akış davranışları, enjekte edilebilirlikleri ve muko-adeziv özellikleri detaylı bir şekilde incelenmiştir. Hedeflenen amaç doğrultusunda elde edilecek jellerin ilerleyen dönemlerde kulak cerrahi operasyonlarında kullanılması planlanmaktadır.
Poli laktik-ko-glikolik asit nanopartikülleri kullanarak hedefli hücrelerde RNA interferans ile gen susturma yöntemi geliştirilmesi
Pankreas kanseri hem dünyada hem de Türkiye'de mortalite insidans oranı en yüksek kanser türleri arasında sayılmaktadır. Bu veri var olan tedavi stratejilerinin yeterince etkili olmadığını göstermektedir. Modern yöntemlere rağmen henüz etkili bir ilaç tedavisi geliştirilememiştir. Ayrıca tedavi amaçlı kullanılan kemoterapi ilaçlarının tümörü hedef alamaması ve sağlıklı dokular üzerinde etkili olması; tedavi amaçlı kullanılan radyoterapinin ise radyasyona maruz kalan sağlıklı dokuda fonksiyon kaybı oluşturması gibi bu yöntemlerin çeşitli dezavantajları vardır. Kanser tedavisinde geleneksel tedavi yöntemlerinin yerini, tümöre özgü hedeflenmiş yeni nesil tedaviler almaktadır. Hedefe yönelik tedaviler sağlıklı hücrelere zarar vermediği ve yüksek seçiciliğe sahip oldukları için oldukça ilgi görmektedir. RNA interferans (RNAi) tekniği, çekirdekte DNA tarafından kodlanan çift iplikli mi-RNA'nın tek sarmalının sitoplazmada komplementeri olan spesifik mRNA moleküllerini yıkıma uğratması sonucu, gen ekspresyonunun inhibe edildiği doğal, biyolojik bir süreçtir. Antisense etki gösteren moleküllerin hedef mRNA'ya bağlanması, genin eksprese olmasını engellemektedir. RNAi mekanizmasında, antisens etki gösteren mikroRNA (miRNA), küçük engelleyici RNA (siRNA) gibi çeşitli moleküller kullanılmaktadır. Poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) nanopartiküller; biyobozunurluk, yüksek biyouyumluluk, düşük toksisite gibi özellikleriyle kanser teşhis ve tedavisinde kullanılmaktadır. PLGA nanopartiküllerin içerisine yüklenen siRNA ile mRNA düzeyinde etkili gen susturulması mümkündür. GPR87 (G-protein bağımlı reseptör 87) geni, GPCR (G protein-bağlantılı hücre yüzeyi reseptörleri) ailesine dahil hücre yüzey reseptörünü kodlayan gendir. Pankreas kanserinde aşırı eksprese olan GPR87 geni hücrelerin canlılığını devam ettirmede önemli rol oynamaktadır. GPR87 geni, siRNA yüklü PLGA nanopartikülleri kullanılarak genin susturulması hücrelerin yaşam süresini önemli derecede etkilemektedir. Bu çalışmada farklı hücrelerde GPR87 geni PLGA nanopartikülleriyle hedeflenerek, genin RNAi mekanizmasıyla post transkipsiyonel susturulması hedeflenmiştir. Bu amaçla ilk olarak GPR87 geni HEK293T hücre hattından izole edilmiş, izole edilen gene özgü tasarlanan primerler ile genin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR ürünü ve psiCHECK™-2 vektörü XhoI ile kesilerek ligasyonu gerçekleştirilmiştir. GPR87-psiCHECK™-2 rekombinant vektörü E. coli One Shot® Mach1™-T1R hücrelerine transforme edilmiştir. Transformasyon kontrolü PCR, agaroz jel elektroforezi ve biyoinformatik araçlarla kontrol edilmiştir. Daha sonra GPR87 gen dizisine özgü siRNA üretimi gerçekleştirilmiştir. siRNA üretimi ilk önce oligonükleotit template tasarımı gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan bu template T7 promoter primer ile hibridizasyonu sağlandıktan sonra Klenow DNA polimeraz ile polimerizasyonu gerçekleştirilerek dsRNA elde edilmiştir. Tezin ikinci aşamasında PLGA nanopartiküllerinin sentezlenmesi, karakterizasyonu, optimum salım süresi ve toksisitesi tespit edilmiştir. Bu amaçla ilk önce water-oil-water (W1/O/W2) çift emülsiyon çözücü buharlaştırılması yöntemiyle PLGA nanopartikülleri hazırlanmıştır. Üç farklı formülasyonda nanopartiküller hazırlanmış ve bu nanopartiküllere siRNA yüklenmiştir. Elde edilen siRNA-PLGA nanopartiküllerinin karakterizasyonları gerçekleştirilmiş, enkapsülasyon veriminin (%EE) ve yükleme veriminin (LE) hesaplanmıştır. Ayrıca oluşturulan nanopartiküllerin in vitro salım süreci optimize edilmiş ve sitotoksisitesi ölçülmüştür. Son aşamada ise üretilen nanopartiküller insan embriyonik böbrek hücre hattı HEK293T ve pankreas hücre hattı 1.1B4 hücrelerinde gen susturma oranları lusiferaz aktivitesi ile tespit edilmiştir. Üç farklı protokol kullanarak hazırlanan siRNA-PLGA nannopartiküllerin gen susturma oranlarının farklı olduğu, yüksek enkapsülasyon ve yükleme verimliliğine sahip olduğu, in vitro salım süresinin istenilen düzeyde olduğu ve ayrıca hazrılanan siRNA-PLGA nanopartiküllerinin genin post transkripsiyonel susturulmasını sağlayarak hücre ölümüne neden olduğu belirlenmiştir.
PLGA naopartiküllerinin ve çeşitli karbonhidratlarla birleşmesinden oluşan türevlerinin hücre içine giriş yolaklarının incelenmesi
Kanser hastalığı, hücrelerin kontrolünü kaybederek aşırı şekilde bölünmesidir. Kontrolsüz olarak çoğalan bu hücreler bulunduğu bölgede birikmeye başlarlar ve tümör denilen yapıyı oluştururlar. Nano taşıyıcı kullanarak geleneksel tedavilere nazaran daha iyi tedavi sonuçları elde edilmişken, nano taşıyıcının içinde taşıdığı kemoterapi ajanıyla birlikte hücre içine girişi büyük önem taşımaktadır. Bu tezde hücrelerin maddeleri hücresel içe alım yolaklarından ve kanser hücrelerinin hızlı metabolizmalarından yararlanılarak laboratuvarda hazırlanan PLGA nano taşıyıcısının kanserli hücreler tarafından nasıl alındığı incelenmiştir. Böylelikle ileriki çalışmalarda tespit edilen hücre içine giriş yolağı daha çok kullanarak daha etkin tedaviler elde edilebilir. Kanser hücreleri beslenmek açısından alternatif enerji kaynakları bulsa da öne çıkan en büyük değişiklik glikoliz mekanizmasındaki değişikliklerdir. Kanser hücreleri Warburg etkisi ile hızlıca glikoz kaynağına ulaşmak ister. Bu isteği kullanarak nano taşıyıcı sistem olarak kullanılacak olan PLGA (poli laktik asit ko glikolik asit), glikoz ve früktoz türevi olan selüloz ve levan ile kaplanarak MCF-7 meme kanserli hücre ortamına verilmiştir. Böylelikle MCF-7 meme kanseri hücrelerinin PLGA nano taşıyıcısına olan ilgisinin arttırılması planlanmıştır. Ayrıca, nano taşıyıcı hücre giriş yolakları olan klatrin aracılıklı endositoz, klatrinden bağımsız endositoz, makro pinositoz ve fagositoz yolaklarını inhibe edecek gerekli inhibitörlerle beraber verilerek nano taşıyıcının giriş yolları incelenmiştir. Her bir hücre için giriş yolağının literatürde mevcut olan farmakolojik veya kimyasal inhibitörü mevcuttur. Bu amaç için MCF-7 meme kanseri hücreleri kullanılmıştır. PLGA nano taşıyıcısı FITC işaretli olacağından floresan mikroskopu ile takip edilebilmiştir, detaylı ölçümler ELISA cihazı ile gerçekleşmiştir. Kullanılacak selüloz kaplı PLGA, levan kaplı PLGA, FITC işaretli PLGA ve PLGA nano taşıyıcılarının boyut analizleri DLS cihazıyla ve yükleri Zeta potansiyeli ile analiz edilmiştir. İnhibitör ve nano taşıyıcıların toksisite çalışmaları da Sulforhodamine B canlılık testi ile kontrol edilmiştir. Tüm nano taşıyıcı sistemler, buharlaştırma ve çöktürme yöntemiyle hazırlanmıştır. FITC işaretli PLGA levan ve selüloz ile kaplanmıştır ve bunun FITC işaretli ve işaretsiz kaplanmamış PLGA nano taşıyıcıları hazırlanmıştır. İnhibitörlerin ve nano taşıyıcıların toksik olmayan dozları ölçülmüştür. Hücreler önce inhibitörlere maruz bırakılmış, aha sonra nano taşıyıcılar ile muamele edilmiştir. İnhibitöre maruz kalmayan hücreler kontrol olarak kullanılmıştır. İnhibitörler en çok, kaplanmamış PLGA nano taşıyıcılarının hücre içine girişini etkilemiştir bu da kaplanmamış nano taşıyıcının hücre içine girişi için daha çok yolak kullandığını göstermektedir. Selüloz ile kaplanmış PLGA ve levan ile kaplanmış PLGA açısından, chlorpromazine en yüksek oranda hücre içine giriş engellemiştir bu da kaplanan nano taşıyıcıların hücre içine giriş için klatrinden bağımsız endositozu kullandığını göstermektedir.
Bozulmuş açlık kan şekeri ve insülin direnci olan hastalarda çinko ve bakır metabolizmasının araştırılması
Diyabetes mellitus son yıllarda dünya çapında bir sağlık sorunudur. Diyabet lipid, karbonhidrat ve protein metabolizmasında uzun vadeli hasarlar yapan bir hastalıktır. Ayrıca insülin sekresyon bozuklukları, insülin direnci ve bozulmuş açlık glikoz metabolizması bireyleri diyabete yönlendiren önemli faktörler olarak kabul edilir. Son yıllardaki çalışmalarda çinko ve bakır eser elementlerinin diyabetes mellitus etiyolojisindeki rolü henüz netlik kazanmamış olmasına karşın glisemik kontrolde önemli birer faktör oldukları bilinmektedir. Bu araştırmada bozulmuş açlık glikozu (BAG) ve artmış insülin direnci (IR) ile metabolizmada önemli rolleri olan Zn ve Cu gibi eser elementler arasındaki ilişkiyi araştırmak amaçlanmıştır. BAG grubunu WHO kriterlerine göre, açlık glikoz seviyesi 100-125 mg/dL olanlar oluşturmuştur. IR grubu Homa-IR ≥2,5 olanlar ve Tip2 DM grubu tanısı olan hastalar oluşturmuştur. İnsülin direnci olmayan sağlıklı bireyler ise kontrol grubunu oluşturdu. BAG'li serumlarla kontrol ve Tip2 DM grupları; IR'liler ile kontrol grubu; Tip2 DM'liler ise kontrol grubuyla karşılaştırılmıştır. Tüm örneklerde Zn ve Cu eser element düzeyleri analiz edildi. Numunelerdeki Zn ve Cu seviyeleri otomatize klinik kimya cihazlarında ölçülmüştür. Hasta numunelerinin çalışıldığı parametreler otoanalizöre uyumlu ticari kitlerdir. Gruplar arasındaki fark student t-Testi ve gruplar arasındaki ilişki Pearson korelasyon katsayısı kullanılarak istatiksel analiz yapılmıştır. Çalışma sonuçlarına göre, BAG ve Tip2 DM hastalarında Zn seviyesinde ileri anlamlı düşüklük varken, IR grubunda ileri derecede anlamlı Cu yüksekliği belirlenmiştir. Literatüre paralel olarak çıkan sonuçlarda, açlık plazma glikozu yüksekliğinde serum Zn seviyesinde azalmalar olmaktadır. Bu hasta profillerinde çinko ve bakır arasındaki antagonistik oran genel olarak değişim göstermektedir. Çalışmada öne çıkan özgün neticeler arasında yaşın ilerlemesiyle beraber diyabete giden sürecin hızlanmış olması dikkati çekmiştir. Sonuç olarak; Zn ve Cu oranlarındaki değişikliklerin IR ya da BAG ayırmaksızın, Tip2 DM'ye zemin hazırlayan metabolizmadaki önemli bir faktör olduğu gözlendi. Prediyabette Zn takviyesinin plazma glikoz seviyesini düşürmede ve Zn/Cu oranında düzenleyici rol alarak Tip2 DM'ye ilerlemesini önlemede önemli rolü olduğu düşünülmektedir. Anahtar sözcükler: Eser elementler, çinko, bakır, insülin direnci, bozulmuş açlık glikozu, diyabetes mellitus
Tasarımla kalite (qualıty by desıgn (QBD)) yaklaşımıyla plga nanopartiküllerinin endüstriyel üretimine yönelik metot geliştirilmesi
Nanopartiküllerin endüstriyel üretimine yönelik var olan bilgi ve araştırma eksikliği bu taşıyıcıların farmasötik pazarına girişini engelleyen büyük bir etkendir. FDA tarafından altın standart olarak kabul edilen, biyouyumlu ve biyobozunurluk avantajlarıyla öne çıkan PLGA nanopartiküllerinin konvansiyonel olarak birçok üretim yöntemi olmasına karşın bu yöntemler endüstriyel ölçekte üretime uygun değildir. Kullanılan en yaygın yöntemlerden olan emülsiyon oluşturma-çözücü buharlaştırma işlemi, şırınga ile organik fazı su fazına yavaşça damlatma basamağından dolayı büyük ölçekler için uygun bir yöntem olmaktan çıkar. Yüksek basınç homojenizatörü prensibi ile çalışan Microfluidizer teknolojisi 'kendiliğinden düzenlenen (self assembly)' sistemlerin endüstriyel üretimi için uygun cihazlardır. Microfluidizer, doğrusal hacimsel ölçeklendirme sayesinde pilot üretimde geliştirme aşamalarından tasarruf sağlar ve scale-up garantisini sunar. Microfluidizer teknolojisi dar partikül boyut dağılımı sonuçları üreterek daha fazla stabilite, daha uzun raf ömrü ve verimli ham madde kullanımı sağlar. Bu çalışmada formülasyon parametreleri tasarımla kalite yaklaşımı ile optimize edilirken PLGA nanopartikülleri Microfluidizer cihazı yardımıyla pilot ölçekte üretilmiştir. FDA tarafından başlatılan, Tasarımla Kalite, önceden belirlenen hedeflere dayanan ve ürünün ilk safhasından ticarileştirildiği son safhasına kadar kontrolünü sağlayan bir yaklaşımdır. Tasarımla kalitenin temelini deneysel tasarımlar oluşturmaktadır. Merkezi kompozit tasarım ile cihaz ve formülasyon faktörleri belirlenip 60 formülasyon için deneysel matriks oluşturulmuştur. Faktör ve tepkilerle ilgili polinom denklemleri oluşturulduktan sonra Minitab 17 yazılımı ile PLGA nano ilaç taşıma sistemi ortalama partikül büyüklüğü, zeta potansiyeli ve PdI açısından optimize edilmiştir. İstenen limitler ortalama partikül büyüklüğü, zeta potansiyel ve PdI için minumum standart sapmalar olarak belirlenmiştir. Bu cevaplar sayesinde optimize PLGA miktarı, T80 miktarı, basınç seviyesi ve geçiş seviyeleri belirlenmiştir. Modelin validasyonu için endüstride sıkça kullanılan istenirlik endeksinden yararlanılmıştır. Kompozit istenirlik değeri 0,955 olarak elde edilip böylece modelin ve optimize edilmiş değerlerin hedefe iyi bir şekilde ulaştığı gösterilmiştir. Enjekte edilebilir (200 nm'den az), kararlı (zeta potansiyel -20 mv'den yüksek) ve dar bir PdI değeri (0,2'den az) ile PLGA nanopartikülleri elde edilmiştir. Anahtar kelimeler : Microfluidizer, tasarımla kalite, pilot ölçek, PLGA, merkezi kompozit tasarım
Renal hücre karsinomunda aday tümör baskılayıcı BNC1, SCUBE3, SFRP1 ve PCDH8 genlerinin epigenetik analizi
Kanser; vücudun bir organ veya dokusunda beliren bazı anormal hücrelerin kontrolsüz ve düzensiz bir şekilde proliferasyonu sonucu oluşan bir hastalıktır. Bu hücreler bir araya gelir ve tümör olarak isimlendirilen bir kitle oluştu¬rur. Kanser oluşumu; bir hücrenin, genetik yapısında ardı ardına oluşan kalıtılabilir değişikliklerin birikmesi sonucu, büyüme avantajı kazanması ile açıklanabilir. Bu süreçte etkili iki sınıf genden bahsedilir, bunlar onkogenler ve tümör baskılayıcı genlerdir. Her iki grup gende gözlenen değişiklikler kansere yol açabilir. Çevresel faktörlerin de etki ettiği kanser, genetik ve epigenetik değişiklikler sonucu oluşan bir süreçtir. Bu epigenetik değişikliklerin başında metilasyon gelmektedir. Yapılan pek çok çalışma, çok sayıda kanser türünün oluşumunda bazı genlerin hipermetilasyonlarının etkili olduğu vurgusunu yapmaktadır. Böbreklerde değişik tiplerde kanser gelişebilir.Renal hücreli karsinom (RHK) böbrek tümörlerinin içinde en yaygın olanıdır. RHK tüm kanserlerin %2-3'lük kısmını oluşturmaktadır. En yüksek insidans, gelişmiş ülkelerde görülür. Tüm dünyada ve Avrupa'da hastalığın insidansında yıllık yaklaşık %2 oranında artış gözlenmektedir. RHK, böbrek içinde en sık gelişen kitlesel lezyondur. Bu çalışmada amaç, RHK hastalarında BNC1, SCUBE3, SFRP1, ve PCDH8 genlerinin promotör bölgelerindeki metilasyon durumunun tespit edilmesidir. Toplamda 24 hastanın parafine gömülü tümör dokusu ve komşu normal dokusundan izole edilen DNA örneklerinde bisülfit dönüşümü yapıldıktan sonra Metilasyon Spesifik PCR yöntemi uygulanmıştır. Sonuç olarak; BNC1, SCUBE3, SFRP1, ve PCDH8 aday tümör baskılayıcı genlerdeki promotör bölge metilasyonunun RHK patogenezinde etkili olabileceği düşünülebilir. Ancak bu sonuçların kesinleşmesi için farklı moleküler tekniklerle yapılacak çalışmalara gereksinim vardır.
PLGA-kurkumin nano-formülasyonunun kanser hücrelerinde NF-kB'nin p65 alt birimi düzeyi üzerindeki etkisinin incelenmesi
Kanser kemoterapi ajanlarının sağlıklı hücreler üzerindeki toksik etkilerine ek olarak bu ilaçların özellikle klinik kullanımdaki yüksek maliyeti göz önüne alındığında prooksidan polifenoller ile etkinliklerinin artırılması önem taşımaktadır. Geleneksel sitotoksik kemoterapi, birçok kanser türü için hâlâ tercih edilen bir tedavi yöntemi olarak devam etmesine rağmen son yıllarda kanser tedavisinde çarpıcı bir değişim meydana gelmiştir. Kanser hücreleri için daha seçici etki gösterecek ve böylece normal hücreler üzerinde istenmeyen yan etkileri önleyerek daha az yan etkiye neden olacak yeni ilaçların tasarlanmasında büyük çaba gösterilmiştir. Son yıllarda önemi giderek artan bir yaklaşım olan polimerik nanoparçacıkların ilaç taşıyıcılar olarak kullanılmasıyla daha az sistemik yan etki görülmekte ve tümör dokusunda daha yüksek ilaç konsantrasyonlarına ulaşılmakta ve tedavi etkinliği belirgin ölçüde artırılmaktadır. Polimerik materyaller arasında en sık kullanılan polilaktik-ko- glikolik asit (PLGA), fizyolojik ortamda inert, biyoparçalanabilir, biyouyumlu olması ve toksik olmayan ürünlere parçalanabilmesi nedeniyle yeni ilaç taşıyıcı sistemlerde yaygın olarak kullanılan ve Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA, Food and Drug Administration) tarafından da onaylamış bir biyomateryaldir. Birçok çalışmada prooksidan etkisine sahip polifenollerin başında gelen kurkuminin insanlardaki farmokinetiğin, güvenliğin ve etkinliği ortaya konulmuştur. Son zamanlarda kurkuminin antikanser aktivitesi gösterilmiş kanser tedavisindeki önleyici ve tedavi edici potansiyeli vurgulanmıştır. Ancak bu bileşiğin sudaki çözünürlüğü düşük olduğundan biyolojik aktivite testlerinde yüksek konsantrasyonda kullanımı sorunla karşılaşmaktadır. Nükleer Faktör Kappa B (NF-kB); enflamasyon, immün yanıt, proliferasyon ve apopitoziste sorumlu olan çok sayıda genin önemli bir regülatörü olan transkripsiyon faktörüdür. NF-kB, tüm hücrelerde sitoplazma içerisinde inaktif halde bulunur. NF-kB, Ranjan Sen ve David Baltimore tarafından 1986 yılında B lenfositlerin çekirdeklerinde immünglobulin kappa hafif zinciri geninde enhancer bölgesine bağlanan bir faktör olarak tanımlanmıştır. NF-kB protein kompleksi beş farklı alt proteinden (NF-kB1 (p50/p105), NF-kB2 (p52/p100), RelA (p65), RelB ve c-Rel) oluşmaktadır. NF-kB immün sistemin normal çalışması için gereklidir. NF-kB'nin tümör hücrelerinin gelişiminde etkili olduğu ve NF-kB inhibisyonunun gerçekleşmesi halinde tümör hücrelerini kemoterapiye duyarlı hale getirdiği belirtilmektedir. NF-kB'nin aktivasyonu hücre içi büyüme faktörleri, oksidatif stres, mitojenler, pro-inflamatuar sitokinler, virüsler, gram negatif bakteri ürünleri, çevresel stres koşulları 16 gibi pek çok farklı etken ile gerçekleşmektedir. NF-kB hücre sitoplazmasında inhibitör protein olan IkB ile kompleks halde bulunur. IkB kinaz kompleksi (IKK) tarafından IkB proteinin fosforillenmesiyle bu protein inaktive olur ve NF-kB'den ayrılır. Böylelikle serbest kalan NF-kB nükleusa geçer. DNA'ya bağlanarak spesifik genlerin aktivasyonuna yol açar. Kurkuminin anti-inflamatuar aktivitesi olduğu ve etkisini NF-kB aktivasyonunu baskılayarak sağladığı, ilk kez 1995 yılında Singh ve Aggarwal tarafından gösterilmiştir. Bu bulgunun yayımlanmasının ardından, diğer araştırmacılar tarafından yürütülen çalışmalar sonrasında NF-kB sinyal yolağındaki başka molekülleri de inhibe edebildiği gösterilmiştir. Kurkuminin NF-kB yolağının inhibisyonu aracılığı ile pankreatik, meme, kolorektal, oral, baş-boyun, glioblastoma, over, prostat ve T-hücreli lenfoma gibi birçok kanser hücresinde anti-kanser etkisi olduğu çok sayıda araştırıcı tarafından bildirilmiştir. Birçok çalışma ile kurkuminin, kanser gelişimini önlemesi ile kanser tedavisinde güvenilirliliği ve etkinliği kanıtlanmıştır. NF-kB yapısının ve mekanizmasını aydınlatılması, hücresel stresin azaltılmasında ve bununla birlikte yeni bakış açıları ile stresin negatif etkilerinin ortadan kaldırılmasında önemli rol oynayacağı düşünülmektedir. Yapılan literatür incelemelerinde PLGA-Kurkumin nano formülasyonun kanser hücrelerinde Nf-kB'nin p65 alt birimi düzeyi üzerindeki etkisinin incelendiği bir araştırmaya rastlanmamıştır. Bu noktadan yola çıkarak çalışmamızda, günümüzde antikanser aktivitesi gösterilmiş, kanser tedavisindeki önleyici ve tedavi edici potansiyeli vurgulanan kurkumin nano formülasyonun NF- kB sinyal mekanizması için de aydınlatıcı olabileceği düşüncesiyle PLGA-kurkumin nano formülasyonunun kanser hücrelerinde Nf-kB'nin p65 alt birimi düzeyi üzerindeki etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. PLGA-Kurkumin nano formülasyonunun, p65 alt biriminin üzerindeki etkisi paklitaksel uygulanan MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri üzerinde incelenmiştir. P65, PLGA-Kurkumin tarafından en çok baskılanan birim olmakla birlikte bu nano formülasyon ile birlikte kanser hücrelerindeki enflamasyonun engellenmesi nano formülasyonun güvenilirliğini arttırmaktadır. Anahtar Kelimeler: NF-kB, nano formülasyon, kurkumin, PLGA
Supramoleküler etkileşimlerle yıldız tipi amfifilik kopolimerlerin oluşturulması ve karakterizasyonu
Yıllar içerisinde ilacı belirli bir etki bölgesine daha güvenilir bir şekilde taşımak için farklı ilaç taşıyıcı sistemler tasarlanmış ve geliştirilmiştir. Son zamanlarda geleneksel olmayan yöntemlerle misellerin oluşturulması dikkat çekmektedir. Geleneksel polimerik misellerden farklı olarak bu miselleri oluşturan amfifilik blok kopolimerler kovalent olmayan etkileşimler ile oluşturulur. Bu etkileşimler arasında konak-konuk etkileşimi ile oluşturulan supramoleküler amfifiller, makrosiklik konak molekülleri supramoleküler sistemlere dahil ettiği için ayırt edici özellikler gösterir. Bu çalışmada, supramoleküler etkileşimler yoluyla siklodekstrinin (β-CD) inklüzyon kompleks oluşturma özelliğinden faydalanılarak supraamfifilik yıldız kopolimerler elde edilmiştir. Bu supraamfifilik yıldız kopolimer ile miseller oluşturulup misellerin ilaç taşıma etkinliği incelenmiştir. Dört kollu hidrofobik bloğu oluşturmak amacıyla ε-kaprolakton monomeri pentaeritriol başlatıcı varlığında halka açılması polimerizasyonu yöntemiyle sentezlenmiş ve klik reaksiyonu ile her kolun uç kısımlarına β-CD takılmıştır. Hidrofilik blok için mPEG zincirlerinin uç kısmına 1-adamantilamin (AD) takılmıştır. β-CD ve AD arasında oluşan konak-konuk kompleksinden yararlanılarak dört kollu supraamfifil yıldız kopolimerler oluşturulmuştur. Sentezlenen polimerler FT-IR, GPC, 1H NMR, 2D 1H NOESY ve DSC ile karakterize edilmiştir. Diyaliz yöntemi kullanılarak supramfifillerin kendiliğinden birleşmesi ile oluşturulmuş misellere doksorubisin (DOKS) yüklenmiştir. DOKS yüklü ve boş misellerin partikül boyutları DLS ile karakterize edilip taşıyıcı olarak potansiyelleri incelenmiştir.
Gene targeting studies of the malaria parasite dna photolyase gene using CRISPR-Cas9 genome editing technology
Ultraviolet (UV) light damages DNA by converting two adjacent thymine bases into pyrimidine dimers. In all organisms, except mammals, this damage is repaired by the photolyase enzyme [1, 2]. Prof. Dr. Aziz SANCAR has won the Nobel Prize for the characterization of the role of a homolog of the photolyase enzyme in higher eukaryotes in the control of the circadian rhythm. Surprisingly, no research has been conducted on the photolyase gene of the malaria parasite or of any other parasitic protozoa. Recently, it was confirmed that a genetically- regulated circadian rhythm tightly controls the development and growth of malaria parasites according to external light stimuli [3]. However, the genetic factors that control this system have not yet been discovered. In order to investigate the role of the malaria parasite DNA photolyase enzyme in the mechanism of the circadian rhythm regulation of the malaria parasite, in addition to its putative function as a DNA repair enzyme, we utilized a novel CRISPR-Cas9 system with enhanced-specificity Cas9 function, to limit the genome off-target endonuclease activity, to investigate the function of DNA Photolyase by targeted gene knock-out deletion and knock-in tagging. The DNA photolyase knock-out parasites failed to grow normally compared to wild-type (WT) parasites, with even more severe growth attenuation when perturbations of ambient light conditions were applied. Thus, we are initially confirming the role of malaria parasite DNA photolyase in the regulation of the responses to the light/ dark cycle, and an additional function in DNA repair due to UV light exposure. Therefore a more in-depth investigation is needed to detail the molecular function of the DNA photolyase in the malaria parasite and in other pathogenic microorganisms.
hFRα hedef proteinine karşı peptit-bazlı PET-ligandların rasyonel tasarımı
Günümüzde pek çok hastalığın hızlı ve doğru teşhisi uygun tedavi yöntemlerinin seçilmesi ve değerli zamanın kaybedilmesi açısından büyük önem taşımaktadır. Pek çok kanser tipi için gerek bilimsel literatür gerekse biyoinformatik veri tabanlarından yararlanılarak hedefe uygun biyobelirteçlerin saptanması mümkündür. Bu bağlam da kanser hücrelerinde yer alan İnsan Folik Asit Reseptör α (hFRα) proteini yüksek miktarda eksprese olduğu anlaşılmıştır. Bu nedenle hFRα kanser görüntülenmesinde hedef biyobelirteç proteini olarak görev yapabileceği kabul edilmektedir. Sağlık sektöründe onkolojik görüntüleme yöntemlerinden faydalanılarak kanser hastalığı tanısı için kullanılan yöntemlerin arasında büyük önem arz eden Pozitron Emisyon Tomografisi-Bilgisayarlı Tomografi (PET-BT), organ ve dokuların metabolik ve fonksiyonel durumlarını anatomik bilgiler çerçevesinde görüntüleyerek vücudumuzda saklı olan tümörlü dokular hakkında detaylı bir şekilde bilgiler sunabilmektedir. İdeal bir görüntüleme yöntemi olarak seçilen yöntemin avantajları olduğu gibi dezavantajlarınıda göz ardı etmememiz gerekmektedir. Bu teknolojinin kullanımında karşımıza çıkan en önemli dezavantaj patolojik alanları özgül ve hassas olarak işaretleyebilecek ajanların azlığı sebebi ile ciddi sınırlamalar getirmektedir. Sonuç olarak kanser hastalığın tespiti ve tedavi evreleri arasındaki farkları takip etmemizi zorlaştırmaktadır. Bu tez çalışmasında özellikle tümör mikroçevresinde yer alan immün ve stromal hücrelere ait özgül biyobelirteçlere yüksek seçicilik ve ilgi ile bağlanabilecek PET ajanlarına alternatif olarak yeni peptit-bazlı PET-Ligandların geliştirilmesi planlanmıştır. Bu sayede, kanser odaklarının görüntülenmesinde alternatif teşkil eden yenilikçi ve rasyonel tasarıma sahip yeni nesil radyo-işaretli tümör-tanıyıcı ajanların ilk örnek üretimi gerçekleştirilecektir. Ön çalışmalarımızda moleküler modelleme tekniklerinden yararlanılarak hFRα'ya bağlanması öngörülen 16 adet peptit-yapılı PET-Ligandlar tasarlanmıştır ve sentez için önerilmiştir. Tez çalışmaları esnasında sentezlenen 16 adet peptitin kapsamlı moleküler dinamik çalışmalarıyla hFRα hedef proteinine karşı olası bağlanma afinitesi ve dinamik bağlanma ilişkileri incelenmiştir. Bu bilgiler doğrultusunda hFRα'ya bağlanması öngörülen 12 adet yeni peptit tasarlanmıştır ve sentez için önerilmiştir.
Meme kanseri tedavisi için yeni bir polimerik ikili ilaç taşıma sisteminin geliştirilmesi
Kanser tedavisinde kullanılan konvansiyel yöntemlerinin sistemik etkiye sahip olması bundan dolayı kanserli hücrelerin yanı sıra sağlıklı hücrelerin de olumsuz olarak etkilenmesi ilaç taşıyıcı sistemler üzerine yapılan çalışmaların giderek artmasını sağlamıştır. Kemoterapötik ajanların düşük çözünürlükleri, yüksek toksisiteleri, düşük stabiliteye sahip olmaları tedavinin etkinliğini sınırlamaktadır. Polimerik ilaç taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi antikanser ilacı tümör bölgesine hedeflemeyi sağlamakta ve yan etkileri azaltmaktadır. İkili ilaç taşıyıcı sistemlerin kanser tedavisinde kullanılarak sinerjestik etkiye sahip antikanser ajanların bir arada verilmesiyle tedavinin etkinliğini arttırılmaktadır. Akciğer kanserinden sonra en sık görülen ikinci kanser çeşidi olan meme kanserinde cerrahi tedavi, radyoterapi, hormone terapi ve kemoterapi tedavi yöntemi olarak kullanılmaktadır. Kemoterapötik ajan olarak kanser tedavisinde kullanılan alkilleyici bir ajan olan Gemsitabin ve platin türevi bir antikanser ilaç olan Cisplatin'in bir arada kullanılması meme kanseri üzerindeki sitotoksik etkiyi arttırdığı bilinmektedir. Bu çalışmayla birlikte Gemsitabin ve Cisplatin yüklü nanopartiküllerin sentezi gerçekleştirilmiş ve nanopartiküllerin MDA-MB-231 meme kanseri ve CCD-1079Sk sağlıklı fibroblast hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkileri incelenmiştir. Literatüre bakıldığında Cisplatin ve Gemsitabin antikanser ilaçların bir arada kullanılarak meme kanserini hedef alan ilaç taşıyıcı sistemin geliştirilmesi üzerine yapılan çalışmalar sınırlıdır. Araştırma düşük doz kullanımıyla yan etkilerin azaltılması ve meme kanseri hedefli bir polimerik ikili ilaç taşıyıcı sistem geliştirilmesini amaçladığından kadınlarda en sık görülen kanser tipi olan meme kanserinin tedavisindeki etkinliğin arttırılması açısından önem taşımaktadır. Yeni bir polimerik ikili ilaç taşıma sisteminin literatüre kazandırılması çalışmayı ayrıca önemli kılmaktadır.
Ex vivo gen terapisiyle hipoparatiroidizm tedavisi modeli oluşturma
Hipoparatiroidi (hipo-PT), vücuttaki parathormon (PTH) eksikliği sebebiyle başlıca kalsiyum seviyesindeki düşüş ve fosfat seviyesindeki artışın eşlik ettiği, yaşamın devamı için mutlaka tedavi edilmesi gereken bir hastalıktır. Kronik hipo-PT'nin konvansiyonel tedavisinde yüksek dozlarda oral Ca ve D vitamini takviyelerinin ömür boyu kullanımı zorunludur. Söz konusu tedavi küratif olmayıp semptomatik olmakla beraber, uzun vadede kullanımında hastada çok ciddi yan etkiler görülebilmektedir. Bu sebeple hipo-PT için yeni ve alternatif terapi yaklaşımlarının geliştirilmesinin gerekliliği açıkça görülmektedir. Gen terapisi, özellikle küratif tedavisi bulunmayan hastalıklar için kullanılabilecek olan, son yıllarda yenilenen vektör tasarımlarıyla birlikte hem güvenilirliğinin hem de etkinliğinin arttırılmış olduğu bir terapi metodudur. Bu sebeple çalışmamızda, sıçanlar üzerinde ex vivo gen terapisi metoduyla hipoparatiroidi tedavisi modeli oluşturabilmenin mümkün olabileceğinin gösterilebilmesi amaçlanmıştır. Çalışmamız hipo-PT tedaviside hem "otolog primer hücrelerin kullanıldığı ilk ex vivo gen terapisi" çalışması olup, hem de söz konusu hastalığın tedavisinde vektör olarak "lentiviral vektörler"in kullanılmış olduğu ilk çalışmadır. Daha önce sıçanlar üzerinde hipo-PT için gen terapisi çalışmaları gerçekleştirilmiş olsa bile, söz konusu çalışmalarda in vivo yöntem kullanıldığından, terapötik genin vücutta dağılabileceği hücreleri/dokuları tahmin edebilmek mümkün değildir. Oysa ex vivo gen terapisi çok daha güvenli ve kontrollü bir uygulama sağlayabilmektedir. Çalışmamızda ayrıca otolog hücrelerin kullanımı sayesinde immun reddin de önüne geçilebilmesi amaçlanmıştır. Tezimizde her bir deney hayvanından alınan deri parçasından, hayvanın kendine ait otolog primer hücreler kültüre edilerek çoğaltılmış ve insan parathormon geni (hPTH) taşıyan lentiviral vektörler üretilerek, söz konusu otolog hücreler lentiviral vektörlerle transdükte edilmiştir. Transdüksiyon sonrası hücrelerin hPTH genini genomlarına entegre ederek yüksek miktarda biyolojik aktif hPTH üretimi ve salgılaması yaptığı floresan mikroskop görüntüleri ve biyokimyasal testler sayesinde doğrulanmıştır. Söz konusu hücreler sıçan vücuduna subkutan olarak enjekte edildikten sonra ise tüm deney hayvanlarında hPTH üretimi doğrulanarak, sıçanlarda ex vivo gen terapisi ile hipo-PT tedavisinin mümkün olabileceği gösterilmiştir. Ancak terapi sonrası sıçan serumundan ölçülen hPTH değerlerinin, sıçanlardaki fizyolojik PTH referans değer aralığının altında kaldığı görülmektedir. Bunun sebebinin terapötik hücrelerin enjeksiyon sonrasında sadece çok az bir kısmının vücuda engrafte olabilmesi, büyük bir kısmının ise engrafte olamadığı için vücuttan uzaklaştırılması ve bu yüzden hormon seviyelerinin fizyolojik referans değer aralığının altında kalması olduğu düşünülmektedir.
PTCH1 geninde meydana gelen epigenetik değişimlerin mide kanserli olgularda incelenmesi
Gastrik kanser (GC) dünyada teşhisi konulan dördüncü en sık kanser olmakla beraber, mortalitesi yüksek ve prognozu kötü bir malignitedir. Yapılan moleküler çalışmalarda, hedhehog sinyal yolağının bir proteini olan PTCH1 reseptör regülasyonunun bozulmasının mide kanserine sebep olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu çalışmada cerrahi gastrektomi uygulanmış mide kanserli olgulardan rezekte edilen tümör dokularında, PTCH1 geninin epigenetik değişimi ve buna bağlı olarak ortaya çıkan ekspresyonel farklılıkların incelenmesi amaçlanmıştır.Çalışmaya, gastrik kanser tanılı, 50-70 yaş aralığında, 13 erkek ve 9 kadın hastadan cerrahi gastrektomi ile rezekte edilmiş tümör dokusu ve tümörden uzak bir bölgeden alınmış kontrol dokusu dahil edildi. Elde edilen dokulardan ticari izolasyon kiti yardımıyla DNA izole edildi. İzole edilen DNA'ların konsantrasyonları belirlendikten sonra uygun koşullarda bisülfit dönüşümü yapıldı ve EpiTect Metil 2 PCR Sistemi yardımıyla metile ve metile olmayan primerler kullanılarak kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile PTCH1 genindeki metilasyon profilindeki değişimler belirlendi. Protein düzeyindeki değişimler için homojenize doku örneklerinden ELISA yardımıyla PTCH1 protein ekspresyonları ölçüldü. RT-PCR sonucunda metile primerlerin kullanıldığı düzenekte çoğunlukla tümör dokusundan elde edilen örneklerin erime sıcaklığı ile tümör uzak dokulardan elde edilen örneklerin erime sıcaklığı arasında yaklaşık 0.5 ± 0.25 derece değişimin olduğu ve bu nedenle tümörlü dokuların metilasyon profillerinin sağlıklı dokuya oranla değiştiği tespit edildi. Protein ekspresyonu sonuçları değerlendirildiğinde PTCH1 protein miktarının kanserli dokularda anlamlı derecede arttığı tespit edildi (p<0,05). Elde edilen sonuçlar gastrik kanser oluşumunda etkisinin olabileceği düşünülen ve PTCH1 genindeki metilasyon profilinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim görülmediğinden PTCH1 proteinindeki değişimin direk epigenetik değişimler ile ilişkili olmadığını düşündürmektedir. Bu nedenle, bu sonuçlar çevresel etkiler sonucu oluşan epigenetik değişimlerin gastrik kanser oluşumunda etkisinin sınırlı olduğuna işaret etmektedir.
Likit biyopside glioblastoma multiforme genetik biyobelirteçlerinin araştırılması
Glioblastoma multiforme hastalarının likit biyopsi örneklerinde genetik biyobelirteçlerin yakalanması ve keşfi
Development of whole blood stage vaccine for malaria treatment via CRISPR-gene editing technology
Malaria remains a major global health problem among mainly in pregnant women and children, which resulted in death of hundreds of thousands of humans. One of the greatest challenges for malaria treatment is drug resistance against antimalarial drugs. Therefore, eradication of malaria can only be achieved with the application of very potent and safe vaccines. However, there is no malaria vaccine currently available, and the most advanced subunit vaccine candidate has recently reported efficacy between 0-30% against clinical malaria cases. On the other hand, live attenuated whole parasites used in experimental vaccination trails induced complete sterile protection. However, the inefficiency of gene editing technologies has limited their use in generating live attenuated vaccines. Four members (NT1, NT2, NT3, and NT4) of the nucleoside transporter gene family play an important role in the purine transfer from the host to human malaria parasites. In this thesis, we developed nucleoside transporter 1 deficient Plasmodium yoelii and Plasmodium berghei via CRISPR-Cas9 gene editing methods. The CRISPR/Cas9 system is an emerging genome-editing technology that is used to edit the gene for various living organisms. CRISPR/Cas9 system sheds light on Plasmodium (P. yoelii, P. falciparum, etc.) to modify the targeted genes based on homologous recombination. We also generated a mixed live attenuated blood-stage malaria vaccine model using that NT1 deficient plasmodium strains. Equally mixed Pbnt1(-) and Pynt1(-) parasites in single subcutaneous fresh or frozen doses were injected in a group of mice and conferred sterile protection against intravenous infectious blood-stage challenge with wild-type parasites of P. berghei ANKA and P. yoelii 17X-NL strains. This data may indicate that a single subcutaneous sub-patent dose of two species of genetically-growth-attenuated parasites, can protect humans against two Plasmodium spp. infections. NT1 knockout parasites could be developed in cultures provided with supra-physiological concentrations of purine and shipped to endemic areas in frozen-stock doses stored in liquid nitrogen. In this thesis, we also evaluated the role of the nucleoside transporter 4 gene (NT4) in the Plasmodium life cycle as a potential malaria vaccine target. Herein, NT4 deficient P. berghei parasites were generated, and in the erythrocytic stage, significant differences have not been observed. However, oocyst egress and sporozoite invasion of salivary glands are restricted in the mosquito stage. Moreover, the Pbnt4(-) salivary glands and hemolymph sporozoites did not develop infectivity. As a result of these results, the NT4 gene could be a promising target for the next malaria transmission-blocking studies.
İnsan solunum sinsityal virüsünün protein dizisi çeşitliliği dinamiklerinin incelenmesi
İnsan solunum sinsityal virüsü (hRSV), dünya çapında en bulaşıcı virüslerden biridir ve bronşiolit ve pnömoni gibi alt solunum yolu enfeksiyonlarına yol açabilir. Lisanslı profilaktik hRSV aşısı bulunmamaktadır. hRSV'nin büyük ölçekli proteom çapında dizi çeşitliliği analizinde kullanılacak ve epitop bazlı hRSV aşı tasarımı için potansiyel aşı hedeflerinin tanımlanmasına yol açacak çok sayıda hRSV dizisi halka açık veri tabanlarında mevcuttur. Bu çalışma, virüsün mevcut tüm protein dizilerine odaklanmıştır. Dizi verileri, halka açık NCBI Virüs ve Virüs Patojen Veritabanı ve Analiz Kaynağı (VIPR) veritabanlarından toplanmıştır. Protein dizisi verileri havuz oluşturularak birleştirilmiş ve benzer diziler CD-HIT kullanılarak çıkarılmıştır. Bireysel protein veri kümeleri oluşturmak için 11 hRSV proteininin UniProt referans kayıtları kullanılarak toplanan diziler üzerinde BLASTp analizi yapılmıştır. Her protein veri seti, MUSCLE programı kullanılarak hizalanmıştır. Dizi çeşitliliği, proteinin uzunluğu boyunca örtüşen her 9-mer (nonamer) (1-9, 2-10, vb.) pozisyonu için Shannon entropisi kullanılarak ölçülmuştür. Bundan sonra, T-hücre epitopları, IEDB veritabanı kullanılarak deneysel olarak ispatlanan epitoplar ile eşleştirilmiş ve IEDB'nin önerdiği yardımcı araçlar kullanılarak epitop tahmini yapılmıştır. Tahmin sonuçlarımızı desteklemek için, seçilen epitopların MHC I ve II'ye karşı moleküler docking analizleri ve moleküler dinamik simülasyonları yapılmıştır. VIPR ve NCBI Virus veritabanlarından toplanan toplam dizi sayısı 93.382'dir. Benzer dizilerin çıkartılmasından sonra, sayı 12.413'e düşmüştür (~%87'lik bir azalma). hRSV için gözlemlenen maksimum entropi değeri, M2-2 proteininde 43'üncü nonamer pozisyonunda ~4.2 olarak bulunmuştur. Bununla birlikte, proteom çapında ortalama entropi genel olarak düşüktür (~0.8) ve bu nedenle yüksek korunmuşluk göstermektedir ve bu değerler ~0.5 ( protein N) ile ~2.3 (protein M2-2) arasındadır. Varyantların çoğu (~%55) 0 ile 1 entropi aralığı arasındadır. Nonamer pozisyonlarının yaklaşık yarısı (~%51) yüksek oranda korunmuş olarak sınıflandırılmıştır (indeks insidansı ≥ %90). Epitop tahmini için 2269 yüksek oranda korunmuş nonamer dizisi seçilmiştir. 2269 nonamer dizisinden, sırasıyla MHC Sınıf I ve II için 997 ve 235 epitop tahmin edilmiştir. Bu çalışma, hRSV proteomundaki dizi çeşitliliği ve bunların potansiyel aşı hedefleri hakkında bilgi sağlamaktadır. Proteomun ve tahmin edilen epitoplarının yüksek düzeyde korunması, profilaktik hRSV aşı tasarımı için daha fazla araştırmanın gerekliliğini ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Viral dizi analizi, immünoinformatik, aşı hedef keşfi
Paklitaksel yüklü polimerik misellerin sentezi ve kombinasyonel terapi etkinliğinin belirlenmesi
Kanser, vücudun hemen hemen her yerinde başlayabilen, hücrelerin kontrolsüz bir şekilde büyüdüğü ve sonrasında vücudun diğer bölgelerine yayıldığı bir hastalık olup insan hayatını tehdit etmektedir. Kanserin mevcut temel tedavisi kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi müdahaleyi içerir; bunlar arasında kemoterapi basit ve uygun süreci nedeniyle klinikte yaygın olarak uygulanmaktadır. Kemoterapi, radyoterapi ve cerrahinin koordineli olarak uygulandığı geleneksel tedavi yöntemlerinin toksisite, vücutta spesifik olmayan bölgelere dağılma, zayıf oral biyoyararlanım ve ilaç dozunun ayarlanamaması gibi dezavantajları bulunması sebebiyle daha etkin, kişiye ve hastalığın türüne özel teşhis/tedavi sistemleri geliştirilmeye çalışılmaktadır. Yeni nesil kombine tedavi yöntemleri arasında bulunan fotodinamik terapi (FDT), fototermal terapi (PTT), manyetik hipertermi gibi tedaviler umut vadeden yöntemler arasındadır. Bu yöntemlerin kombinasyonel terapide kullanılması, ilaç taşıyıcı sistemlerin etkinliğini artırmak ve antikanser ilacı tümör bölgesine hedeflemek açısından potansiyel bir tedavi yöntemi olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu çalışmada hidrofobik kemoterapi ilacı paklitakselin (PTX), foto duyarlılaştırıcı ajan protoporfirin IX (PpIX) ile kombinasyonel tedavide kullanılması amaçlanmıştır. Öncelikle RAFT polimerizasyon yöntemi ile diblok kopolimeri hazırlanmış protoporfirin IX ve şeker bileşenleri ile azit-alkin halka katılma click reaksiyonu ile glikopolimerler sentezlenmiştir. Nanoçöktürme yöntemi ile paklitaksel glikopolimerlere enkapsüle edilerek misel formülasyonları hazırlanmıştır. Daha sonra, sadece FDT özellikli ilaç içermeyen glikopolimer bazlı miseller (GM) ve kemo-FDT özellikli paklitaksel içeren glikopolimerik misellerin (GM-PTX), A549 akciğer kanseri hücre hattı ve CCD-1079Sk sağlıklı fibroblast hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkileri incelenmiştir. Kırmızı ışığı absorplayan/ışıma yapan PpIX taşıyan, biyouyumlu, biyobozunur ve NIR'la tetiklenen singlet oksijen duyarlı ilaç salımı yapan glikopolimerik misel bazlı taşıyıcı platformların sentezi ve elde edilen misel yapılarının akciğer kanser hücrelerini hedeflemesi ile literatüre yeni bir FDT-Kemo kombinasyonel terapi kazandırması açısından önem taşımaktadır.
Glioblastoma hücrelerinde integrin α10'un PLGA nano partiküllerine yüklenmiş siRNA ile baskılanması
Kanser, dünyada ölüm nedenlerinin başında gelen bir hastalıktır ve birçok çeşitleri bulunmaktadır. En tehlikeli kanser sınıfına dahil olabilecek bir kanser türü de glioblastoma kanseridir ve beyin çevresine yayılabilen en yaygın ve ölümcül bir tümördür. Histolojik olarak nekroz ve endotel proliferasyon ile tanımlanan glioblastoma, yetişkin bireylerde görülen en yaygın ve agresif birincil beyin tümörüdür. Tanı ve tedavisinde birçok zorluk yaşanmaktadır. Bu olumsuzlukları en aza indirgemek amacıyla nano taşıyıcı sistemler ile ilacın kontrollü ve hedefli iletimi mümkün hale getirilmeye başlanmıştır. Ayrıca, kanser hücrelerinde fazla eksprese olan genlerin ve ürünlerinin bilinmesiyle bu genlerin terapötik hedef olduğu çalışmalar artmıştır ve bu doğrultuda tümör bölgelerinde fazla eksprese olan genlerin susturulmasına yönelik çalışmalar günümüzde odak noktası olmuştur. Ribonükleik asit (RNA)'yı seçici bir şekilde hedefleyebilen antisens oligonükleotidler ile antisens teknolojisi bu alanda önemli ajanlar sunmaktadır. Bu terapötik ajanlardan biri olan küçük enterferans yapan (si-RNA)'lar ile hedeflenmiş mesajcı RNA (mRNA)'nın parçalanması mümkün hale gelmiştir. Böylece kanser hücresinin gelişimine sebep olan protein susturularak kanser tedavisi gerçekleştirilebilir. İntegrinler, α ve β zincirinden oluşan heterodimerik hücre yüzeyi reseptörleridir ve hücre dışı matrisi hücre iskeletine bağlarlar. Ayrıca tümör hücreleri üzerindeki hücre dışı matris ve integrin reseptörleri arasındaki etkileşimlerin, hücre göçü ve proliferasyonu gibi tümör hücresi süreçlerinde önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir. Özellikle, integrin α10 proteinini ifade eden ITGA10 geninin yüksek ifadesi, glioma hastalarında daha kötü bir genel hayatta kalma olasılığı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Biz de çalışmamızda, biyouyumlu, biyobozunur ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından insanlar üzerinde kullanımına onay alınmış bir polimer olduğu için Poli (D,L-laktid-ko-glikolid) (PLGA) nanopartikülleri ile glioblastoma hücrelerine terapötik madde olan integrin α10'u hedefleyen siRNA'nın taşınabilmesini ve sonuçta kanser hücresindeki değişimi incelemeyi amaçladık.Böylece, PLGA nanopartikülleri ile siRNA taşınmasının etkinliği, PLGA nanopartikül aracılı siRNA'nın glioblastoma hücrelerindeki integrin α10'u baskılama etkinliği ve integrin α10'un baskılanması ile kanser hücrelerindeki değişikliğin incelenerek PLGA nanopartikülleri ile taşınan siRNA'nın glioblastoma hücrelerindeki integrin α10'u hedeflenmesiyle glioblastoma kanseri için olası bir terapötik yaklaşım öne sürülebilecektir. Anahtar Kelimeler: gen tedavisi, PLGA, nano taşıyıcı, si-RNA, integrin, glioblastoma kanseri
Alzheimer modeli sıçanlarda kaempferol tedavisinin nöroprotektif ve iyileştirici etkisinin araştırılması
Alzheimer hastalığı dünya genelinde en sık görülen demans çeşididir. Her yıl prevalansı artmaya devam eden bu nörodejeneratif hastalığın bilinen bir tedavisi bulunmamaktadır. Alzheimer hastalığının patolojisini oluşturan ana etmenler senil plaklar, nörofibriler yumaklar ve nöroinflamasyon olarak sıralanabilir. Oksidatif stres bu patolojilerin oluşum ve ilerleme sürecinde yer alan en önemli temel etkenlerden birisidir. Birçok tedavi girişimi hastalığın nöropatojenezini hafifletip kognitif fonksiyonu arttırmayı hedeflemektedir. Bu amaçla birçok bitkisel ürün ve bunların etken maddeleri araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır. Kaempferol birçok bitkide sekonder metabolit olarak üretilen anti-inflammatuvar ve antioksidant özelliklere sahip bir flavonoiddir. Kaempferolün oksidatif stresi azaltma yeteneği bu molekülü Alzheimer hastalığı çalışmalarında önemli bir hale getirmektedir. Bu tez çalışmasında öncelikle Alzheimer hastalığını modellemek için Long-Evans cinsi erkek sıçanlara intraserebroventriküler olarak streptozotosin (STZ) enjekte edildi. Oluşturulan bu modele tedavi edici madde olarak bir antinöroenflamatuvar ajan olan kaempferol molekülü intraperitoneal olarak verildi. Tedavi bitiminde davranış deneyleri ve moleküler deneyler yapılarak kaempferolün nöroprotektif etkisini incelendi. Kaempferol morris su labirentinde yapılan öğrenme ve bellek testinde anlamlı bir farklılık göstermezken korkuya bağlı hafızayı ölçen pasif sakınma testinde gruplar arasında anlamlı bir farklılık oluşturmuştur. Bununla birlikte STZ enjeksiyonu PSEN seviyesinde anlamlı bir değişim göstermezken BACE ve fosforile TAU seviyesinde artışa sebep olmuştur. İlginç bir şekilde Kaempherolün moleküler düzeyde anlamlı bir iyileştirici etkisi olmamıştır. Bu sonuçlar kaempferol tedavisinin Alzeimer hastalığının fenotipik özeliklerinden olan hafıza kaybı üzerinde olumlu etkilerinin olduğunu göstermektedir. Bu nedenle bu çalışma kaempherolün Alzheimer hastalığı tedavisinde aday molekül olabilmesi için iyileştirici etkisinin moleküler temellerinin detaylı olarak incelenmesi açısından ilerleyen çalışmalara yol göstericidir. Anahtar Kelimeler: Alzheimer Hastalığı, kaempferol, STZ, BACE1, p-TAU, PSEN
Tiroid fonksiyon bozukluğu olan hastalarda eser element düzeylerinin ve malat dehidrojenaz, izositrat dehidrojenaz, glutamat dehidrojenaz enzim aktivitelerinin araştırılması
Tiroit bir iç salgı bezidir. Hormonlar vücuttaki birçok işlevi salgılar ve düzenler. Bu nedenle hormonların eksikliği veya artması hastanın yaşamında çok ciddi komplike şikayetlere neden olabilir.Tiroit bezi fonksiyonları, genel vücut sağlığı açısından da çok önemlidir. Yapılan araştırmalara göre tiroid hormon seviyesindeki bir dengesizliğin diğer organ ve sistemlerin işleyişini olumsuz etkilediği gözlemlenmiştir. Ayrıca kilo verememe, halsizlik, aşırı kilo verme veya kısa sürede aşırı kilo alma gibi şikayetlerle ortaya çıkan tiroid hormonundaki düzensizliklerin kişinin yaşam kalitesini olumsuz etkilediği bilinmektedir. Başka bir çalışmada dünyada yaklaşık 200 milyon kişinin tiroit hastalığı olduğu ve ülkemizde tiroit hastalıklarının her 10 kişiden 3'ünü etkilediği bilinmektedir. Ayrıca tiroit hastalıklarının kadınlarda daha sık görüldüğü gözlemlenmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda Türkiye'de endemik guatr prevalansının %10-30 arasında olduğu Tiroid Hastalıkları Tanı ve Tedavi Rehberi'nin 2019 raporunda bildirilmiştir. Sonuç olarak toplumda tiroit hormonu fonksiyon bozuklukları %5 sıklıkta görülmekte ve sıklığın yaşla birlikte arttığı bilimsel verilerle desteklenmektedir . Hipotiroidizm tedavi edilmezse daha ciddi komplikasyonlara ve hatta hasta için hayati tehlike oluşturan durumlara neden olabilir. Hipotiroidizmin komplikasyonları, düşük metabolizma, kalp hızı, kalp yetmezliği, yaşamı tehdit eden depresyon ve koma gibi hayati risklere neden olarak hastaların komaya girmesine neden olabilir . Tiroid hormonları vücutta bazal metabolizmanın sağlanmasında başlıca rolü oynarlar. Krebs (TCA) siklüsü de vücutta enerji metabolizmasının merkezinde yer almaktadır. Bu açıdan TCA döngüsündeki enzimlerin düşüklüğünün veya yüksekliğinin tiroid fonksiyon bozukluklarıyla ilişkili olabiliceği düşünülmektedir. Ayrıca çinko, bakır gibi eser elementler TCA enzimlerinin ve tiroid hormonlarının çalışmasında kofaktör olarak yer almaktadır. Biz çalışmamızda hipo ve hipertiroidili hasta gruplarında çinko ve bakır düzeylerini ve TCA'nın hız ksıtlayıcı enzimlerinden olan Malat dehidrojenaz, İzositrat dehidrojenaz ve Glutamat dehidrojenaz enzim aktivitelerini ötiroid kontrol grubuyla karşılaştırarak tiroid hastalıklarının tanısında bu parametrelerin yararlı olup olmayacaklarını araştırmayı amaçladık. Anahtar kelimeler: Tiroid Fonksiyon Bozukluğu, bakır, çinko, Malat Dehidrojenaz (MDH), İzositrat Dehidrojenaz (IDH), Glutamat Dehidrojenaz (GLDH),Graves Hastalığı, Haşimato Hastalığı
Polimerizasyonla indüklenmiş kendiliğinden birleşme (PISA) yöntemi ile tümör hedefli polimerik misellerin hazırlanması ve karakterizasyonu
Polimerik ilaç taşıyıcı sistemler ilaçların geleneksel kullanımına alternatif olarak dikkat çekmektedir. Özellikle polimerik miseller küçük partikül büyüklüğü, yapısal stabilite, yüksek ilaç yükleme kapasitesi, suda çözünürlük, düşük toksisite gibi özelliklere sahip olduğu için yaygın olarak çalışılmaktadır. Stabilite ya da işlevselleştirme için elverişli olan miseller hedefleme özelliğine sahip ilaç taşyıcı sistemler için idealdir. Miseller hidrofilik ve hidrofobik monomerlerle sentezlenen amfifilik blok kopolimerlerin kendiliğinden birleşmesi sonucu elde edilir. Kopolimer, bloklardan biri için seçici çözücü içerisinde agregat oluşturur. Bu oluşum kendiliğinden birleşmeyi meydana getirir. Polimerlerin alışılmış yöntemlerle kendiliğinden birleşmesi, oluşacak polimerik morfolojileri genellikle sınırlayan seyreltik çözelti (<%1) içinde gerçekleştirilir. Etkili bir yöntem olarak polimerizasyonla indüklenmiş kendiliğinden birleşme (PISA) ise bu sınırlamayı ortadan kaldırır. PISA metodunda başlatıcı polimer için seçici bir çözücü içerisinde dağılan ya da çözünen monomerden çözünmeyen bloğun polimerize edilmesine dayanır. Zincir uzaması başlayan çözünmeyen bloğun polimerizasyon derecesi kendiliğinden birleşme sürecini kontrol eder. Kendiliğinden birleşme ve yeniden düzenlenmeler ile küreler, çubuklar, veziküller, lamel yapılar gibi çok çeşitli morfolojide polimerik yapılar oluşum sürecine gözlenir. Bu çalışmada tersinir katılma-ayrışma zincir transfer (RAFT) polimerizasyonu ile hidroksietil metakrilat (HEMA) ve glisidil metakrilat (GMA) monomerleri kullanılarak hidrofilik bloğu oluşturacak random kopolimerler sentezlenmiştir. HEMA ve fonksiyonlandırılabilir GMA üniteleri farkı oranlarda polimerize edilmiştir. İlk olarak fonksiyonlandırma için polimerler GMA ünitelerinden azitlenmiştir. Ardından propargil ile fonksiyonlandırılan folik asit (FA) azitlenen ünitelere "click" reaksiyonuyla takılmıştır. Elde edilen azit fonksiyonlu makro başlatıcılar (M-CTA) ile hidrofobik bloğu oluşturacak metil metakrilat monomerinin polimerizasyonu RAFT-PISA yöntemi ile sağlanmıştır. Farklı değişkenlere sahip PISA reksiyonları denenmiştir. En stabil sonuç veren parametreler ile aynı yöntem uygulanarak doksorubisin (doks) yüklü miseller hazırlanmıştır. Çalışmada elde edilen polimerler FT-IR, 1H NMR, UV-Vis ve DSC ile karakterize edilmiştir. PISA ile elde edilen misellerin ortalama partikül boyutları DLS ile ölçülmüştür. Sonuçlar karşılaştırılarak değişkenlerin misel boyutları üzerindeki etkisi incelenmiştir.
Affinite ajanlarının aspergillus oryzae'de üretim platformunun oluşturulması
Biyoteknolojik uygulama alanlarında afinite ajanı olarak kullanılan monoklonal antikorlar(mAbs)'ın yüksek verimde heterolog olarak ifadelenmeleri; fonksiyonellik için üç boyutlu katlanma ve çözünürlük özelliklerinde karşılaşılan problemler ve/veya maliyetli üretim yöntemlerine ihtiyaç duyulması nedeniyle sınırlanmaktadır. Tek domainli ağır zincir antikorlar(VHH) ise, mAbs'e kıyasla önemli üstünlüklere sahip ve yalnızca tek bir ağır zincirden oluşması sebebiyle daha küçük boyuttaki, eşsiz antikor parçalarıdır. VHH'ler küçük boyutu, düşük immünojenikliği ve yüksek çözünürlüğü ile dikkat çekici afinite ajanları olarak, tanı, tedavi ve görüntüleme teknikleri dahil olmak üzere pek çok biyoteknolojik uygulamada mAbs'nin yerlerini almaya başlamıştır. Aspergillus oryzae (A. oryzae), uzun yıllardır fermentasyon teknolojisinde ve biyoteknolojik ürünlerin endüstriyel ölçekte üretiminde tercih edilen ve Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından Genel Olarak Güvenli (GRAS) statüsü verilmiş olan ipliksi fungidir. Taksonomik olarak kendisine en yakın Aspergillus türleri ile kıyaslandığında, A. oryzae genomunda özellikle hidrolitik enzimleri kodlayan genler bakımından daha fazla gene sahiptir. Bu güçlü salgılama mekanizması A. oryzae'i afinite ajanlarının büyük ölçekte ve güvenilir olarak üretimi için ideal bir platform haline getirmektedir. Bu tez çalışmasında, pyrG geni bakımından oksotrof haline getirilen A. oryzae'nin konak mikroorganizma olarak kullanıldığı biyoteknolojik bir platformun inşa edilmesi ve inşa edilen bu ifadelenme platformunun afinite ajanlarının üretiminde kullanılabileceğinin kanıtlanması amaçlanmıştır. Bu amaçla afinite ajanı olarak seçilen ribonükleik asit A (RNaz A)'ya karşı spesifik olan anti-RNaz A VHH proteininin, küçük ölçekte ve fermentör düzeyinde üretilerek saflaştırılmasının gerçekleştirilmesi istenmiştir. A. oryzae'de, fonksiyonel ve yüksek verimde ürün alabilmek, ayrıca saflaştırma aşamalarında uygulanabilir kullanışlı metodolojilerin izlenebilmesi için, ifadelenmeyi sağlayacak olan gen kasedinin dizaynı ve oluşturulması önem arz etmektedir. Bunun için, pyrG oksotrofisinin homolog rekombinasyon yoluyla sağlanmasında, pyrG genini kodlayan açık okuma dizisinin bitişiğindeki dizileri barındıran ve doğrusal hale getirilmiş delesyon vektörünün, yabani tip A. oryzae suşuna aktarılması gerekmektedir. Bu tez çalışmasında, yabani tip A. oryzae RIB40 konak mikroorganizması, pyrG geni olmaksızın, pyrG geninin açık okuma çerçevesinin yukarı ve aşağı bölgelerinden oluşturulan delesyon vektörü ile transforme edilmiştir. Böylece homolog rekombinasyon yoluyla pyrG geninin yabani tip A. oryzae genomundan silinmesi sağlanmıştır. Gen delesyonunun seçici kültür koşullarında, tekrarlı kültürleme ve qPZR analizi yöntemleri ile doğrulaması gerçekleştirilmiştir. Doğrulanan pyrG oksotrof A. oryzae mikroorganizması rekombinant anti-RNaz A VHH proteininin ifadelenmesi çalışmalarında kullanılmıştır. Anti-RNaz A VHH proteinini kodlayıcı dizi, C-terminaline bağlı 8xHis-tag ile amilaz sinyal sekansı kullanılarak, amilaz promotörü altında olacak şekilde, A. oryzae'e göre kodon optimize olarak sentezlettirilmiştir. Transformasyon çalışmaları protoplast aracılı transformasyon yöntemi ile sağlandıktan ve rekombinant anti-RNaz A VHH proteinini ifadeleyen koloninin doğrulanması çalışmaları yapıldıktan sonra, küçük ölçekte ifadelenme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Küçük ölçekte ifadelenmenin başarı ile gerçekleştirilmesini takiben, 6 L'lik fermentörde büyük ölçekte üretim çalışmaları hayata geçirilmiştir. İfadelenen rekombinant anti-RNaz A VHH proteini, C-terminalindeki 8xHis-tag'den yararlanılarak immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) yöntemiyle saflaştırılmıştır. Buna göre; küçük ölçekte ifadelenmeden elde edilen verim 44 mg/mL olarak tespit edilirken, fermentörde yapılan ifadelenmeden elde edilen verim 1.4 g/L olarak belirlenmiştir. İleri saflaştırma işlemleri jel filtrasyon kromatografisi ile sağlanmış ve ifadelenen rekombinant anti-RNaz A VHH proteininin monomerik özellikte olduğu bu yöntem ile kanıtlanmıştır. Toplam üretilen protein ve ifadelenen rekombinant protein konsantrasyonu dansitometrik olarak analiz edilmiş ve bovin serum albümin(BSA)'inin standart olarak kullanıldığı Bradford tekniğiyle belirlenmiştir. Anti-RNaz A VHH'in, hedef antijeni olan RNaz A ile spesifik etkileşiminin belirlenmesinde; pull-down analizi, jel filtrasyon kromatografi analizi ve yüzey plazmon rezonans (SPR) analizi gerçekleştirilmiştir. Pull-down analizi spesifik etkileşimin varlığını gösterirken, jel filtrasyon kromatografi analizi ifadelenen anti-RNaz A VHH'in hedef antijeni ile bağlanabilen doğru üç boyutlu katlanma yapısında olduğunu kanıtlamıştır. SPR analizinde ise hedef antijen ile bağlanma afinitesi 1.9 nM olarak ölçülmüştür. Ölçülen bağlanma afinitesi, Escherichia coli (E. coli)'de üretilen anti-RNaz A VHH'in bağlanma afinitesinden yaklaşık 18.3 kat daha fazladır. Elde edilen veriler, kurulan pyrG oksotrof A. oryzae platformunda, anti-RNaz A VHH afinite ajanının büyük ölçekte ve yüksek bağlanma afinitesi ile doğru üç boyutlu formda ve monomerik olarak üretilerek, başarılı bir şekilde saflaştırıldığını ortaya koymaktadır. Buradan hareketle tez kapsamında varılan sonuçlar; çeşitli biyoteknolojik uygulama ve araştırma çalışmalarında ihtiyaç duyulan yüksek hacimde ve hedef antijenine yüksek bağlanma afinitesi gösteren VHH afinite ajanlarının, düşük maliyetle ifadelenmesinde, tez kapsamında inşa edilen pyrG oksotrof A. oryzae ifadelenme sisteminin, güçlü salgılama yeteneği sayesinde ideal bir platform olduğunu kanıtlar niteliktedir.
Generation of plasmid-based eukaryotic model to investigate biology of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus nucleoprotein and glycoproteins
RNA viruses are the main cause of many pandemics that shape human history by causing the death of millions of people. The rapid adaptability of RNA viruses, which allows them to circulate for thousands of years, and the increased contact of humans with wild animals can trigger the emergence of virus variants that can cause new pandemics. Virus-like particle studies (VLPs) to elucidate unknown mechanisms in the virus life cycle and pathophysiology of disease are of vital importance in the development of effective antiviral strategies against these viruses that affect human life. The lack of genomic material that can cause virus infection paves the way for these viruses to be studied in BSL-2 laboratories, which are easily accessible to many researchers around the world. In recent years, the World Health Organization (WHO) has published a list of infectious agents that should be primarily investigated. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus (CCHFV) and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viruses, which are also clinically important for our country, are included in this list. From this point of view, in this thesis, various viral protein expression studies have been carried out to develop different VLP systems that can both study the biology and immunology of CCHFV and form the basis of vaccine candidate development studies for SARS-CoV-2. For this purpose, firstly, CCHFV viral proteins were produced in Huh-7 cells via pcDNA 3.1 plasmid, and their expression was confirmed by both post-transcriptional and post-translational analyses. Furthermore, immunological analyzes by in-house ELISA revealed that various viral protein combinations may promote the production of different CCHFV proteins. In addition, a unique ambisense minigenome system has been developed. The inclusion of this system in future VLP studies might result in the generation of a transcription and entry competent VLPs for CCHFV Kelkit 06 strain. Second, four different plasmids carrying multiple expression cassettes in various combinations were constructed to produce four different VLP-based vaccine candidates against SARS-CoV-2 in P. pastoris. In conclusion, the experiments conducted in this thesis have shown expression and detection of immunologically significant viral antigenic proteins of CCHFV and SARS CoV-2, two of the most serious human viral pathogens of our time, in eukaryotic cells. These studies have established a critical infrastructure at our laboratory which will be imperative for future studies. It appears that for generation and demonstration at sufficient quantities and commercially meaningful VLPs from plasmid based expression systems, further optimizations are needed. It should be underlined that to address the questions on the biology and immunology of these viruses through VLP and minigenome approaches, these optimizations such as exhaustive trials with different expression models, optimization of sequences, alternative transfection systems and stable expressions should be undertaken.
Mekanik dayanımları iyileştirilmiş polimerik hidrojel sistemleri
Yumuşak malzemelerin kullanıldığı pek çok alanda jellerin iyi mekanik özelliklere sahip olmaları kritik önem taşımaktadır. Doğal ya da sentetik polimerlerden elde edilen jeller birtakım avantajlara sahip olsalar da fizyolojik sıvılarda çok fazla şişerek genellikle çok kırılgan bir yapıya dönüşmektedirler. Bu tezin amacı, mekanik özellikleri kontrol edilebilir ve geliştirilebilir hidrojel elde edilebilmesi için, ağ yapıda moleküler seviyede bir enerji dağılım mekanizması oluşturmaktır. Bu amaç doğrultusunda hazırlanan bu tez iki bölüm şeklinde tasarlanmış olup ilk kısımda doğal bir polimer olan nişasta, ikinci kısımda ise sentetik Pluronik F127 (PF127) zincirleri kullanılarak hidrojeller hazırlanmış ve literatürde mevcut nişasta ve PF127 esaslı jellerin mekanik dayanımları arttırılmıştır. Tezin ilk bölümünde, sırasıyla lineer ve dallanmış şekilde bağlanan aynı tekrar birimlerine sahip iki homopolimer olan amiloz ve amilopektin zincirlerinden oluşan nişasta kullanılmıştır. Nişasta, yapısında bulunan hidroksil gruplarının varlığından dolayı, hidrojellerin oluşumunu içeren çeşitli uygulamalarda işlevselliğin değiştirilmesi ve geliştirilmesi amacıyla kolaylıkla modifiye edilebilir. Doğrudan çapraz bağlama durumunda, nişasta zincirlerindeki hidroksil gruplarının bir kısmı, iki veya çok işlevli bileşiklerle reaksiyona girmeye duyarlıdır. Nişastayı çapraz bağlamak amacıyla polisakkarit kimyasında en yaygın kullanılan çapraz bağlayıcı olan epiklorohidrin (ECH) kullanılmıştır. ECH üzerindeki epoksi ve halojenür grubu, nişasta yapısındaki hidroksit grubu ile reaksiyona girerek iki polimer zincirini çapraz bağlamaktadır. Bu tezde yüksek amiloz içeriğine sahip nişasta (Hylon VII) - ECH hidrojellerinin viskoelastik özellikleri araştırılmıştır. Reaksiyon bileşenlerinin konsantrasyonuna, nişastanın amiloz oranına ve yapıya başka bir polisakkarit olan Hyaluronik asit (HA) katılımına bağlı olarak jel özelliklerinin değişimi incelenmiştir. Elde edilen malzemeler şişme, viskoelastik ve morfolojik özellikleri açısından değerlendirilmiştir. Elastik ve viskoz modüller, nişasta ve ECH konsantrasyonlarına bağlı olarak artarken, NaOH'ın mol oranının, çapraz bağlama reaksiyonlarında anahtar bir parametre olduğu bulunmuştur. Devamlı basamak-deformasyon testi sırasında düşük amiloz oranı içeren ağ yapının, sol-jel geçişleri sonrası başlangıç mekanik dayanımının yaklaşık %92 ± 4'ünü kaybettiği görülmüştür. Amiloz oranı arttırıldığında ise ağ yapı sol-jel geçişlerinden sonra tamamen orijinal hallerine dönmüştür. Yüksek amiloz oranlı jeller için zamana bağlı relaksasyon testleri gerçekleştirilmiş ve yapısal dinamiklerin, HA'nın daha küçük ve daha kararlı gözenek yapılarıyla birleştirilmesiyle bir miktar bastırıldığı gözlemlenmiştir. Tezin ikinci kısmında, "Poloksamerler" olarak da bilinen ve FDA tarafından insan kullanımı için onaylanan Pluronikler kullanılmıştır. Bu moleküller hidrofilik polietilen oksit (PEO) ve hidrofobik polipropilen oksit (PPO) zincirlerinin PEO-PPO-PEO üçlü blok şeklinde birleştiği yapılardır. Pluroniklerin en önemli özelliği, konsantrasyona bağlı farklı geçiş sıcaklıklarında ısıya duyarlı misel oluşturmalarıdır. Yüksek konsantrasyonlarda, sol-jel geçişi oda sıcaklığının altında gerçekleşir. Bu nedenle, polimer oda sıcaklığında su içinde çözüldüğünde, PPO'nun hidrofobik doğası nedeniyle miseller kendiliğinden birleşir. Pluronik çözeltileri düşük sıcaklıklarda sıvı halde iken, belirli sıcaklık değerlerinin üzerine çıktıklarında jel formuna geçmekte ve soğutulduğunda tekrar sıvı hale gelmektedir. Pluronik ailesi içerisinde, medikal ve farmasötik uygulamalarda en çok tercih edilen üye, yüksek suda çözünürlüğü ve nispeten uzun hidrofobik birimleri sayesinde yüksek hidrofobik etkileşimlere sahip Pluronik® F127 (PF127)'dir. Pluronik kopolimerler, belli bir sıcaklıkta çok hızlı bir şekilde sıvı halden jel formuna geçseler de oluşan hidrojellerin mekanik dayanımlarının yetersiz olması nedeniyle fizyolojik koşullarda uzun süre dayanamazlar. Bu durum Pluronik temelli sistemlerin en önemli dezavantajlarından biridir. Hem mekanik olarak güçlü hem de enjekte edilebilir jeller elde etmek için sıcaklığa duyarlı PF127 miselleri, ışığa duyarlı kumarin ve azobenzen gruplarını tekrar eden birimler olarak taşıyan amfifilik kopolimerlerle birleştirilmiştir. Böylece sıcaklığa duyarlı PF127 esaslı akıllı jellerin mekanik dayanımlarının iyileştirilmesinin yanı sıra ışık duyarlılığına sahip enjekte edilebilir yapıların elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla toplamda dört monomer sentezlenmiş ve tersinir katılma-ayrılma zincir transfer (RAFT) polimerizasyonu yoluyla polimerize edilmiştir. Sentezlenmiş olan polietilen glikol (PEG) bazlı makroRAFT ajanı kullanılarak amfifilik diblok terpolimerler elde edilmiştir. Kopolimerlerin yapıları, karakterize edilmiş ve amfifilik diblok terpolimerler, suda miseller halinde bir araya getirilmişlerdir. UV ışık altında kromofor grupların varlığına bağlı misel çekirdeklerinin çapraz bağlanması UV spektroskopisi ile incelenmiştir. Jellerin reolojik özellikleri sıcaklık, bileşim, UV maruz kalma süresi, gerinim ve frekansın bir fonksiyonu olarak değerlendirilmiş enjekte edilebilirlikleri analiz edilmiştir. Hazırlanan formülasyonların hem ısıya hem de ışığa cevap verdiği, PF127 yapılarına kıyasla mekanik özelliklerinin iyileştiği ve enjekte edilebilir olduğu ortaya konmuştur. Son aşamada ise sisteme fonksiyonlandırılmış kitosan (f-kitosan) dahil edilmesiyle gözenekler arttırılarak ilaç taşıma uygulamalarında kullanılmaya yönelik ilk adımlar atılmıştır.
Nanoparçacık yüklü hidrojeller
Dokuların veya organların polimer bazlı bir malzeme ile desteklenmesinde veya değiştirilmesinde biyofonksiyonellik ve biyouyumluluk önemlidir. Yüksek su içeriğine sahip, çapraz bağlı hidrofilik polimer zincirlerinden oluşan hidrojeller, son yıllarda klasik malzemelerden, uyaranlara duyarlı akıllı malzemelere dönüşmüşlerdir. Akıllı jeller tasarlamak üzere yola çıkılan bu tezin ilk kısmında stearil metakrilat (SM) ve vinilpirolidon (VP) bazlı, kendini iyileştiren ve şekil hafıza özelliklerine sahip biyouyumlu SM-x ağları hazırlandı. Çeşitli potansiyel biyouygulamalardaki gereksinimleri karşılayan jeller elde etmek için mol oranları kademeli olarak hidrofilikten hidrofobik birimlere %10 ila %90 arasında değiştirildi. Elde edilen jellerin zamana bağlı bir viskoelastik karaktere sahip olmalarının yanı sıra, jellerin mekanik özellikleri, reaksiyon ortamına verilen SM miktarı ile kontrol edildi. Düşük SM içerikli jeller başlangıç modül değerlerine tam olarak geri dönemezken, ≥%60 konsantrasyonlarda elde edilen jellerin kendini iyileştirme davranışında da etkili olan dinamik hidrofobik etkileşimler nedeniyle tamamen geri dönüşümlü olduğu gözlendi. Ayrıca tüm ağlar kalıcı şekillerini saniyeler içinde tamamen geri çağırarak şekil hafıza özelliğine sahip olduğu ortaya konulmuş oldu. Suyla temas açısı ile yakından ilişkili olarak SM-x hidrojelleri üzerine ekilen insan derisi fibroblast hücrelerinin canlılığının, tüm x değerlerinde %82'nin üzerinde olduğu bulundu. Bulgular neticesinde, SM-x jel numunelerinin geniş özellik yelpazesi, çeşitli biyomedikal uygulamalardaki ihtiyaçları karşılamak üzere önemli bir potansiyele sahip olduğu ortaya kondu. Tezin ikinci kısmında ise farklı geometrilerde ve yapılardaki metalik nanoparçacıkların özellikleri optimize edilen SM-x hidrojel ağlarına dahil edilmesiyle nanokompozit hidrojeller geliştirildi. Bu durum tamamen farklı iki malzeme türünün yenilikçi bir kombinasyonu ve yapısal bir çeşitliliğidir. Nanoparçacıkların daha az aglomare olması, mekanik güç ve uyaranlar karşısında sinerjistik özellik göstermesi sayesinde ileri fonksiyonel gelişmiş malzemeler oluşturuldu. Sıcaklığa duyarlı SM-VP hidrojellerinin ağ yapılarına akıllı malzeme özelliklerinin arttırılması için altın nanoküre (AuNS) ve gümüş nanoküp (AgNC) parçacıkları farklı oranlarda dahil edildi. Elde edilen nanokompozitler jellerin (Nc) nanoparçacıklar varlığında fototermal etkiye etkiye sahiptirler. Bu özellik Nc'ler hem ışığa hem de ısıya duyarlı jeller haline getirildi. Sentezlenen Nc jeller uygulanacak alana özgü testlerle farklı özellikler sergiledi. Örneğin, ışık kaynağı altında kendini iyileştirme özelliği AgNc 0.08 jellerinde en iyi sonucu verirken, şekil hafıza özelliği açısından AgNc-0.02 jellerinde sonuç belirgin bir farklılık gösterdi. Matriks içindeki nanoparçacıklar sayesinde SM-x versiyonuna kıyasla sıcaklık altında AgNc-0.08 jelleri kendini iyileştirme özelliği gösterirken, AgNc-0.02 jelleri ise şekil hafıza özellikleri açısından belirgin bir farklılık gösterdi. Nc-x hidrojelleri üzerine ekilen insan derisi fibroblast hücrelerinin canlılığı, tüm x değerlerinde %80'in üzerinde olduğu bulundu. Bu tez kapsamında nanoparçacık yüklü hidrojellerin, uyaranlar karşısında değişimler göstererek teknolojide yumuşak robotiklerden 4D sistemlere, biyomalzemelerden tıbba kadar çeşitli alanlarda uygulamalar için potansiyel adaylar olabileceği gösterildi.
İyileştirilmiş özelliklere sahip nişasta temelli nanokompozit hidrojeller
Doğal polimerler biyouyumluluğu, biyobozunurlukları, toksik olmaması gibi birçok özelliği sebebiyle özellikle biyomedikal uygulamalarda kullanılmak üzere hidrojel sentezinde tercih edilmektedir. Bu tez kapsamında hidrojel sentezinde en çok kullanılan doğal polimerlerden biri olan nişastanın avantajlarından faydalanarak uygulama alanını genişletmek amacıyla özgün nişasta jelleri hazırlamaya karar verildi. Amiloz/Amilopektin oranının nişasta jelleri üzerindeki bilinen etkisi dikkate alınarak çalışmalar için yüksek Amiloz içeren nişasta Hylon VII kullanıldı. Ancak birçok doğal polimerle hazırlanan hidrojelde olduğu gibi nişastadan elde edilen hidrojellerinde en büyük dezavantajı mekanik dayanıksızlığıdır. Kırılma, bükülme, katlanma gerektiren uygulamalarda bu kırılgan hidrojeller gereksinimleri tam olarak karşılayamamaktadır. Tez kapsamında nişasta hidrojellerinin mekanik dayanımını iyileştirmek amacıyla ağ yapıda enerji dağılımını moleküler seviyede sağlayan bir mekanizma oluşturulması ve böylelikle viskoelastik dağılımın arttırılması için iki yöntem kullanıldı. İlk olarak bir nano yapı birimi olan epoksi gruplarıyla fonksiyonlandırılmış 8 kollu kübik glisidil-Polihedral Oligomerik Silseskioksan (g-POSS) nişastanın çapraz bağlanması için kullanıldı ve özgün tek ağ yapılı nanokompozit bir jel elde edildi. İkinci olarak tek ağ yapı varlığında 2 farklı monomer ile ikinci bir ağ yapı oluşturularak çift ağ yöntemi kullanıldı. Elde edilen nanokompozit nişasta jellerinin karakterizasyon çalışmaları jel fraksiyonu, şişme ölçümleri, temas açısı, SEM analizi, reolojik analizler ve tek eksenli basma-çekme ölçümleriyle ayrıntılı olarak incelendi. Mekanik dayanımı iyileşmiş jeller için çalışmanın son aşamasında protein salım uygulamalarında kullanılmak üzere in vitro salım ortamı oluşturuldu. Hidrojellerin enzim gibi uyaranlara yanıt verebilmesi protein salımını kontrol etmek ve hedeflendirmek için önemli bir özelliktir. Bu doğrultuda nişastanın katalizini sağlayan a-amilaz varlığında jellerin bozunması sağlandı ve a-amilaz yokluğunda aynı salım ortamı sağlanarak protein salım kinetiği kıyaslandı. Gelecek çalışmalar için a-amilaz enzimine duyarlı mekanik dayanımı iyileşmiş jeller, protein veya ilaç salım sistemlerinde potansiyel ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılması bakımından umut vaad etmektedir.
Genetik jeneralize epilepsilerde biyobelirteç belirlenmesi
Giriş: Genetik Jeneralize Epilepsiler (GJE) tüm epilepsilerin yaklaşık dörtte birini kapsamakta olup, yapısal beyin bulgusu göstermeyen genetik epilepsi grubu olarak tanımlanmaktadır. GJE tanısında kullanılan spesifik bir genetik biyobelirteç bulunmamaktadır. Genetik biyobelirteçlerin en bilineni ve üzerinde en fazla araştırma yürütüleni mikroRNA'larıdır (miRNA). Daha önce birçok epilepsi hastasının incelendiği çalışmalarda miRNA alt tipleri olan miR-106b, miR-130a-3p ve miR-194-5p incelenmiş olup sağlıklı kontrol grubuna kıyasla istatistiksel olarak ekspresyon seviyelerinin farklılık gösterdiği bulunmuştur. Çalışmamızda GJE hastalarında miR-106b, miR-130a-3p ve miR-194-5p ekspresyon düzeyleri incelendi ve olası aday genetik biyobelirteç potansiyellerinin belirlenmesi amaçlandı. Yöntem: Çalışmaya GJE tanılı 21 hasta ve 18 sağlıklı kontrol dahil edildi ve bireylerin kan örneklerinden toplam RNA izole edildi. Elde dilen RNA'lardan cDNA sentezi yapıldı. MiR-106b, miR-130a-3p ve miR-194-5p ekspresyon seviyeleri qRT-PCR ile analiz edildi. U6 housekeeping gen olarak kullanıldı. Belirtilen miRNA'ların tanısal değerini değerlendirmek için alıcı işletim karakteristiği (ROC) analizi ile eğri altındaki alan (AUC) değerleri hesaplandı ve p değerinin 0,05'ten küçük olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Sonuçlar: MiR-130a-3p'nin ekspresyon seviyesi, kontrol grubuna kıyasla hastalarda istatistiksel olarak anlamlı bir artış göstermiştir (p<0,05). ROC analizinde belirlenen AUC değeri 0,725'tir. Ancak miR-106b ve miR-194-5p'nin ekspresyon seviyeleri istatistiksel olarak anlamlı değildir. ROC analizindeki AUC değerleri sırasıyla 0,648 ve 0,571'dir. Tartışma: Çalışmamızda kullandığımız miRNA'ların değişen ekspresyon seviyeleri, GJE'nin etiyopatogenezi ile ilişkili olabilir. Bulgularımız, GJE tanısı ve prognozu için potansiyel bir biyobelirteç olarak miR-130a-3p'nin kullanılmasını önermektedir. Anahtar Kelimeler : Genetik biyobelirteç, Genetik jeneralize epilepsi, MikroRNA, ROC eğrisi
Luteolin'in, meme kanseri hücrelerine ve yaşlanma ile ilişkili salgı fenotipine karşı parakrin etkilerinin incelenmesi
Yaşlanma, genetik bir program tarafından düzenlenen ve organizmada çevresel faktörlerin etkisiyle meydana gelen yapısal, işlevsel ve psikolojik değişmelerin toplamıdır. İlerleyen kronolojik yaşla bağlı bir dizi hastalık için en büyük risk faktörüdür. Yaşlanmanın kanser hastalığıyla olan ilişkisine dair yapılan çalışmalardaki görüş, yaşlanan hücrelerin dokularda biriktiği ve yaşlanmayla birlikte dejenerasyona yol açtığı yönündedir. Dolayısıyla temel yaşlanma sürecine yapılan müdahaleler kanser hastalığı başta olmak üzere yaşa bağlı birçok hastalığı iyileştirme konusunda umut vaat etmektedir. Temel yaşlanma sürecinin ayırt edici özelliklerinden biri hücresel yaşlanmadır. Hücresel yaşlanma, bölünebilen hücreler tarafından benimsenen çok yönlü bir stres tepkisidir. Yapılan in vivo çalışmalarda, çeşitli sitokin, kemokin, büyüme faktörü ve proteaz içeren karmaşık bir mekanizma ile yaşlanmayla ilişkili salgılama fenotipinin (SAPS) oluştuğu ve buna bağlı olarak hücre proliferasyonun geri döndürülemez bir şekilde durdurulduğu gösterilmiştir. Salgılama fenotipini (SAPS) baskılayabilen düzenleyici molekülleri belirlemek amacıyla yapılan çalışmalarda, önemli bir SAPS bileşeni olan IL-6 üzerinden bazı flavonoidler salgı fenotipi (SAPS) inhibitörü olarak tanımlanmıştır. Bu flavonoid grubunun yaşlanma sürecini baskılayabileceği ve sinyal iletim yolaklarını düzenleyebileceği fikrini desteklemektedir. Luteolin, birçok bitki türünde yaygın olarak bulunmaktadır. Hücre üzerinde metastaz, apoptoz ve anjiyogenez dahil olmak üzere karsinojenezin ilerlemesindeki bir çok noktayı bloke edebilen bir flavonoid olduğu gösterilmiştir. Literatür bilgileri dahilinde luteolinin yapısı, etkilediği hücresel yolaklar ve tümör gelişimi üzerindeki etkileri göz önüne alındığında, SAPS fenotipi ile ilişkili olması hipotezini gündeme getirmiştir. Proje kapsamında luteolin flavonoidinin, meme kanseri hücreleri üzerinde, proliferasyonu ve yaşlanmayla ilişkili stres yanıtı olan salgı fenotipini (SAPS) hangi ölçüde baskıladığını göstermek amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda çalışmada yaşlandırılmış fibroblast hücre modeli oluşturulacaktır. Daha sonra bu hücrelerin meme kanseri hücreleri üzerindeki parakrin etkileri incelenecektir. Luteolin uygulanan bu hücrelerde, IL-6/NF-κB sinyal iletim yolağını düzenleyerek salgı fenotipinin baskılaması ve kanser hücrelerinin proliferasyon, migrasyon özelliklerinin engellenebildiğini göstermek hedeflenmektedir.
Fibrinolitik enzim olan nattokinaz'ın Aspergillus oryzae'de üretimi ve saflaştırılması
Dünyadaki ölümlerin büyük bir kısmı trombotik hastalık kaynaklıdır. Trombotik hastalıklar, kan hastalığı olarak bilinse de günümüzdeki yaygın birçok hastalığın sebebi olabilir; bunların içinde en ciddi ve ölüme sebep veren hastalıklardan biri de kardiyovasküler hastalıklardır. Bu hastalıkların tedavisi için uzun yıllardır antikoagülan ve antiplatelet ilaçlar kullanılmaktadır, ancak bu ilaçlar trombozu çözmede yeterli etki göstermemektedirler. Fakat fibrinolitik enzimler, kan damarı içindeki fibrin pıhtısını parçalama ve pıhtı üzerinde hareket etme yeteneğine sahiptirler. Bu nedenle fibrinolitik enzimler, kardiyovasküler hastalıklar başta olmak üzere birçok trombotik hastalığın tedavisinde büyük önem taşımaktadır. Nattokinaz adlı bir fibrinolitik enzim, Bacillus subtilis natto'nun aprN geni tarafından kodlanır. Nattokinaz, soya fasulyesi ürünü natto'nun fermantasyonu sırasında Bacillus subtilis tarafından üretilir. Nattokinaz, trombolitik ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde kullanılan ve ileri çalışmalar için umut vadeden bir enzimdir. Nattokinaz, antitrombotik, antihipertansif, antikoagülan, anti-aterosklerotik ve nöroprotektif etkilere sahiptir. Ayrıca nattokinaz, birçok ülkede "nutrasötik" olan doğal bir üründür. Oral uygulamaya uygun olup kanıtlanmış bir güvenlik profiline sahiptir, kullanımı ucuzdur ve diğer farmasötik ürünlere göre birçok avantaj sağlamaktadır. Bu nedenle çalışmamızda Nattokinaz enziminin Aspergillus oryzae'de üretilmesi ve saflaştırılması hedeflenmiştir. Bu çalışma literatürde bir ilk niteliğindedir. A. oryzae, kolay kültüre edilebilme, optimize edilebilme, hızlı büyüme, güçlü protein salgılama yeteneklerine sahiptir. Ayrıca A. oryzae, yüksek verimli, güvenli ve düşük maliyetli olması nedeniyle bu çalışma için seçilmiştir. Son zamanlarda, enzim üretiminde konak hücre olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bunun sebebi ise A. oryzae'nin amilolitik ve proteolitik enzimler gibi büyük miktarlarda hidrolitik enzim üretebilme yeteneğidir. Bu yetenek sayesinde A. oryzae, homolog ve heterolog enzim üretimi için önemli bir kaynak oluşturmaktadır. Bu çalışmada Nattokinaz geni, C-Terminaline 8xHis-tag etiketlenerek, Aspergillus kodon optimizasyonuna uyarlanmış ve Amilaz genine füzyon edilmiş şekilde GenScript tarafından sentezlenmiştir. Ardından kalsiyum klorür yöntemi ile kompetent bakteriye (Escherichia coli One Shot) transforme edilmiştir. Ampisilin dirençli LB besiyerinden koloni seçilerek plazmit izolasyonu yapılmıştır. Plazmit, restriksiyon enzimleriyle doğrusal hale getirilmiş ve Agaroz Jel Elektroforezi yapılmıştır. Jelden hedef DNA tespit edilerek ve izolasyonu yapılarak A. oryzae'e transformasyonu gerçekleştirilmiştir (Protoplast Aracılı Transformasyon). Örnekler CD Agar plakalarına ekilmiş ve 5-7 gün 30oC'de inkübe edilmiştir. Koloniler SDS-PAGE'de kontrol edilmiştir. Seçilen koloniler DPY besiyerinde kültür edilmiş ve 5-7 gün 30oC'de inkübe edilerek ekspresyonları gerçekleştirilmiştir. Daha sonra ekspresyonu tamamlanan proteinlerin saflaştırılması için IMAC metodu kullanılmıştır. Ekspresyon kontrolü ve protein analizi için SDS-PAGE ve ardından Western Blot yapılarak protein saptanmıştır. Yapılan Western Blot sonucunda, Nattokinaz enziminin füzyon şekilde üretimi ve saflaştırılmasının başarıyla gerçekleştirildiği görülmüştür. Çalışma sonucunda 106.66 mg/L NTK enzimi üretilmiştir. İki adet aktivite testi yapılmıştır. Protrombin zamanı testinde, NTK'nın pıhtılaşmayı yaklaşık 8sn yavaşlattığı, pıhtılaşma yüzdesini ciddi oranda düşürdüğü ve INR sonucunda pıhtılaşmayı ciddi oranda yavaşlattığı görülmüştür. Yapılan diğer aktivite testi ise titanyum tüplerde kandan elde edilmiş fibrin parçalarının enzim olan mikrosantrifüj tüplerine aktarılması ve parçalanmanın olup olmadığını gözlemlemek esasına dayanır. Gözlem sonucunda 5-7 gün içinde fibrinin tamamen parçalandığı görülmüştür. Yapılan aktivite testleri sonucunda NTK'nın biokatif bir enzim olduğu kanıtlanmıştır. Anahtar kelimeler: Aspergillus oryzae, Fibrinolitik enzim, Nattokinaz, Protein saflaştırma, Protein üretimi, Transformasyon
Fibrinolitik lumbrokinaz enziminin filamentli mantar Aspergillus oryzae'de üretimi ve saflaştırılması
Bu çalışmada lumbrokinaz enziminin Aspergillus oryzae'de yüksek verimde üretilmesi ve saflaştırılması hedeflenmektedir. Bu enzim fibrinolitik etkiye sahip olduğundan dolayı birçok hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Homolog üretim kaynağı lumbrokinaz için Lumbricus bimastus (283 aa)'dır. Homolog olarak üretimlerinin kısıtlı, zaman alıcı ve pahalı olması sebebiyle araştırmacılar bu enzimin heterolog çalışmalarına yönelmiştir. Fakat farklı ekspresyon sistemlerinde üretilme çalışmalarına rağmen yeterli ve istenilen verimde üretimi sağlanamamıştır. A. oryzae, amilolitik ve proteolitik enzimler gibi büyük miktarlarda hidrolitik enzim üretme yeteneğine sahiptir. Bu özellik sayesinde A. oryzae homolog ve heterolog enzim üretimi için önemli bir kaynak oluşturmaktadır. A. oryzae'nin güçlü protein salgılama, hızlı büyüme, kolay kültüre ve optimize edilebilme özelliklerinden dolayı bu çalışmada ekspresyon sistemi olarak seçilmiştir. C-terminaline 6X His-tag etiketlenmiş ve Aspergillus oryzae'ye kodon optimize şekilde tasarlanmış lumbrokinaz enzimi, pUC19 plazmid vektörüne ligasyon yapılarak sentezlettirilecektir. Gelen vektörün önce Escherichia coli TOP10 hücrelerine transformasyonu, daha sonra protoplast yöntemi ile A. oryzae'ye transformasyonu yapılacaktır. Daha sonra, CD Agar plaklarına ekimi yapılarak koloni seçilecek ve seçilen koloniler daha spesifik koloniler ve protein salınımları için DPY besiyerine ekilecektir. SDS PAGE ile kontroller sağlanacak ve bir koloni seçilerek ekspresyon başlatılacaktır. Proteinlerin saflaştırılması için IMAC (İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi) metodu kullanılacaktır.
Cytolysins expressing liver stage parasites as novel live attenuated malaria vaccines
Malaria is amongst the deadliest of infectious diseases globally. It is a vector-borne disease transmitted by the bite of female Anopheles mosquitos. Causative agents are Plasmodium species protozoan parasites. There are 5 species that are known to cause disease in humans. Over 3 billion people are at risk of malaria transmission. Prevention methods such as vector control and seasonal mass drug administration are effective tools for malaria control but with increasing resistance to frontline drugs, efficient vaccine development becomes imperative for malaria elimination. Ideal malaria vaccine should protect against the most common Plasmodium species and should have more than 75% efficacy, and a long-lasting protection. Only available vaccine so far is RTS,S which underperforms the expectations. Complex biology and various immune evasion strategies of Plasmodium parasites makes vaccine development challenging. Pre-erythrocytic stages are the bottleneck of development in vertebrate hosts. Vaccine strategies against this stage are so far the most promising. Live-attenuated whole sporozoite vaccines have been proven to confer sterile protection. Various genetic modification strategies allowed precise attenuation profiles which led to development of genetically attenuated parasites (GAP). In this thesis study, we designed two alternative attenuation strategy to be evaluated as GAP vaccines that aimed for late liver stages arrest in rodent malaria model. Both candidates had similar designs: knockout of an essential liver stages gene, and expression of a bacterial cytolysin protein. Selected genes, LISP1 and LISP2, are only expressed during liver stages. Bacterial cytolysins sequences of Streptolysin O (SLO) from Streptococcus pyogenes and Listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes were replaced with coding sequences of target genes. Resulting strains, ΔLISP1::SLO and ΔLISP2::LLO, were phenotypically analyzed for all life cycle stages of the parasite. To understand the effect of cytolysins, we replaced the cytolysin sequences with fluorescent proteins that would also work as reporter genes for liver stages expression (ΔLISP1::mNeonGreen and ΔLISP2::mTurquoise2). Cytolysin expressions significantly improved attenuation profiles of both strains. BALB/c mice were immunized with both strains and immunized mice were challenged against wild type sporozoites. As a result, ΔLISP1::SLO strain were completely attenuated. ΔLISP1::SLO strain-immunization of mice could protect against lower numbers of sporozoites but could not protect against higher numbers of sporozoites. In contrast, attenuation profile of ΔLISP2::LLO strain were strong, but there were occasional breakthrough infections. ΔLISP2::LLO strain-immunization of mice conferred sterile protection against extremely high numbers of sporozoites. Attenuation profile of ΔLISP2::LLO can be improved with various modifications, and this strategy can easily be applied to human malaria as a promising vaccine candidate in future studies.
Kurkumin yüklü PLGA-DSPE hibrit nanopartiküllerin hazırlanması, karakterizasyonu ve in vitro etkinliğinin incelenmesi
Poly (D, L Lactic-co-Glycolic acid) (PLGA) biyouyumlu, biyobozunur ve FDA onaylı bir biyopolimerdir. Bu polimer, emülsiyon- solvent evaporasyon yöntemi ile nano miseller hazırlanmasının kolay olması ayrıca, hidrofobik ilaçların taşınması için elverişli olması ile diğer biyouyumlu polimerlerden ayrılmaktadır. Kurkumin ise, Curcuma longa rizomlarından izole edilen, çok sayıda önemli biyolojik aktiviteye sahip bir doğal bileşiktir. Bu biyoaktivitelerin arasında ilk olarak kanser hücrelerinin kurkumin etkisiyle proliferasyonunun inhibe edilmesi ve apoptoza yönelmesi gelmektedir. Buna ek olarak kurkuminin kemoterapi ilaçlarının indüklediği direnç ile ilişkili genlerin aktivasyonunu ve proteinlerin ekspresyon seviyesini düşürdüğü bilinmektedir. Bu proteinlerin ekspresyon seviyesini düşürmek, kanser hücrelerinde ortaya çıkan kemoterapi direncinin gelişmesini engellemeyi ve kemoterapi ilacının daha etkili hale gelmesini sağlamaktadır. Daha önce laboratuvarımızda yapılan PLGA nano-misellerine 125 g/mL kurkumin yüklemiş ve uygulandığı kanser hücrelerinde NF-κB seviyelerindeki değişim incelemiştir. Bu çalışmanın sonucunda kurkumin'in NF-κB seviyesini düşürmekte başarılı olduğu ancak PLGA nano-misellerinin bu proteinin tüm alt birimlerini etkin şekilde düşürmek için gerekli olan konsantrasyona ulaşamadığı fark edilmiştir. Bu sorun iki sebepten kaynaklanmış olabilir. Kurkumin NF-κB'nin tüm alt birimlerinin seviyesini düşüremeyen bir bileşiktir veya PLGA'nın taşıdığı kurkumin miktarı bu etkinliği elde etmek yetersizkalmaktadır. Bu tez çalışması ile amacımız, PLGA'nın kurkumin taşımak için sahip olduğu hidrofobik kapasiteyi yine biyouyumlu ve FDA onaylı bir fosfolipit olan DSPE ile arttırmaktır. Bunun için "Emülsifikasyon- Solvent Evaporasyon" ve "Film Oluşturma–Rehidratasyon Yöntemi" olmak üzere iki farklı yöntem ile PLGA-DSPE hibrit nano-miselleri hazırlandı, hesaplamalı moleküler modelleme yöntemleri ile polimer ve lipidin uyumu incelenmiş ve fizikokimyasal olarak karakterizasyonu tamamlandı. Ardından kurkumin taşımak için hidrofobik kapasitesi geliştirilen PLGA'nın bir kemoterapi ajanı olan 5 – Flourourasil (5-FU) kullanıldığında biyolojik etki açısından iyileşme davranışları in vitro olarak incelenmiştir. "Film Oluşturma–Rehidratasyon Yöntemi" yöntemi ile hazırlanan nanomiseller ile taşınan kurkumin miktarının 250 g/mL'ye kadar yükseldiği başarılı bir şekilde gösterilmiştir. Kurkumin yüklü nano-misellerin fizikokimyasal karakterizasyonu Dynamic Light Scattering (DLS) FT-IR, Differential Scanning Chalorimetry (DSC) ve HPLC ile gerçekleştirilmiştir. DLS yöntemi ile boyutu 120 nm (sayıca %) olarak tespit edilen nano-misellerde DSC ve FT-IR yöntemleri ile kurkumin'in başarılı bir şekilde nano-partikülün çekirdek kısmına yerleştiği ve DSPE'nin PLGA'nın tüm fonksiyonel grupları ile etkileştiği tespit edilmiştir. HPLC yöntemi ile oluşturulan hibrit nano-miselin içinde tuzağa düşürülen kurkumin miktarının yüzde enkapsülasyon etkinliği (%EE) %92,006 ve yükleme kapasitesi (%DL) %7,301 olarak ölçülmüştür. Kurkumin'in hibrit nano-miselden salım mekanizması incelenmiş ve Korsmeyer–Peppas modelinin en uygun model olduğu tespit edilmiştir. Buna göre kurkumin'in hibrit nano-misellerden salımının nano-taşıyıcının şişmesine bağlı olarak, difüzyon ile gerçekleştiği ortaya çıkmıştır. Elde edilen optimize formülasyonun stabilitesi yukarıda bahsedilen analiz yöntemleri ile, çeşitli ortam (oda sıcaklığı, liyoflizasyon sonrası ve besiyerinde) ve çeşitli sürelerde incelenmiş ve hazırlanan formülasyonun yüksek ölçekte üretim sırasında pazarlamaya uygun olduğu tespit edilmiştir. Tüm bunlarla birlikte kurkumin yüklü DSPE-PLGA hibrit nano-miselleri için hesaplamalı moleküler modelleme çalışmaları (kuantum kimyasal küme modelleri ve periyodik DFTB+ hesaplamaları) gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak oluşturulan PLGA, DSPE ve kurkumin matriksinde kurkumin'in sadece DSPE veya PLGA ile değil, her ikisi ile etkileşimde olduğu, DSPE'nin PLGA zincirlerini bir arada tutmakta büyük etkisi olduğu ve üçlü sistemin birlikte oldukça kararlı bir sistem ortaya çıkardığı tespit edilmiştir. Bu sonuç stabilite çalışmaları ile uyumludur. Son olarak 250 mg/mL kurkumin taşıyan optimize DSPE-PLGA hibrit nano-misellerinin in vitro biyolojik etkisi LoVo insan kolorektal kanser hücre hattı ve sağlıklı kolon hücre hattı CCD-1072Sk üzerinde incelenmiştir. Bunun için öncelikle 5-FU'nun IC50 değeri 440.9 M olarak hesaplanmış ve ilerleyen deneylerde 5-FU'nun bu konsantrasyonu kurkumin yüklü optimize hibrit nano-miseller ile kombinasyon halinde kullanılmıştır. Optimize formülasyonun kanser hücreleri üzerindeki apoptoz etkisi akridin turuncusu (AO)/ etidyum bromür (EB) çift boyaması, DAPI boyama, floresan mikroskop incelemesi ve akış sitometrisi cihazında Annexin V-FITC ve PI boyama ile gerçekleştirilmiş ve optimize formülasyonun apoptoz üzerindeki etkisi serbest kurkumin'e kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Bunu takiben Western Blot yöntemi ile apoptotik protein artışı incelenmiştir. P53 proteininin, NP ile 5-FU kombinasyon uygulaması sonucu oluşan protein ekspresyon düzeylerinin yalnızca NP uygulamasına kıyasla anlamlı düzeyde yüksek olduğu sonucu elde edilmiştir. Bununla uyumlu olarak kemoterapi ve hibrit nano-taşıyıcının taşıdığı kurkumin'in kombine kullanımında hücre içi rekatif oksijen türleri (ROS) oranlarında anlamlı artış gözlenmiştir. Son olarak optimize DSPE-PLGA hibrit nano-misellerinin kurkumin'in hücre içine girişindeki etkisi incelenmiştir. Sonuç olarak optimize DSPE-PLGA hibrit nano-miselinin PLGA'nın kurkumin taşıma kapasitesinin başarılı bir şekilde iki katına çıkardığı tespit edilmiş ve 5-FU ile kombine tedavide kemoterapinin etkinliğini arttırdığı tespit edilmiştir. In vivo çalışmalar ile hazırlanan optimize hibrit nano-formülasyonun etkinliğini incelemek araştırmanın bir sonraki basamağı olarak tasarlanmıştır.
Kanser hücre membranı kaplı manyetik nanoparçacıkların sentezlenmesi ve glioblastoma tedavisinde sitotoksik etkinliğinin incelenmesi
Glioblastoma (GBM), yetişkinlerde en sık görülen ve en ölümcül primer beyin kanseridir. GBM için etkili ilaç dağıtımı, zayıf fizikokimyasal özellikler, terapötik moleküllerin düşük hedefleme yeteneği ve hem kan-beyin bariyerinin (KBB) em de kan-beyin tümör bariyerinin (KBTB) varlığı nedeniyle büyük ölçüde sınırlıdır. Bu nedenle GBM tedavisinde fizyolojik ve patolojik engelleri aşan yeni terapötik platformların geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır. Bilim insanları, nanotaşıyıcı sistemlerin biyouyumluluğunu ve aktif hedefleme yeteneğini artırmak için hücre membranı (HM) kamuflajı gibi yeni tedavi yaklaşımları geliştirmeye odaklanmaktadır. Hücre membranı nanopartiküllerin kullanımı, geleneksel uygulamalara geniş bir işlevsellik yelpazesi sunmak için etkili bir yaklaşım haline gelmektedir. Hücre membranlarını nanopartikül yapılarla birleştirerek doğal biyomimetik nanoyapılar elde etmek gelişen bir araştırma alanıdır. Hücre membranlarının nanopartiküller üzerine kaplanması etkili bir biyo-arayüz sağlamaktadır. Bu nanotaşıyıcıların karmaşık biyolojik aktiviteleri doğrudan kopyalayan yüzeylere sahip olarak tasarlanmasıyla, esas olarak hücre zarından türetilen ve ana hücrenin özelliklerini taklit eden yapıların oluşumu sağlanarak vücutta uzun süreli dolaşım ve aktif hedefleme sağlanabilmektedir. Bu çalışmada sentezlenen biyomimetik nanoplatformun GBM tedavisindeki etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. İlk olarak manyetik demir oksit parçacıkları birlikte çöktürme yöntemiyle sentezlenmiştir. Manyetik demir oksit parçacıklarının boyut dağılımı ve zeta potansiyeli dinamik ışık saçılımı (DLS) aracılığıyla analiz edilmiştir. İnsan beyninden izole edilmiş glioblastoma astrositomalarından U87-MG hücre hattından membran fragmentleri izole edilmiş ve zar proteinlerinin tespiti western blot yoluyla gerçekleştirilmiştir. Daha sonra koekstrüzyon yöntemiyle biyomimetik nano platform (Fe3O4@U87HM) birleştirilmiştir. Tersiyer butoksit korumalı lizin metakrilat (tBoc2LzMA), temozolomid metakrilat (TMZMA) ve 2-hidroksi-etil metakrilat (HEMA) ünitelerini içeren kopolimerler RAFT polimerizasyonuyla sentezlenmiştir. Daha sonra tBoc koruma grupları asidik hidroliz reaksiyonu yoluyla uzaklaştırılmıştır. Polimerler 1H NMR, GPC ve FTIR analizleri ile karakterize edilmiştir. Elektrostatik etkileşimlerden yararlanılarak nihai biyomimetik nanoplatform (Fe3O4@U87HM@P) hazırlanmıştır. Biyomimetik nanoplatformların boyutu ve morfolojisi TEM analizi kullanılarak karakterize edilmiştir. Elde edilen nanoplatformun U87-MG glioblastoma kanser hücre ve kontrol hücre hattı olarak CCD-1079Sk sağlıklı insan fibroblast hücre hattına karşı tedavi edici etkisi 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi ile sitotoksisite açısından değerlendirilmiştir.
Kırım Kongo Kanamalı Ateş virüsü kelkit suşu proteinlerinin ökaryotik hücrelerde stabil ifadesi
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA), insanlarda ciddi hastalığa neden olan zoonotik bir bulaşıcı hastalıktır. Bu hastalık özellikle vektör kenelerin endemik olduğu ülkelerde yüksek ölüm oranı ile karakterizedir. KKKAV'nün biyolojisi ve immunolojisine yönelik çalışmalarda viral proteinler diğer viral sistemde olduğu gibi büyük öneme sahiptir. KKKAV proteinlerinin çeşitli süreçlerdeki önemi birçok araştırmalarda ele alınmış ve bu çalışmalarda KKKAV proteinleri genellikle geçici ifade sistemleri kullanılarak üretimi sağlanmıştır. Bununla birlikte, proteinlerin stabil ifadesi tüm çalışmalar için zaman içerisinde tutarlı ve güvenilir bir model olmaktadır. Bu yüksek lisans tez çalışmasında, insan hücrelerindeki glikozilasyon süreçlerini taklit edebilen ökaryotik hücre hatları kullanarak KKKAV glikoproteinlerinin ve nükleoproteinlerinin stabil ekspresyon ile sürekli bir şekilde üretilmesini amaçlanmıştır. Bunun için insan hepatoselüler hücre hatları (Huh-7), KKKAV proteinlerinin stabil ifadesinde kullanılmıştır. Hücrelerde seleksiyon için seçici antibiyotiklere olan dirençleri, MTT analizi ile değerlendirilmiştir. KKKAV NP, PreGn ve PreGc kodlayan plazmitler Lipofectamine® 3000 ve polietilenimine (PEI) gibi transfeksiyon ajanlarının yardımıyla hücrelere aktarılmıştır. KKKAV nükleoproteinlerini ve glikoproteinlerini kararlı bir şekilde ifade eden hücreler, antibiyotiklere dirençli olan kolonilerin seleksiyonu ile üretilmiştir. Hücrelerde transfekte edilen genin stabil ekspresyon için genoma entegrasyonunun tespiti, transfekte edilen KKKAV genlerine özgü primerler tasarlanarak polimeraz zincir reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. Genomik düzeydeki doğrulamaların yanı sıra hücrelerdeki hedef proteinlerin ifadesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, Western blot, enzim immünoanalizleri ve immunfloresan analizleri ile de test edilmiştir. Yapılan deneyler, KKKAV proteinlerinin stabil hücrelerde başarılı bir şekilde ifade edildiğini göstermiştir. Western blot analizi, stabil hücre hatlarında üretilen proteinlerin beklenen boyutta olduğunu ve antijenitelerini doğrularken, EIA analizi bunların antijenik özellikleri tekrar test edilmiştir. Ayrıca, immunofloresan yöntemle mikroskobik görüntüleme üretilen proteinlerin hücreler içindeki lokalizasyonunu ortaya koymuştur. Özetle, bu tez çalışmasında, stabil hücrelerde KKKAV'nün nükleoprotein ve glikoproteinleri başarılı bir şekilde üretilmiştir. Bu stabil hücre hatlarının, KKKAV 'nün biyolojisi, immunolojisi ve patojenezi üzerine daha detaylı araştırmalarda önemli araçlar olarak hizmet etmesi beklenmektedir; çünkü bu virüs, araştırılması gereken öncelikli patojenlerden biri olarak kabul edilmektedir.
Over kanser tedavisinde reseptör hedefli in siliko ligand tasarımının in vitro incelenmesi
İnsan östrojen reseptör alfa (ERα), büyüme, metabolizma ve gelişimde rol oynayan östrojenle indüklenebilen birçok genin transkripsiyonunu düzenleyen bir nükleer reseptör ailesi üyesidir. ERα'nın dokularda aşırı ifade edilmesi ilişkili olduğu sinyal yollarını aktive etmesine neden olarak, hücrede DNA mutasyonlarının birikmesine, çoğalan hücrelerin neoplastik dönüşümüne ve tümörün ilerlemesine yol açar. Özellikle ERα ekspresyonu ve aktivasyonu hormona bağımlı kanser türlerinin gelişimi için birincil öneme sahiptir. Hormona bağımlı kanser tedavisinde ERα'yı hedefleyen çalışmalar, hücrelerde apoptozu uyarması ve epitelyal mezenkimal geçişi inhibe etmesiyle kanser tedavisinde uygun bir terapötik hedef olduğunu göstermiştir. Ancak endokrin tedavisine karşı zamanla gelişen direncin üstesinden gelebilmek için ERα'ya yönelik alternatif yaklaşımlar ligand bağlama alanınından çıkıp ERα-DNA veya ERα-kofaktör etkileşimleri (reseptör kutusunun (NR) LxxLL motifinin hidrofobik oyuk) üzerinde yoğunlaşmaktadır. Hedefli tedavilerde özellikle son yıllarda, terapötik peptitlerle, ERα-kofaktör etkileşimleri gibi protein-protein etkileşimlerinin (PPI) inhibe edilmesi hastalıkların tedavisinde genel bir strateji haline gelmiştir. Lineer peptit motiflerine göre farmakolojik açıdan daha yüksek performans gösteren, hedefe daha iyi bir afinite ile bağlanan kıstırılmış (siklik) peptitler, yeni ve hedefe yönelik inhibitörler olarak kapsamlı bir şekilde son yıllarda araştırılmaktadır. Bu yüzden bu tez çalışmasında; ERα'da yer alan çeşitli α-sarmal baskın protein-protein etkileşimlerini hedefleyen siklik peptitler, kofaktör bağlanma inhibitör bölgesi (LxxLL) baz alınarak tasarlanmıştır. Bu bölgeye özgü gerçekleştirilen in siliko çalışmalarımızda, ERα'ya bağlanan en kritik amino asitlerin kıstırılmadığı, aksine serbest bırakıldığı siklik peptit tasarımının mümkün olduğu gösterilmiştir. Bu sayede, yeni dizayn edilen siklik peptitler, ERα'ya hem özgün hem de biyoeşdeğerliği yüksek bir biçimde bağlanan, literatürde sunulan motiflere büyük bir üstünlük sağlayacak şekilde in siliko olarak hesaplanmıştır. Referans siklik peptit (SP1) ile tez kapsamında türetilen yeni siklik peptitler (SP2 ve SP3) Fmoc kimyası kullanılarak, katı-faz peptit sentez yöntemi ile sentezlenmiş ve DEAD yöntemi ile halkasallaştırılmıştır. Elde edilen lineer ve siklik ham peptitler LC-MS ile analiz edilip, karakterize edildikten sonra ters faz HPLC ile saflaştırılmış ve in vitro deneylerde kullanılmıştır. Tez çalışmasında ERα inhibitörü olarak TPBM ticari küçük molekülü, östrojen ile rekabet etmeden ERα'ya karşı peptitlerimiz ile benzer etki mekanizmasına sahip olduğu için referans molekül olarak kullanılmıştır. Gerçekleştirdiğimiz in vitro çalışmalar neticesinde tasarladığımız yeni siklik peptitlerin sadece aktif formadaki ERα (östrojen (E2) ile kompleks haline gelmiş) üzerinde etkili olduğu, E2'den yoksun ortamdaki siklik peptitlerin ERα (+) hücrelerinde herhangi bir etkisi olmadığı gözlemlendi. Bu durum siklik peptitlerin tasarımında, sadece ERα'nın aktif formunda açığa çıkan LxxLL motifine bağlandığının göstergesi olmuştur. Aynı zamanda E2 ile desteklenmiş hücre kültürü ortamında SP'lerin ERα eksprese etmeyen kanser ve sağlıklı hücre hatlarında herhangi bir toksik etki gösterememiş sadece ERα eksprese eden hücreler üzerinde antiproliferatif etki göstermiş olması, peptitlerin ERα üzerinden hücre büyümesini inhibe ettiğini desteklemiştir. Ayrıca oluşturulan peptit kombinasyonlarının hücre hatları üzerinde antiproliferatif ve toksik etki gösterdiği hücre canlılık testleri vasıtasıyla belirtilmiştir. En etkili kombinasyon grubun SP2 + SP3 ve SP1 + SP2 + SP3'ün hücrelerin ERα ile ilişki yolaklarında ve önemli apoptoz belirteçleri üzerindeki etkisi de hem gen hem de protein bazında açığa çıkarılmıştır. qPCR ve Western Blot'tan elde edilen veriler içsel apoptoz yolunda rol oynayan p53, p21, Bax ve Bcl-2 'nin yanı sıra dışsal apoptoz yolunda rol oynayan kaspaz-8'in değişen ekspresyon profilleri hücrelerin siklik peptit kombinasyon tedavasi sonrası her iki apoptoz yolu üzerinden etkileyebileceğini göstermiştir. Yapılan akış sitometrisi analizleri ile etkili kombinasyonlarla tedavi edilen hücrelerdeki kaspaz 3/7 aktivitesinin artışı ile Annexin V belirteçlerinin aşırı ifadesi hücreleri yoğun olarak erken ve geç apoptoza sürüklediğini desteklemiştir. Bunlara ilateven, Bcl-2 ekspresyonunun ve mitokondriyel membran bütünlüğünün ölçüldüğü akış sitometrisi analizlerinde siklik peptit kombinasyon tedavisi sonrasında hücrelerde Bcl-2 inaktivasyonun ve mitokondiryel memebran bütünlüğü bozulmuş hücre sayısındaki anlamlı artışlar Bcl-2 sinyal yolunun etkisiz hale getirildiği ve apoptozun mitokondri yoluyla gerçekleştiğini kanıtlamıştır. Ayrıca hücrelere sadece peptit ve peptit kombinasyonları uygulandıktan sonra hücre içinde dağılım gösteren sitoplazmik ve nükleer ERα aktivasyonlarında düşüşün meydana gelmesi siklik peptitlerin ERα'ya spesifik olduğunu kanıtlar nitelikte olmuştur. Buna ek olarak, MCF-7 hücrelerinin proliferasyonunda önemli bir rolü üstlenen hatta hormon direnci ile güçlü bir ilişkisi bulunan sitoplazmik ERα'nın, siklik peptit tedavisinden sonrasında aktivitesinin çarpıcı bir şekilde azalmasının apoptozun bu yolak üzerinden indüklediği ilgi çekici bir bulgu olarak elde edilmiştir. Sonuç olarak bu tez çalışması kapsamında, ERα hedeflemesi için siklik peptitler tasarlanmış, sentezlenmiş ve ERα(+) hücreleri üzerindeki inhibitör etkisi çeşitli in vitro çalışmalarla desteklenmiştir. Sonuçlarımızda siklik peptitlerin hücrelerin hem içsel hem de dışsal apoptoz yolunda etkili olarak hücrelerin ölüm mekanizmalarını indüklediği sunulmuştur. Bu tez kapsamında geliştirdiğimiz yeni siklik peptitlerin, yeni teknolojilerle daha da iyileştirilmesinin mümkün olduğunu ve hali hazırdaki klinik tedavilere alternatif ya da yeni peptit kombinasyon tedavilerinin oluşturulmasında yardımcı bir yaklaşım olabileceğini göstermekteyiz.