Bacillus cereus KG5' in proteaz enzimi üzerine çalışmalar

Bu çalışmada, Kös (Bingöl) kaplıcasından izole edilen Bacillus cereus KG5' in endüstride geniş uygulama alanına sahip olan ekstraselüler proteaz enzimi üzerine çalışmalar yapılması amaçlanmıştır.B.cereus KG5 BM besi yerinde kültüre alındı ve değişik inkübasyon sürelerinde proteaz aktivite tayini yapılarak maksimum enzim üretimi 24.saatte tespit edildi. pH ve sıcaklığın proteaz enzimi üzerindeki etkisi pH 6-11 ve sıcaklık 20°C ile 70ºC aralığında araştırıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerinin sırasıyla 7.0 ve 40-45ºC arası olduğu tespit edildi. Farklı besi yerlerinin, %1.2 oranında farklı azot ve %2 oranında karbon kaynaklarının enzim üretimi üzerindeki etkisi incelendi. Maksimum enzim üretimi BM besi yerinde elde edildi. En iyi azot kaynağı yeast ekstrakt ve üre, en iyi karbon kaynağı ise laktoz ve galaktoz olarak belirlenirken karbon kaynaklarından glukozun enzim üretimini inhibe ettiği tespit edildi. Farklı yeast konsantrasyonlarının enzim üretimi üzerindeki etkisi araştırıldı. %0.5 yeast ekstraktta maksimum enzim üretimi elde edilmiştir. Artan yeast ekstrakt konsantrasyonlarında enzim üretiminde azalma gözlenmiştir. %0.5 oranında farklı metal iyonlarının enzim üretimi üzerindeki etkisi araştırıldı. CaCl2' nin enzim üretimini yaklaşık 2 kat arttırırken, NaCl ve MgCl2' nin üretimi önemli ölçüde azalttığı tespit edildi. CaCl2' nin enzim üretimi üzerindeki etkisi araştırıldı. Maksimum enzim üretimi %0.5, en düşük üretimin ise %0 CaCl2 konsantrasyonlarında elde edilmiştir.B.cereus KG5' e ait kısmi olarak saflaştırılan proteaz enzim aktivitesi üzerine bazı metallerin, kimyasalların, metal şelatörlerin ve deterjanların etkisi araştırıldı. CaCl2 (2 mM' da %142), MgCl2 (5 mM ve 10 mM' da %89) ve MnCl2'nin (2 mM' da %29) proteaz aktivitesini belirli oranlarda arttırdığı, CuCl2, HgCl2 ve ZnCl2 (10 mM' da) ise enzim aktivitesini sırasıyla %100, %100' den fazla ve %96 oranında inhibe ettiği ve metal şelatörleri olan EDTA ve 1-10 phenantroline'nin (10 mM' da sırasıyla %96 ve %95) proteaz enzimini güçlü bir şekilde inhibe ettiği tespit edildi. PMSF'nin etkisinde ise etanole bağlı bir inhibisyonun olduğu belirlendi. % 1 SDS'nin tamamen, %1 Alo' nun %84 oranında, %0.5 Triton X-100' ün %5 oranında ve %0.1 Tween-80' in % 2 oranında enzim aktivitesini inhibe ettiği tespit edilmiştir. Enzimin termal stabilitesinin araştırılması sonucunda 40ºC' de 120 dakika sonunda enzimin oldukça stabil olduğu tespit edilmiştir. Enzimin termal stabilitesinin CaCl2 tarafından arttıldığı belirlendi. 2 mM CaCl2 enzimin 50ºC' de 120 dakika sonunda orijinal aktivitesini % 102 oranında koruduğu tespit edildi.Bu çalışmada B.cereus KG5' e ait proteaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi&diyaliz ve Sefadeks G-75 jel geçirgenlik kromatografisi ile %23 verimle 13 kat saflaştırıldı. Sefadeks G-75 jel geçirgenlik kromatografisi ile saflaştırılan enzimin nondenatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile varlığı tespit edilirken, SDS-PAGE ile de molekül ağırlığı yaklaşık 48 kDa civarında olduğu tespit edildi.Anahtar Kelimeler: Bacillus cereus KG5, Biyoteknoloji, proteaz enzim üretimi ve karakterizasyonu