Theses supervised by Prof. Dr. Kemal Güven
14 theses · Dicle University
Akut lenfoblastik lösemi (ALL) ve akut miyeloid lösemi (AML)'de prognozu etkileyen KMT2A anomalilerinin sıklığı
Akut lösemi hastalarında KMT2A geni anomalilerinin saptanması olumsuz prognoza iĢaret eder. ÇalıĢmada amaç Güneydoğu Anadolu Bölgesi yetiĢkin akut lösemi hastalarında bu anormalliklerin sıklığını tespit etmektir. Dicle Üniversitesi hastaneleri Hematoloji kliniğine gelen Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) ve Akut Miyoloid Lösemi (AML) ön tanılı hastalarından alınan kemik iliği ve kan örneklerine KMT2A dual FISH probu uygulanarak, anomaliler araĢtırıldı. Anomali tespit edilen FISH olguları için ayrıca, Dicle Üniversitesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı laboratuvarına rutin çalıĢmalar için gönderilen numunelerden bu çalıĢmada pozitif olanlarının panel analiz raporları da incelendi. Panelde incelenen diğer gen bölgeleri ile KMT2A bölgesi karĢılaĢtırılarak değerlendirme yapıldı. Akut lösemili hastalarda KMT2A bölgesindeki anomalilerin bazı diğer bölgelerdeki anomalilerle beraber görülmesi de olasıdır. Bu çalıĢmada KMT2A anomalili olguların, 2' sinde aynı zamanda 7. kromozomda da anomali görülmüĢtür ve 1 olguda 8q24.21 bölgesinde tetrazomi, 1 olguda da 8q21.3 bölgesinin trizomisi görüldü. FISH yöntemi ile yapılan çalıĢmada 62 olgunun 4'ünde 11q23.3 gen bölgesinde anomali tespit edilmiĢtir. Bu olgulardan 4'ü de erkek olup olguların 3'ü ALL iken 1'i AML' lidir. ALL' li olgularından 1'inde KMT2A gen bölgesinde tetrazomi ile MYC, ABL1, BCR bölgelerinde de tetrazomi tespit edildi. ALL' li 1 olguda KMT2A gen bölgesinde trizomi, 1 olgu da da hiperdiploidi bulundu. ALL'li diğer bir olguda ise KMT2A delesyonu görüldü. AML'li bir olguda KMT2A gen bölgesinde monozomi tespit edildi. 62 olguda 21 ALL'li olgulardan FISH analizinin %4,76 oranında, AML'li olgulardansa %2.43 oranında 11q23.3 gen bölgesinde meydana gelen sayısal ve yapısal değiĢimler tespit edilmiĢtir. Yaptığımız çalıĢmada; FISH ile elde edilen oranlar, literatür ile karĢılaĢtırıldığında ALL için eĢdeğer fakat AML için düĢük bulunmuĢtur.
Çermik kaplıcalarından izole edilen termofilik Geobacillus vulcani 2Çx'te beta-galaktosidaz enzim karakterizasyonu
Bu çalışmada Diyarbakır ili Çermik sıcak su kaynağından izole edilen Geobacillus vulcani 2Çx suşunun β-galaktosidazı bol miktarlarda üretmesi ve enzimin termostabil olması sebebiyle saflaştırma amaçlanmıştır. Bunun için, farklı besin ortamlarında intrasellüler ve ekstrasellüler enzim üretimi araştırılmıştır. Ekstraselüler β-galaktosidaz elde etmek için çöktürme ve jel filtrasyon gibi çeşitli saflaştırma adımları uygulanmıştır. Kısmi olarak saflaştırılan β-galaktosidazın saflaştırma kat sayısı 206.6, verim % 4.17 ve spesifik aktivite 8651,4 U/mg bulunmuştur. Saflaştırılan enzimin moleküler ağırlığı SDS PAGE ile ~104 kDa olarak belirlenmiştir. Kısmı saflaştırılan enzimin optimum sıcaklığı 55 ºC olarak belirlenmiş ve 55 ºC'de ilk bir saate kadar %73.93 oranında stabiliteyi koruduğu tespit edildi. Enzimin optimum pH'sı ve stabilitesinin 7.0 olduğu belirlenmiştir. Kısmi saflaştırılan enzim biyoteknolojik uygulamalarda kullanılabilir özelliktedir. Anahtar kelimeler: β-Galaktosidaz, Geobacillus vulcani 2Çx, termofilik, saflaştırma, ekstrasellüler
Çeşitli mezofilik ve termofilik bakterilerdeekzopolisakkarit üretimi, optimizasyonu ve karakterizasyonu
Bu çalışmada Dicle Üniversitesi Moleküler Genetik, Mikrobiyal Biyoteknoloji ve İmmünoloji Araştırma Laboratuvarında bulunan Bacillus licheniformis 3ÇA2, Geobacillus vulcani 2Çx, Bacillus zhangzhounesis 2ÇA, Bacillus licheniformis 3ÇA, Bacillus licheniformis 2ÇS suşları gibi termofilik bakteriler ve Acinobacter calcoaceticus E2, Pseudomonas aeruginosa D7, Enterobacter ludwigi D8, Pseudomonas putida D10, Acinetobacter pittii D11, Pseudomonas rhodesiae D12 gibi mezofilik suşlar kullanılarak farklı besiyerlerinde (M1, M2 ve M3), farklı karbon kaynakları (fruktoz, galaktoz, glikoz, ksiloz, laktoz, maltoz, sükroz) ve farklı oranlarda maya özütü (%0.05, %0.1, %0.15 ve %0.2) kullanılarak suşların besiyerinde üreme düzeyleri incelenmiştir. Termofilik bakterilerin M3 besiyerinde B.licheniformis 2ÇS bakterisi sükroz varlığında 7.06 kat, B.zhangzhounesis 2ÇA bakterisi sükroz varlığında 4.09 kat ve B.licheniformis 3ÇA2 bakterisi sükroz varlığında 1.86 kat, glikoz içeren besiyerinde 2.61 kat artış ile üreme gösterdiği bulundu. Termofilik bakterilerden elde edilen EPS miktarlarına bakıldığında en iyi EPS total kuru ağırlık miktarı M3 besiyerinde, %0.2 maya özütü ve % 1 sükroz içeren B.licheniformis 2ÇS bakterisinden 121 mg olarak elde edildi. Elde edilen EPS'nin karbonhidrat ve protein miktarını bulmak için sırasıyla fenol-sülfürik asit metodu ve Lowry yöntemi kullanıldı. Bu bakteriden elde edilen EPS'de bulunan karbonhidrat miktarı 333.28 µg/mL, protein miktarı ise 0.19 µg/mL olarak belirlendi. En yüksek karbonhidrat miktarına (1087.03 µg/mL) sahip bakteri B.zhangzhounesis 2ÇA olarak bulundu. B.licheniformis 2ÇS, B.zhangzhounesis 2ÇA, B.licheniformis 3ÇA2 suşlarının patojen E.coli, S.aureus, K.pneumoniae ve P.aeruginosa karşı antibakteriyel aktivitesi incelendi. En iyi etki %0.2 maya özütü ve %1 sükroz içeren besiyerinden B.licheniformis 2ÇS bakterisinin ürettiği EPS'de görüldü. E.coli'ye karşı 16 mm zon çapı ile antibakteriyel aktivite gösterdiği tespit edildi. Anahtar kelimeler: Ekzopolisakkarit üretimi, Termofilik, Fenol-sülfürik asit, Lowry, Antibakteriyel etki
Petrol ve hidrokarbon parçalayan bakterilerin izolasyonu ve biyoteknolojik potansiyellerinin belirlenmesi
Petrol dünyadaki en yaygın çevresel kirleticilerdir. Petrol kirleticileri balıkçılık, deniz habitatları, halobiyolar ve insan sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmakta ve yıllarca hatta on yıllarca sürebilen ekolojik dengeyi tahrip etmektedir. Bu çalışmada, Batman bölgesinde petrolle kirletilmiş alanlardan bakteri izole ederek, petrol parçalayan bu bakteri varyeteler üzerinde morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal ve filogenetik analizler yapılarak tanımlanmıştır. Ayrıca, bu bakterilerin ham petrolü ve çeşitli hidrokarbonları enerji kaynağı olarak kullanabilme kapasiteleri, hidrokarbonları parçalama özellikleri ve biyoparçalamada görev alan genlerin tespit edilmesi üzerinde çalışmalar gerçekleştirildi. Batman petrol sahalarından petrol ile kirlenmiş bölgelerden Pseudomonas, Enterobacter, Delftia, Acinetobacter cinslerine ait 8 bakteri izole edilmiştir. Bu izole edilen bakterilerin fenotipik analizleri yapılmış ve 16S rRNA gen dizi analizine göre, sırasıyla D7, D8, D9, D10, D11, D12, E1 ve E2 olarak adlandırılan bakterilerin Pseudomonas aeruginosa'ya %100, Enterobacter ludwigii'ye %100, Delftia tsuruhatensis'e %100, Pseudomonas putida'ya %100, Acinetobacter pittii'ye %99,93, Pseudomonas rhodesiae'ye %100, Acinetobacter pittii'ye %100, Acinetobacter calcoaceticus'a %100 benzer oldukları belirlenmiştir. Çalışılan tüm bakteri suşlarının ham petrolü karbon ve enerji kaynağı olarak kullandıkları belirlenmiştir. Bakterilerin farklı uzunluklara sahip alifatik hidrokarbonlardan, sadece uzun zincirli n-alkanlarda (pentadekan, hekzadekan) ve dekanda iyi ürediği görülmüştür. Test edilen uzun zincirli alkanlar arasında, genel olarak bakteriler tarafından en çok tercih edilen hekzadekan olmuştur. Beş günlük inkübasyon sonucunda GC-MS analizi yapılarak, ham petrolü parçalama potansiyeli açısından yüksekten düşüğe doğru sıralayacak olursak; D11'in %43, D8'in % 27, D12'nin % 21, D10'nun %18, D9'un %12, E2 'nin ise %12 ve E1'in %9 oranında degradasyona uğrattıkları tespit edildi. Üç günlük inkübasyon sonucunda bakterilerin %1'lik alkan hidrokarbonlarını parçalama oranları GC-MS analizi ile belirlenmiştir. Hekzadekanı, D9'un yaklaşık olarak %65, D11'in %70, D12'nin %38, E1'in %76 oranında parçaladığı tespit edilmiştir. Pentadekanı, D7'in %3, D8'in %29, E2'in ise %48 oranında parçaladığı tespit edilmiştir. Ayrıca, üç günlük inkübasyon sonucunda, bakterilerin tek veya karışım halinde hekzadekan ve pentadekandan oluşan hidrokarbon karışımlarını (toplam %1) parçalama oranları belirlenmiştir. Bireysel olarak D8 %31, D11 %43, E2 %53 oranında etkili olurken, karışım halinde D8+D11 %60, D11+E2 %49, D8+E2 %61 ve D8+D11+E2 ise %72 gibi yüksek oranda biyodegradasyon yaptıkları tespit edildi. D11 ve E2 suşları için tasarlanan primerlerden ilki (primer 1) kullanılarak elde edilen PCR ürünlerinin alkM geninin dizi analizi sonuçlarına göre sırasıyla %93,06 ve %92,72 oranında Acinetobacter sp. BUU8 (A6N7F9) alkM gen dizisine benzerlik gösterdiği, ayrıca D11 ve E2 suşları için tasarlanan diğer primer (primer 3) kullanıldığında elde edilen PCR ürünlerinin alkB geni dizi analizi sonuçlarına göre, sırasıyla %94,48 oranında Psudomonas citronellolis (A0A024A3Z2) ve %95,52 oranında Pseudomonas mendocina (A4XPE8) alkB gen dizilerine benzerlik gösterdiği belirlenmiştir.
Isolation and investigation of bioremediation potentials of petroleum- degrading bacteria from Kurdistan region in Iraq
In our daily life and in industry, petroleum hydrocarbons are important as primary energy resources. Crude oil is used as raw matter in numerous industries, including the refinery-petrochemical industry, where crude oil is refined through different technological processes into usable products. Most of the petroleum goes in the ecosystem via leaks and accidental spills of coastal oil refineries. As a result, it directly or indirectly affects human safety and ecological systems. Toxic organic materials in crude oil can be carcinogenic, mutagenic and potent immunotoxicants and discharged into the soil and groundwater. One of these toxic materials is aliphatic hydrocarbons, particularly alkanes of shorter chain length (C10-C20) are more toxic. The aims of this study are to isolate and identify the bacterial strains from petroleum contaminated sites as well as determine the ability for the biodegradation of crude oil. For screening of hydrocarbon degrading microorganisms, different bacterial strains were isolated from different petroleum areas of Iraqi Kurdistan. The final isolates selected as the superiors hydrocarbon degraders were identified by morphological, physiological, biochemical screening tests and 16SrRNA sequence analysis. According to 16S rRNA gene sequencing analysis, five strains designated as 2B, 3B, 4A, 6C and 8F were found to be closely related to Cronobacter malonaticus (96.31% similarity), Cronobacter dublinesis subsp. dublinesis (95.48% similarity), Serratia marcescens subsp. marcescens (92.94% similarity), Pseudomonas aeruginosa (96.23% similarity) and Acinetobacter calcoaceticus (99.08% similarity) respectively. GC-MS analysis of hydrocarbons with chain length (C9- C34) showed that 2B, 4A, 6C and 8F were able to degrade 84.76%, 73.25%, 91.62%, and 41% n-alkanes, respectively, in the crude oil incubated for 10 days. Along with the selected individual strains, a mixed bacterial consortium prepared using the above strains were also used for degradation studies. The mixed bacterial consortium did not lead to enough growth and degradation. The mixed bacterial consortium degraded 69.50% percentage of n-alkanes ranging from C11 to C34.
Purification and Characterization of β-galactosidase from Enterobacter sp. 3TP2A
In this study, a mesophilic Enterobacter sp. 3TP2A isolated from petroleum station in Batman in the southeast of Turkey was identified and found to produce a high amount of mesophilic β-galactosidase. The lactose was found to increase the β-galactosidase production to a great extent, meaning that this enzyme is inducible. An intracellular β- galactosidase from Enterobacter sp. 3TP2A was purified and characterized. The enzyme was purified by ammonium sulphate precipitation 70%, dialysis, ultrafiltration and finally using Sephadex G-75 chromatography method. The enzyme was purified to 17.3-fold after Gel permeation chromatography with a yield of approximately 11%. The purified enzyme was found to be stable in pH 8.0 and temperature of 35 oC. The Molecular weight of the purified enzyme was found to be about 60 kDa by both SDS-PAGE and native-PAGE. The effects of various metal ions at different concentrations of CaCl2, MgCl2, ZnCl2, CuCl2, and EDTA (1, 2, 5, 10 and 20 mM) were tested. EDTA and Cu2+ had an inhibitory effect on the β-galactosidase purified from Enterobacter sp. 3TP2A. EDTA inhibited the enzyme activity (upto 76%) and Cu2+ had strong inhibitory effect on β- galactosidase even at low concentrations (96.9%). However, Mg2+ caused activation of the purified enzyme. Ca2+ did not effect enzyme activity to a great extent, causing deactivation of the enzyme at 20 mM (only 16%), while Zn2+ at 1, 2 and 5 mM inhibited enzyme activity (32, 27, 8%, respectively). Increase in the concentration of Mg2+ causing activation upto 47% and also inhibition by EDTA show that the enzyme is metal-dependent or a metalloenzyme. Also determining the effect of different concentration of inhibitors on purified enzyme; PCMB (0.2, 0.4,1, 2 mM) , Iodo, DTT, β-mer, N-ethyl, (1, 2, 4, 8 mM). The enzyme was completely inhibited by N-ethyl (100%), but not affected by DTT. The enzyme was slightly affected by β-mer enhancing β-galactosidase activity at 8mM with 14% . The Iodo had a slight effect on β-galactosidase activity (upto 13%). PCMB inhibited the enzymatic activity to a great extent upto approx. 87%. The Lineweaver-Burk plot was linear, suggesting a simple Michealis-Menten kinetics. The Vmax was found as 0.701 (μmol/ min mg) and Km was found as 0.104 mM. It was also found that the time for lactose hydrolysis continues up to 10 h with the reaction catalyzed by purified β-galactosidase. The aim of this study was to purify and characterize the mesophilic β-galactosidase from Enterobacter sp. 3TP2A and then to test for use in biotechnology such as lactose hydrolysis. The results obtained indicated that this species may well be a good candidate.
Bazı basil türlerinin β-galaktosidaz gen ve enzimi üzerine çalışmalar
Çalışmamızda Bingöl Binkap sıcak su kaplıcasından izole edilen Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK'nın intrasellüler β-Galaktosidaz gen ve enzimi üzerine çalışmalar yapılmıştır. β-Galaktosidaz geni için tasarlanan bazı spesifik primerler kullanılarak PCR yardımıyla bu genin amplifikasyonu gerçekleştirilmeye çalışılmıştır. Her üç bakterinin β-galaktosidaz gen varlığının tayini için farklı primerler kullanarak yapılan PCR ürünleri incelendiğinde üç genin ürününün de ~2.4 kb olduğu tespit edildi. Enzim üzerine yapılan sıcaklık ve pH'nın etkisi 25-65˚C ve pH 4.0-11.0 aralığında incelendi. Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK için optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 45˚C, pH 6.0 ve 55˚C, pH 6.0 olarak bulundu. Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK enzimi için termal stabiliteler sırasıyla 40-50˚C ve 45-60˚C aralıklarında 30-120dk. da incelendi. Bacillus subtilis 4NK'nın termal stabiliteye sahip olduğu bulundu. Bacillus paralicheniformis 5NK termal stabiliteye sahip olduğu ancak 55˚C de aktiviteyi kısmen koruduğu 60˚C de ise koruyamadığı bulundu. Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK için amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz yoluyla kısmi olarak saflaştırma işlemi uygulandı. Bu saflaştırma sonucunda Bacillus subtilis 4NK diyaliz sonrasında enzimin verimi %85.2, saflaştırma katsayısı da 2.8 olarak bulundu. Bacillus paralicheniformis 5NK verimi %76.8, saflaştırma katsayısı 2.0 olarak bulundu. Enzim üzerine bazı kimyasal, metal ve şelatörlerin etkisi denendi. Bacillus subtilis 4NK β-galaktosidazı için bu kimyasallardan PCMB (4-kloro civa benzoik asid)'in çok yüksek oranda, DTT, PMSF ve NEM'in düşük oranda inhibisyona yol açtığı, iodoasetamid' in ise enzim üzerine ciddi etkisi olmadığı bulundu. Bacillus paralicheniformis 5NK β-galaktosidazı için bu kimyasallardan iodoasetamid ve PCMB'in yüksek oranda inhibisyona neden olduğu, PMSF'nin 10 mM da yüksek düzeyde inhibisyonuna neden olduğu ve NEM'in 5 ve 10 mM' da kısmı inhibisyonuna neden olduğu bulundu. DTT'nin ise enzim üzerine önemli oranda etkisi olmadı. Bacillus subtilis 4NK β-galaktosidazı için yapılan incelemeler sonucunda düşük konsantrasyonlarda CoCl2 ve MnCl2'ün (1ve 2.5 mM) yüksek oranlarda enzimi aktive ettiği bulundu. CuCl2 ve CdCl2 yüksek konsantrasyonlarda (10 ve 20 mM) inhibisyona neden oldu. EDTA'nın ise tüm konsantrasyonlarda enzimi aktive ettiği bulundu. Bacillus paralicheniformis 5NK β-galaktosidazı için yapılan incelemeler sonucunda birçok konsantrasyonda CuCl2 ve CdCl2'ün yüksek oranlarda enzimi inhibe ettiği bulundu. EDTA'nın ise enzimi aktivasyonunda ciddi anlamda etki etmediği bulundu. NB besiyerinde %1 laktozlu ve laktozsuz besiyerleri kullanılarak 6-48 saat aralığında kültüre alınan Bacillus subtilis 4NK ve Bacillus paralicheniformis 5NK bakterilerinin çoğalması ve enzim üretimi üzerine laktozun etkisi incelendi. 4NK bakteri varyetesinde laktozlu ortamda 24. saatten sonra bakteri çoğalmasında artış olduğu bulundu. Fakat 5NK bakteri çoğalması açısından laktozlu ortamda laktozsuz ortama göre değişiklik olmadı. Her iki bakteri için de laktozlu ortam enzim üretimini arttırdığı bulundu. Enzimin Km ve Vmax değerlerini bulmak için farklı oNPG konsantrasyonları kullanıldı. Km ve Vmax değerleri 4NK ve 5NK için sırasıyla; 23.80 mM, 1.978 abs/dk. ve 5.61 mM, 1.869 abs/dk olarak bulundu.
Termal kaynaklardan izole edilen bakterilerin enzimleri üzerine çalışmalar
Bu çalışmada sıcak su kaynaklarından izole edilen bakterilere ait enzimlerin endüstriyel alanda önem arz etmelerinden dolayı Bingöl İli Ilıcalar beldesinden getirilen su örneklerinden bakteriler izole edilmiştir. İzole edilen bu bakterilerin endüstriyel açıdan önemli olan enzimleri üretme durumları araştırılıp bu enzimler üzerine çalışmalar yapılması amaçlanmıştır. Yapılan bu çalışmada izole edilen su ve toprak örneklerinde 2 bakteri izole edildi. Bu bakterilerin çeşitli biyokimyasal testleri ile morfolojik ve fizyolojik analizleri yapıldı. İzole edilen 4NK bakterisinin çubuk şeklinde gram pozitif olduğu, 5NK bakterisinin de gram pozitif ve çubuk şeklinde olduğu tespiti yapılmıştır.İzole edilmiş bu iki bakteri için optimum pH değerinin 6 olduğu tespit edildi.Optimum üreme sıcaklıkları ise sırasıyla 40 ve 45 oC olarak belirlenmiştir. İzole edilen bakterilerin optimum koşulları belirlendikten sonra bunların ürettikleri enzimlerin optimumları belirlenmeye çalışılmıştır. Buna göre 4NK bakterisinin proteaz ve amilaz enzimlerini üretim açısından optimum süreleri sırasıyla 24. ve 15. saatler olduğu belirlenmiştir. Proteaz ve amilaz enzimlerinin optimum pH'ları sırasıyla 8 ve 4-11; optimum sıcaklıkları sırasıyla 40 ve 60 oC olarak bulunmuştur. 5NK bakterisinin ise proteaz ve amilaz enzimlerini üretim açısından optimum süreleri sırasıyla 24. ve 12.saat olarak belirlenmiştir. Bu bakteri varyetesinin proteaz ve amilaz enzimlerinin optimum pH'ları 8 ve 4-11; optimum sıcaklıkları 50 oC olarak bulunmuştur. İzolasyonu yapılan 4NK ve 5NK bakterilerinin 16S rRNA dizi analizi yapılmış, buna göre filogenetik olarak hangi tür ve alt türlere yakın olduğu tespiti yapılmıştır. Analiz sonucu 4NK bakterisinin Bacillus subtilis türüne yakın, 5NK bakterisinin ise Bacillus paralicheniformis türüne filogenetik olarak yakın olduğu tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Amilaz, proteaz, sıcak su kaynakları, enzim, Bacillus
Termofilik Bacillus licheniformis KG9'da ekstrasellüler ß-galaktozidaz enzimi üzerine çalışmalar
Bu çalışmada Batman Taşlıdere sıcak su kaplıcasından izole edilen termofilik Bacillus licheniformis KG9'un biyoteknolojik öneme sahip ekstrasellüler ß-galaktozidaz enziminin bazı özelliklerinin araştırılması amaçlanmıştır.Bacillus licheniformis KG9 NB besi yerinde laktozlu(%1) ve laktozsuz ortamlarda 6-96 saatler arasında kültüre alınarak zamana bağlı enzim üretimi araştırıldı. Laktozlu ortamda enzim aktivitesi 48.saatten(1.39 U/mg) başlayarak 96. saate ( 3.25 U/mg) kadar artarak devam ettiği görüldü. Laktozsuz ortamda ise enzim aktivitesinin 36.saatten(1.38 U/mg) başlayarak 96.saate(2.45 U/mg) kadar artarak devam ettiği ancak bu artışın laktozlu ortamdakine nazaran düşük olduğu görüldü.pH ve sıcaklığın ß-galaktozidaz enzimi üzerine etkisi pH 4-10 ve 30°C ile 90 °C aralığında ham enzimde hem de kısmi olarak saflaştırılan enzim solüsyonunda yapıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 8.0 ve 55 oC olarak bulundu.Enzim aktivitesi üzerine faklı substrat konsantrasyonlarının etkisi 0,25 -6 mM aralığında araştırıldı. En uygun substrat konsantrasyonu 3 mM olarak tespit edildi.Enzim üretimi üzerine değişik besi yerlerinin etkisi içerikleri farklı olan NB, BM1, BM2, BM3 besi yerlerinde araştırıldı. En iyi enzim aktivitesi NB besiyerinde elde edildi.Enzim üretimi üzerine %1 oranındaki farklı azot ve karbon kaynaklarının etkisi araştırıldı. Karbon kaynaklarının enzim üretimi arttırmadığı tespit edildi. Laktoz araştırılan diğer karbon kaynaklarına göre daha yüksek bir aktivite tespit edildi. Galaktoz, glukoz ve çözünebilir nişastanın ekstrasellüler enzim üretimini büyük oranda inhibe ettiği tespit edildi. Azot kaynaklarından glisin ve amonyum sülfat enzim üretimini az miktarda arttırdığı tespit edildi. Yeast ekstrakt, beef ekstrakt , pepton ve tripton'un enzim üretimini arttırmadığı tespit edildi.Enzim amonyumsülfat çöktürmesi ve diyaliz aşamasından geçirilerek kısmi olarak saflaştırıldı. Ham ekstraktta enzimin spesifik aktivite değeri 1631 U/mg, verim %100, saflaştırma katsayısı 1 iken diyaliz sonrasında sırasıyla spesifik aktivite değerinin 19030.45 U/mg , verimin %15,7 ve saflaştırma katsayısının 11,66 olarak değiştiği tespit edildi.Kısmi olarak saflaştırılan enzimin aktivitesi üzerine bazı kimyasalların, metallerin, metal şelatörlerin etkisi araştırıldı. MgCl2 8 mM'da %16 oranında ß-galaktozidaz aktivitesini arttırdığı, ZnCl2 ve CuCl2'ün 1mM'da sırasıyla%99.5 ve %93.5 oranında enzim aktivitesini inhibe ettiği, CaCI2'ün 20 mM'da enzim aktivitesini %62 oranında inhibe ettiği, metal şelatörleri olan EDTA ve 1,10-phenanthroline monohydrat'ın enzimde inhibisyona neden olmadığı tespit edildi. DTT ve ß-mercaptoethanol'un 10 mM'da sırasıyla %37 ve %24 oranında enzim aktivitesini arttırdığı, PCMB'nin 4 mM'da enzim aktivitesini %52 oranında inhibe ettiği, Iodoacetamide'in 20 mM'da enzim aktivitesini %53 oranında inhibe ettiği, PMSF ve N-ethylenemaleimide enzimde inhibisyona neden olmadığı tespit edildi.Kısmi olarak saflaştırılan enzimde gliserol ve sorbitolün dondurma-çözdürme işleminde koruyucu etkisi %1-5 konsantrasyonlarında araştırıldı. Sorbitol için en iyi koruyucu etki %5 konsantrasyonunda olduğu tespit edildi. Gliserol de ise %1'de %83, %2- %5 konsantrasyonlarında yaklaşık %90 oranında dondurma ve çözme işleminde koruduğu tespit edildi.Enzimin termal stabilitesi 50 -65 ºC sıcaklık aralıklarında araştırıldı. Enzimin aktivitesini 50 ºC 120dk. sonunda %90 oranında koruduğu, 55 ºC'de 120 dk. sonunda aktivitesini tamamı ile koruduğu, 60 ºC'de 120dk. sonunda %90 oranında koruduğu tespit edildi. 65 ºC'de ise 20 dk.'da enzimin aktivitesini tamamen kaybettiği tespit edildi.Glukoz ve galaktozun, enzim üzerinde yaptığı inhibisyon etkisi belirlendi. Glukoz ve galaktozun 2 -128 mM konsantrasyonları test edildi. Glukozun enzim üzerine ihibisyon etkisi gözlenmedi. Galaktoz'un ise 128 mM'da %97 oranında inhibisyona neden olduğu tespit edildi. Galaktoz'un inhibisyon çeşidini belirlemek amacı ile 4 mM , 16 mM , 32 mM konsantrasyonlarında ve belirli enzim konsantrasyonlarında, 1-6 mM aralığındaki ONPG konsantrasyonları kullanıldı. Galaktoz'un enzim üzerinde yarışmalı bir inhibisyona neden olduğu tespit edildi. ONPG için Km ve Vmax değerleri Lineweaver?Burk plot'a göre sırası ile 3.52 mM ve 1.602µmol/dk. olarak hesaplandı.12- 96. saatler arasında kültüre alınan bakterilerde zamana bağlı enzim üretim oranları non-denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile teyit edilmiştir.
Termofilik Anoxybacillus sp. AH1'de ?-amilaz enzimi üzerine çalışmalar
Bu çalışmada Dargeçit (Mardin) sıcak su kaplıcalarından izole edilen termofilik Anoxybacillus sp. AH1'de biyoteknolojik öneme sahip olan ?-amilaz enziminin bazı özelliklerinin araştırılması amaçlanmıştır.Anoxybacillus sp. AH1 NB besiyerinde üretildi ve değişik inkübasyon sürelerinde ?-amilaz aktivitesi ölçüldü. Maksimum enzim üretimi 12?24 saatleri arasında tespit edildi.pH ve sıcaklık etkisi sırasıyla pH 4.0?11.0 ve 30?90 oC'de hem ham enzimde hemde kısmi olarak saflaştırılan enzimde araştırıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 7.0 ve 60 oC olarak bulundu.Enzim üretimi üzerine değişik besiyerlerinin, % 1'lik farklı azot ve % 0.5-% 1 oranlarında farklı karbon kaynaklarının ve nişastaların etkisi incelendi. Maksimum enzim üretimi NB1 besiyerinde elde edildi. En iyi azot kaynağı pepton ve beef ekstrakt, en iyi karbon kaynağı ise % 0.5 oranlarındaki maltoz, glukoz ve laktoz olarak belirlendi. Ayrıca % 0.5 ve % 1 oranlarındaki patates nişastasının ve % 1 oranında çözünebilir nişastanın enzim üretimini arttırdığı tespit edildi.Enzim üretimi üzerine çeşitli konsantrasyonlarda CaCl2'nin etkisi araştırıldı. CaCl2 varlığında enzim üretiminin arttığı tespit edildi. Maksimum enzim üretimi 20 mM'da elde edildi.Anoxybcillus sp. AH1'de ?-amilaz kısmi olarak saflaştırıldı ve enzim aktivitesi üzerine bazı kimyasalların, metallerin, metal şelatörlerin ve deterjanların etkisi incelendi.MgCl2 (8 mM'da % 41) ve CaCl2'nin (8 mM'da % 70) ?-amilaz aktivitesini belirli oranlarda arttırdığı, ZnCl2 (0.5 mM'da % 85 ve 1 mM'da % 93), CuCl2'nin (0.5 mM'da % 76 ve 1 mM'da % 100) ve metal şelatörleri olan EDTA (10 mM'da % 63) ve 1,10-phenanthroline'nin (10 mM'da % 22) ise yüksek oranda inhibe ettiği tespit edildi. ß-mercaptoethanol (10 mM'da % 64) ve DTT'nin (10mM'da % 100) ?-amilaz aktivitesini geniş ölçüde arttırdığı, PCMB (4mM'da % 52) ve PMSF'nin (4mM'da % 60) ise enzim aktivitesini belirli oranlarda inhibe ettiği tespit edildi. Iodaacetamide ve N-ethylmaleimide'nin enzim aktivitesini çok az etkilediği görüldü. Enzim aktivitesinin çeşitli deterjanlar varlığında arttığı; fakat üre tarafından güçlü bir şekilde inhibe edildiği tespit edildi.Km ve Vmax gibi kinetik parametreleri ?-amilazın % 0.5-% 3 (w/v) oranlarında tamponda hazırlanan çözünebilir nişasta ile inkübasyona bırakılarak hesaplandı. Km ve Vmax değerleri Lineweaver?Burk plot'a göre sırasıyla 0.102 mM ve 0.929 µmol/dk. olarak hesaplandı.Enzimin 45 oC'nin üzerindeki sıcaklıklara duyarlı olduğu ve termal stabilitesinin gliserol ve sorbitol tarafından arttırıldığı belirlendi. % 30 gliserol varlığında enzimin 55 oC ve 60 oC' de 120 dakika sonunda orijinal aktivitesini sırasıyla % 99 ve % 85 oranında koruduğu tespit edildi.Enzimin elektroforetik analizi nondenatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile yapıldı.Anahtar Kelimeler:, Anoxybacillus sp. AH1, Biyoteknoloji, ?-amilaz enzim üretimi, enzim karakterizasyonu
Dargeçit ve Güçlükonak sıcak su kaynaklarından termofilik bakteri izolasyonu ve tanımlanması
Mardin ili Dargeçit ve Sırnak ili Güçlükonak ilçeleri sıcak su kaynaklarındansu ve çamur örnekleri alınarak bakteri izolasyonu yapıldı. Bu bakterilerin morfolojik,fizyolojik, biyokimyasal özellikleri, lipit analizi ve 16S rRNA dizi analizi yapılaraktanımlanması yapıldı.Hısta (Güçlükonak) sıcak su kaynagından izole edilen iki tane izolat GE1 veGE2 olarak adlandırıldı. Bu izolatlar çubuk seklinde, gram-pozitif, aerobik, hareketlive spor olusturan termofil karekterde oldukları belirlendi. GE1'in basilleri genellikleikili halde GE2'nin ise tekli halde bulunmaktadır. Üreme sıcaklık aralıgı GE1 için30-65 ºC (optimum 60ºC), GE2 içinde 35-65 ºC (optimum 60ºC) olarak bulundu.Optimum üreme pH'sı GE1'in 9.0, GE2'nin 9.5 olarak bulundu. GE1 ve GE2'ninbüyüme grafigi çizildi ve sırası ile 15. ve 12. saatlerde en yüksek oranda ürediklerigörüldü. GE1 ve GE2'nin nisasta, katalaz, üreaz, fosfataz testleri pozitif tespit edildi.zolatların %1'lik NaCI'e tolerans gösterdikleri saptandı. GE1'in karbon kaynagıolarak galaktoz, sakkaroz, maltoz ve laktozu kullandıgı; glukoz, fruktoz ve gliserolüde zayıf bir sekilde kullandıgı saptandı. GE2'nin maltozu karbon kaynagı olarakkullandıgı, glikoz ve sakkaroz da zayıf olarak kullandıgı tespit edildi.Ilısu (Dargeçit) kaplıcasından izole edilen, AH1 ve AH2 olarak adlandırılanizolatlar çubuk sekilli, gram-pozitif, spor olusturan, aerobik, hareketli termofiliközellikte bakterilerdir. Hücreleri genellikle ikili halde bulunmaktadır. AH1'in üremesıcaklık aralıgı 30-65 ºC (optimumu 60 ºC) olarak bulundu. AH2'nin üreme sıcaklıkaralıgı ise 30-65 ºC (optimum 65 ºC) olarak bulundu. AH1'in pH üreme aralıgı 5.5-10.0 (optimum 7.5) bulundu. AH2'nin pH üreme aralıgı 6.0-11.0 (optimum 7.5)olarak bulundu. AH1 ve AH2' nin büyüme grafigi incelendiginde, çogalmanınsırasıyla 24. saat ve 15. saat oldugu saptandı. zolatların nisasta hidrolizi, katalaz,kazein, lipaz ve fosfataz testleri pozitif olarak tespit edildi. Her iki izolatın da lizozimduyarlılıgı ve sodyum azid duyarlılıgı pozitif görüldü. Ayrıca izolatların %2'likNaCI'e toleranslı oldukları görüldü. AH1'in karbon kaynagı olarak galaktoz vegliserolü zayıf olarak kullandıgı tespit edildi. AH2'nin ise sakkaroz, laktoz vegliserolü zayıf bir sekilde kullandıgı tespit edildi.GE1, GE2, AH1'in lipit analizleri Alicyclobacillus acidocaldarius subsp.rittmannii ve Geobacillus toebii standartları ile yapılan karsılastırmalarda izolatlarınfosfolipitleri, glikolipitleri ve aminolipitlerinin Geobacillus standatlarına benzerlikgösterdigi görüldü.GE1'in 16S rRNA gen dizisinin veri tabanındaki diger türlerlekarsılastırılması soncunda Geobacillus cinsine ait türle yakınlık gösterdigi görüldü.Geobacillus cinsinin yeni bir türü olabilecegi düsünülmektedir.GE2'nin 16S rRNA gen dizi analizi sonuçları diger türlerle karsılastırıldıgındaGeobacillus kaue'a yakınlık gösterdigi görüldü.AH1 ve AH2'nin 16S rRNA gen dizi analizi veri tabanındaki mevcut türlerlekarsılastırıldıgında Anoxybacillus flavithermus'a % 99 oranında yakınlık gösterdigibulunmustur.Anahtar Kelimeler: Bakteri tanımlanması, termofilik bakteri, 16S rRNA, Sıcak sukaynagı
Bacillus cereus KG5' in proteaz enzimi üzerine çalışmalar
Bu çalışmada, Kös (Bingöl) kaplıcasından izole edilen Bacillus cereus KG5' in endüstride geniş uygulama alanına sahip olan ekstraselüler proteaz enzimi üzerine çalışmalar yapılması amaçlanmıştır.B.cereus KG5 BM besi yerinde kültüre alındı ve değişik inkübasyon sürelerinde proteaz aktivite tayini yapılarak maksimum enzim üretimi 24.saatte tespit edildi. pH ve sıcaklığın proteaz enzimi üzerindeki etkisi pH 6-11 ve sıcaklık 20°C ile 70ºC aralığında araştırıldı. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerinin sırasıyla 7.0 ve 40-45ºC arası olduğu tespit edildi. Farklı besi yerlerinin, %1.2 oranında farklı azot ve %2 oranında karbon kaynaklarının enzim üretimi üzerindeki etkisi incelendi. Maksimum enzim üretimi BM besi yerinde elde edildi. En iyi azot kaynağı yeast ekstrakt ve üre, en iyi karbon kaynağı ise laktoz ve galaktoz olarak belirlenirken karbon kaynaklarından glukozun enzim üretimini inhibe ettiği tespit edildi. Farklı yeast konsantrasyonlarının enzim üretimi üzerindeki etkisi araştırıldı. %0.5 yeast ekstraktta maksimum enzim üretimi elde edilmiştir. Artan yeast ekstrakt konsantrasyonlarında enzim üretiminde azalma gözlenmiştir. %0.5 oranında farklı metal iyonlarının enzim üretimi üzerindeki etkisi araştırıldı. CaCl2' nin enzim üretimini yaklaşık 2 kat arttırırken, NaCl ve MgCl2' nin üretimi önemli ölçüde azalttığı tespit edildi. CaCl2' nin enzim üretimi üzerindeki etkisi araştırıldı. Maksimum enzim üretimi %0.5, en düşük üretimin ise %0 CaCl2 konsantrasyonlarında elde edilmiştir.B.cereus KG5' e ait kısmi olarak saflaştırılan proteaz enzim aktivitesi üzerine bazı metallerin, kimyasalların, metal şelatörlerin ve deterjanların etkisi araştırıldı. CaCl2 (2 mM' da %142), MgCl2 (5 mM ve 10 mM' da %89) ve MnCl2'nin (2 mM' da %29) proteaz aktivitesini belirli oranlarda arttırdığı, CuCl2, HgCl2 ve ZnCl2 (10 mM' da) ise enzim aktivitesini sırasıyla %100, %100' den fazla ve %96 oranında inhibe ettiği ve metal şelatörleri olan EDTA ve 1-10 phenantroline'nin (10 mM' da sırasıyla %96 ve %95) proteaz enzimini güçlü bir şekilde inhibe ettiği tespit edildi. PMSF'nin etkisinde ise etanole bağlı bir inhibisyonun olduğu belirlendi. % 1 SDS'nin tamamen, %1 Alo' nun %84 oranında, %0.5 Triton X-100' ün %5 oranında ve %0.1 Tween-80' in % 2 oranında enzim aktivitesini inhibe ettiği tespit edilmiştir. Enzimin termal stabilitesinin araştırılması sonucunda 40ºC' de 120 dakika sonunda enzimin oldukça stabil olduğu tespit edilmiştir. Enzimin termal stabilitesinin CaCl2 tarafından arttıldığı belirlendi. 2 mM CaCl2 enzimin 50ºC' de 120 dakika sonunda orijinal aktivitesini % 102 oranında koruduğu tespit edildi.Bu çalışmada B.cereus KG5' e ait proteaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi&diyaliz ve Sefadeks G-75 jel geçirgenlik kromatografisi ile %23 verimle 13 kat saflaştırıldı. Sefadeks G-75 jel geçirgenlik kromatografisi ile saflaştırılan enzimin nondenatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile varlığı tespit edilirken, SDS-PAGE ile de molekül ağırlığı yaklaşık 48 kDa civarında olduğu tespit edildi.Anahtar Kelimeler: Bacillus cereus KG5, Biyoteknoloji, proteaz enzim üretimi ve karakterizasyonu
Termofilik Bacillus licheniformis KG9'a ait ß-galaktosidaz geninin Escherichia coli'ye aktarılması ve enzimin karakterizasyonu
Bu çalışmada sıcak su kaynağından izole edilen termofilik Bacillus licheniformis KG9 suşu; ß-galaktosidazının stabil olması, enzimin bol miktarda üretilmesi ve bu bakterinin 16S rRNA dizi analizi karşılaştırıldığında tüm genomu bilinen B. licheniformis DSM 13'e %99.9 oranında benzerlik göstermesinden dolayı gen klonlaması ve saflaştırma için kullanılmıştır. B. licheniformis KG9'un kromozomal DNA'sı izole edildi. Termofilik bakterilere ait ß-galaktosidaz geni, gen kütüphanesinden tarandı. PCR'a dayalı metodla izole edilen 4 farklı putatif ß-galaktosidaz geni (ß-gal I, ß-gal II,ß-gal III,ß-gal IV) çoğaltıldı. Elde edilen PCR ürünleri pUC18?lacZ vektörüne klonlanarak Escherichia coli'ye aktarıldı ve eksprese olan koloniler seçilerek dizi analizi yapıldı. Dizi analiz sonuçlarına göre; 4 farklı putatif ß-galaktosidaz geninin, gen kütüphanesinde bulunan diğer Gram pozitif Bacillus türlerinin genlerine benzerlik gösterdiği görüldü. En yakın homolojilerin: ß-gal I %42.9 Bacillus cereus'tan tanımlanan ß-gal'a; ß-gal II %68.3 Bacillus circulans'tan tanımlanan ß-gal'a; ß-gal III %68.8 Bacillus subtilis'ten tanımlanan ß-gal'a; ß-gal VI %76.7 B. subtilis'ten tanımlanan ß-gal'a yakınlık gösterdiği belirlendi.Hem B. licheniformis KG9 hem de rekombinant E. coli'den elde edilen ß-galaktosidaz, DEAE-selüloz, Sephadex G-75 ve p-aminobenzil-1-thio-ß-D-galaktopiranosid (PABTG-agarose) kromatografi yöntemleriyle saflaştırıldı. Saflaştırma kat sayısı 9.4 ve verim %85 olarak belirlendi. Saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı non-denatüre PAGE ile yaklaşık 90 kDa olarak tespit edildi.Saflaştırılan enzimin karakterizasyonu çalışmalarında; substrat özgünlüğü için yapay (ONPG) ve doğal (laktoz) substratlar kullanılarak, metaller ve EDTA'nın etkisini belirlemek için farklı konsantrasyondaki (1, 2.5, 5, 10, 25 mM) CoCl2, MgCl2, NiCl2, CaCl2, MnCl2, HgCl2, AgCl2, FeCl2 ve EDTA kullanılarak test edildi. Ca+2 (%147), Mn+2 (%106) ve Mg+2'nin (%135) aktiviteyi artırdığı; Ag+2, Fe+2 ve Hg+2'nin ise enzim aktivitesini inhibe ettiği tespit edildi. ONPG konsantrasyonuna bağlı olarak enzimin Km ve Vmax değerleri Lineweaver?Burk plot'a göre sırasıyla 2.0792 mM ve 2.037 ?mol/dk olarak hesaplandı. Laktoz konsantrasyonuna bağlı olarak enzimin Km ve Vmax değerleri Lineweaver?Burk plot'a göre sırasıyla 9.068 mM ve 1.0476 ?mol/dk olarak hesaplandı.
Çeşitli pestisitlerin "Gammarus kischineffensis"in antioksidan enzim sistemi ve bazı biyobelirteçler üzerine etkisi
Dünyada en fazla kullanılan tarımsal mücadele yöntemleri, kimyasal yöntemlerdir. Kimyasal mücadelenin temelinde pestisit denilen sentetik zirai maddeler vardır. Pestisitler tarımda kullanılan, ürün kaybına yol açan böcek, hayvan ve bitkilerin gelişimini önlemek, bu zararlı canlıları yok etmek, geri püskürtmek veya bu canlıların sayısını azaltmak için üretilmişkimyasal maddeler ya da biyolojik ajanlardır (virüs, bakteri). Bilinçsiz pestisit kullanımısonucunda insan, hava, su, toprak ve yabani hayat olumsuz etkilenmekte, hedef alınan canlılarda direnç oluşmakta, doğal hayatın ve yararlı canlıların öldürülmesiyle doğal denge bozulmakta ve bitkilerde fitotoksisite görülmektedir. Yüzey suları ve içerdikleri doğal kommünite, pek çok antropojenik toksik kimyasalla kontamine olmuştur. Sucul ekosistemlerin korunabilmesi için bu kimyasalların etkilerinin değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu antropojenik kimyasallardan en ciddi problem yaratanlar pestisitlerdir. Çünkü pestisitler canlıları (hem hedef hem de hedef olmayan organizmaları) öldürmek için özel olarak tasarlanmış ve çoğunlukla kasıtlı olarak doğaya bırakılan kimyasallardır. Yoğun tarım, hava ve yüzey sularının kirlenmesine, su sistemlerinin ötrifikasyonuna, sera gazları emisyonlarına ve asit yağmurlarına neden olmaktadır. Uzun zamandır tarımsal alanlarda zararlılarla mücadele etmek, dolayısı ile verimi artırmak için kullanılan pestisitler insan sağlığını ve çevreyi ciddi anlamda tehdit etmektedir. Çalışmamızda kullandığımız Gammarus kischineffensis, Crustacea sınıfına ait bir türdür. Crustacea sınıfına ait türler genelde su sistemlerindeki kirliliği belirlerken biyoindikatör olarak kullanılmaktadır. Ayrıca Gammarus kischineffensis balıklar için besin kaynağıdır bu nedenle besin piramidinin temel basamaklarından birini oluşturmaktadır ve biyolojik birikimdeki yeri nedeniyle önem arz etmektedir. Bu araştırma kapsamında, endosulfan, indoxacarb, thiomethoxam ve atrazinin ve bu pestisitlerin kombine kullanımlarının, Gammarus kischineffensis?in antioxidan ve detoksifikasyon enzimleri üzerine etkilerinin incelenmesi ve bu organizmalarda bıraktığı kalıntı düzeyleri araştırılmıştır. Sonuç olarak, pestisitlerin tek ve kombine kullanımlarının Gammarus kischineffensis'in antioksidan ve detoksifikasyon enzimleri üzerinde etkili olduğu gözlenmişir. Endosulfan dışındaki tüm pestisitler için kalıntı tespit edilmiştir ve sonuçların enzim cevapları ile uyumlu olduğu belirlenmiştir.Anahtar Kelimeler: Gammarus kischineffensis, antioksidan enzimler, asetilkolinesteraz, pestisit kalıntısı