APTMS ile aktive edilmiş taşıyıcıya CALB'nin (Candida antarctica lipase B) çapraz bağlama yöntemi ile immobilizasyonu

Enzimatik katalizleme işlemlerinin polimer sentezlerinde kullanılması, steryokimya, kimyasal-seçicilik ve bölgesel seçicilik üzerinde kontrol sağlanabilmesi nedeni ile son yollarda dikkat çekmektedir. Organik sentezden farklı olarak, enzimatik polimerizasyon nontoksik, biyo-uyumlu ve biyo-bozunabilir ürünler sağlar. Bu gibi avantajların doğrultusunda, enzimatik polimerizasyon sonucu elde edilen ürünler biyomedikal mühendislik, ilaç salınım sistemleri, doku ve organ nakilleri gibi tıbbi uygulamalarda geniş kullanım alanı bulmaktadırlar. Diğer önemli bir nokta olarak, seliloz, kitin, ksilan, ve hiyalüronik asit gibi bazı polimerik ürünler sadece enzimatik polimerizasyon ile başarılı bir şekilde üretilebilirler. Polikaprolakton, diğer biyo-polimerlere kıyasla uygun bozunma hızlarına ve kontrol edilebilir gözenek yapısına sahip olduğu için ilgi odaği olmuştur. Kristallenebilirliği, molekül yapısına bağlı olarak %69 oranına kadar ulaşabilmektedir. Mölekül ağırlığı azaldıkça kristal yapısında artık gözlemlenmektedir. Bu şekilde, mekanik ve termal özelliklerinin yanı sıra fiziksel yapısı da molekül ağırlığına bağlıdır. Molekül ağırlığı 530 ve 630 000 g/mol arasında değişmektedir. Polikaprolaktonun diğer bir önemli özelliği ise, polilaktik asit, polivinil klorür, polibisfenol-A gibi çeşitli polimerler ile iyi karışabilirlik göstermesidir. Polikaprolakton aynı zamanda üretim açısından kolay ve tıbbi uygulamalarda yapı iskeleti olarak çeşitli tiplerde bulunabilen bir üründür. Bu sebeple, doku mühendisliğinde geniş kullanım alanına sahiptir. Farklı kaynaklardan çeşitli lipazlar arasında Candida antartica lipaz B (CALB) ɛ-kaprolakton polimerizasyonunda yüksek katalitik etki göstermektedir. Polikaprolaktonun enzimatik polimerizasyonu polikondenzasyon ve halka açılma polimerizasyonu olarak iki farklı mekanizmada gerçekleşebilir. Polikandenzasyon reaksiyonlarında düşük moleküllü ürün eldesinin yanı sıra reaksiyon sırasında ortaya çıkan yan ürünlerin uzaklaştırılması da dezavantaj olarak değerlendirilmektedir. Polykondenzasyon reaksiyonlarının bu gibi dezavantajlarından dolayı halka açılma polimerizasyon mekanizması daha ön plana çıkmaktadır. Bununla birlikte enzimler hassas yapıda makro-moleküllerdir. Reaksiyon sonunda tekrar kazanımlarını sağlamak ve stabilite iyileştirmeleri için immobilizasyon işlemi gereklidir. Bunun yanında immobilizasyon işlemi sonucu olarak katalitik aktivitenin yükselmesi de arzu edilen bir sonuçtur. İmmobilizasyon işleminin başarılı oldugunun önemli belirleyici faktörlerinden biri de enzimin tekrar kullanım kapasitesidir. Immobilize CALB 'nin ticari bir türevi olan Novozyme 435® ɛ-kaprolakton halka açılması polimerizsyonunda yüksek verimi ile bilinmektedir. Bununla birlikte, immobilizasyon taşıyıcı maddesinden kaynaklanan yüksek enzim maliyeti ve taşıyıcı ile enzim arasındaki bağın zayıflığından kaynaklanan enzim sızdırma durumları hala güncel problemlerdir. Bu sebeplerden ötürü, mevcut sistemlere alternatif olacak daha ucuz ve etkin immobilizasyon yaklaşımları literatürde yer almaktadır. Mevcut çalışmada, ticari ismi Lipozyme® olan serbest enzim pirinç kabuğu külü üzerine immobilize edilmiştir. Pirinç kabuğu tarımsal bir atık olarak kolay erişilebilinir ve ucuz bir materiyaldir. Aynı zamanda bu materiyal kontrollü sıcaklık ve sürede ısıl işlem gördüğünde amorf silika için bir kaynak olmaktadır. Amorf silikanın ince tanecik yapısı, gözenekli ve geniş yüzey alanı bu materiyali immobilizasyon çalışmaları için iyi bir taşıyıcı seçeneği yapmaktadır. Bu çalışmada, enzimin taşıyıcı uzerinden ayrılmasını en az seviyeye indirebilmek için CALB 'nin taşıyıcı üzerinde kovalent olarak bağlanılmasına çalışılmıştır. Yeni dizayn edilen immobilize enzimin performansı ɛ-kaprolakton'un halka açılma polimerizasyonu üzerinde değerlendirilmiştir. Pirinç kabukları 600 0C 'de altı saat yakılarak taşıyıcı materiyal elde edilmiştir. Isıl işlem ardından, pirinç kabuğu külünün yüzey modifikasyonu iki aşamada tamamlanmıştır. Öncelikle, taşıyıcı yüzeyinde 3-aminopropiltrimetoksisilan (3-APTMS) ile silanlama işlemi gerçekleştirilerek fonksiyonel amino grupları elde edilmiştir. Ikinci aşamada, gluteraldehit kullanılarak taşıyıcı yüzeyi aktifleştirilmiştir. Immobilizasyon parametreleri arasında en iyi koşulları belirleyebilmek için farklı 3-APTMS ve gluteraldehit konsantrasyonları ile beraber farklı enzim yükleme oranları da parametrik çalışmalar süresince değerlendirilmiştir. Bu çalışmalara ilave olarak, depolama stabilitesi, optimum sıcaklık ve pH etkileri de incelenmiştir. Immobilizasyon çalışmaları süresince pirinç kabuğu külü, yüzey modifikasyonlu kül ve immobilize enzim karakterizasyonu için fourier dünüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR), termal gravimetrik analiz (TGA) ve tarayıcı elektron mikroskopisi (SEM) kullanılmıştır. Mevcut çalışmanın ikinci aşamasında, çapraz bağ metodu ile pirinç kabuğu külü yüzeyinde immobilize edilen enzimin performansı polykaprolakton sentezi üzerinde değerlendirilmiştir. En iyi reaksiyon parametrelerinin belirlenmesi için ɛ-kaprolakton polimerizasyon reaksiyonları farklı süreçlerde (6, 24, 48, 72 ve 120 saat) ve farklı sıcaklıklarda (30, 40, 60 ve 80 0C) uygulanmıştır. Ayrıca Enzim konsantrasyonunun polimerizasyon üzerindeki etkisi farklı enzim : monomer konsantrasyonlarında incelenmiştir. Polimerizasyon işlemi Lipozyme® ve Novozyme 435 ile belirlenen reaksiyon parametrelerinde uygulanarak elde edilen sonuçlar yeni enzimin sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Çalışma boyunca en iyi reaksiyon koşullarında elde edilen ürünlerin moleküler ağırlık dağılımları ve yapısal tanımlamaları jel permeasyon kromatografisi (GPC) ve FT-IR spektroskopisi kullanılarak analiz edilmiştir. Polimer örneklerinin kristal yapıları Proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (1H-NMR) ve X-ışını kırılması (XRD) aracılığı ile tayin edilmiştir. Ayrıca, polimer örneklerinin termal analizleri TGA ve differansiyel tarama kalorimetresi aracılığı ile elde edilmiştir. Polimer ürünlerinin yüzey yapıları SEM aracılığı ile incelenmiştir. Bu çalışma boyunca elde edilen sonuçlara göre ppirinç kabuğu külü yüzeyinde yapılan modifikasyonlar ve enzim immobilizasyonu FT-IR ve TGA anazlileri aracılığı ile doğrulanmıştır. Serbest enzyme kıyasla, immobilize enzim %73,1 relatif aktivite ve %98 protein yükleme verimliliği göstermiştir. Spesifik aktivite serbet enzyme göre %74 oranında korunmuştur. Depolama stabilite çalışmalarının ( 3 ay) sonucunda, immobilize enzim aktivitesinin %67'sini korunduğu gözlemlenmiştir. Termostabilite çalışmaları kapsamında elde edilen sonuçlara göre, enzim relative aktivitesinde 80 0C 'ye kadar düşüş gözlemlenmemesi enzimin termofilik özellik kazandığını işaret etmektedir. En iyi reaksiyon koşullarında elde edilmiş polimer zincirlerinin karakterizasyonu FT-IR ve 1H-NMR analizleri ile doğrulanmıştır. GPC analiz sonuçlarına göre 60 0C ve 24 saat polimerizasyon süreci sonunda elde edilen ürünlerin moleküler kütlesi 13700 g/mol olarak kaydedilmiştir. Polidispersite indeksi (PDI) ve monomer çevirimi sırwası ile 1,5 PDI ve %92 olarak saptanmıştır. Bu sonuçlara göre yeni tasarlanan immobilize enzim serbest enzime göre daha yüksek stabilite değerlerine ulaşmıştır.